Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.

Abstract

أساليب المناعي (المدينة) لتحليل التعبير البروتين بالفحص المجهري الخفيفة في الموقع أداة قوية للبحث وأغراض التشخيص. ومع ذلك، التصور والتقدير الكمي لمولدات المضادات المتعددة في مقطع واحد من أنسجة استخدام المدينة اللونية التقليدية يمثل تحديا. التصوير متعدد مهم خصوصا في أبحاث سرطان الغدد الليمفاوية، والتشخيص، حيث علامات يجب أن تفسر في سياق معقدة وورم المكروية. هنا يصف لنا وضع بروتوكول للمدينة الفلورسنت متعدد تلطيخ لتمكين التقييم الكمي لأهداف متعددة في خلية معينة أنواع المصالح في الأورام اللمفاوية. الأسلوب الذي يغطي جوانب من التحقق من صحة جسم، والأجسام المضادة الأمثل، الأمثل متعدد مع علامات لمفوما الأنواع الفرعية، تلطيخ الأنسجة الشرائح ميكرواري (تي أم أية)، ومسح الشرائح، متبوعاً بتحليل البيانات، مع محدد إشارة إلى سرطان الغدد الليمفاوية. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إنشاء عشرات لكل شدة يعني علامة على الاهتمام والإيجابية النسبة المئوية تيسير المزيد من التحليل الكمي. الإرسال المتعدد يقلل استخدام العينة، ويوفر المعلومات المكانية لكل علامة للفائدة.

Introduction

الأورام اللمفاوية بسبب انتشار الخلايا الليمفاوية الخبيثة غير المنضبط. هذه الخلايا هي عناصر حيوية في الجهاز المناعي، وتعريب لأجهزة المناعة الأولية والثانوية، مثل نخاع العظام والعقد الليمفاوية والطحال ونظام اللمفاوية الأخرى المرتبطة بالغشاء المخاطي. الأورام اللمفاوية هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات التي تصنف استناداً إلى كوكبة من الميزات، بما في ذلك مورفولوجيا، إيمونوفينوتيبي، والسمات الوراثية، والعرض التقديمي السريرية. بينما يلعب كل معلمة جزء، النسب ما زالت سمة المميزة ويشكل الأساس لنظام تصنيف منظمة الصحة العالمية التي تعترف بالأورام المستمدة من الخلايا ب وخلايا T القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) الخلايا1.

وكان مفتاح للتصنيف للأورام اللمفاوية توصيف الأجسام المضادة ضد علامات سطح الكريات البيض من الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليمفاوية2. إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) قد استخدم تقليديا لتحليل مثل هذه العلامات، ويستند إلى مبدأ الاعتراف ضد مستضد محدد للكشف عن الجزيئات المستندة إلى الخلايا والأنسجة التي يمكن تصور من خلال المجهر الخفيفة 3. بيد أن تحديد أهداف متعددة على شريحة واحدة من التقليدية مشرق حقل المدينة متعدد اللونية بقيود لأنه غالباً ما يصعب التمييز بين إشارات متعددة الألوان على مقطع نسيج واحد موثوق بها، لا سيما لمولدات المضادات مع تعبير منخفضة جداً4. التقييم البصري والتحديد الكمي لتلطيخ أيضا يمكن أن تكون ذاتية، تسبب تقلب في تفسير البيانات وتحليل5.

ولذلك، المدينة التقليدية على عينات (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين ليس عمليا للكشف عن واحد من أهداف متعددة في أمراض متنوعة مناعي مثل الأورام اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، التمييز بين الخلايا الليمفاوية الورمية من الخلايا المناعية المحيطة غالباً غير دقيقة. وهذا يعوق دراسات تبحث في أهمية المؤشرات الحيوية الرواية في الأورام اللمفاوية. وفي هذا السياق، يقدم المدينة الفلورسنت متعدد (وسط-المدينة) بديلاً واعداً كما أنها تتيح التقييم الكمي مستضد كوكسبريشن وعلاقة مكانية بدقة أعلى مع المحافظة على محدودية العينات6،7- عندما هذا تكنولوجيا التصوير هو في شراكة مع برنامج تحليل الصور الرقمية، تفسير البيانات أكثر كفاءة ويسهل دراسة الأورام والمكرويه التغايرية8،9. في هذا البروتوكول، أساس تيراميدي الفلورة (إذا كان) الإرسال المتعدد الأسلوب يتم تطبيقه على تضخيم الإشارات وهو متوافق مع أي جسم التحقق من صحة المدينة من أي الأنواع المضيفة، حتى تلك التي وضعت في نفس الأنواع5،7 , 10-يسمح البروتوكول على أساس تيراميدي لتصريف fluorophore لانسجة الاهتمام المباشر بحيث يمكن تجريده جسم الابتدائي والثانوي بعد كل خطوة، يسمح بتطبيق متسلسلة من البقع متعددة دون جسم ه.

استراتيجية متعدد ستكون مفيدة للتنبؤ بنتائج التشخيص والعلاج عن طريق تحديد الأهداف وأنماطها المناعية البديل في الأورام الليمفاوية. متعدد الفلورسنت المدينة قد طبقت في لدينا مختبر لدراسة فريق من علامات مساعد تي الحبيبي في أنجيويمونوبلاستيك تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية (أيتل)، وعلامات تي وب اللمفاويات نوع فرعي الأورام اللمفاوية تي خلية الطرفية تتسم بالعدوانية السريرية السلوك والورم التغايرية11. ويتضح مدى فائدة هذا الأسلوب أيضا اللمفاوية ب-الخلايا الكبيرة منتشر (DLBCL)، مما يشير إلى زيادة في مستقبل خلايا ب مع التعبير المتزامن ج-حركة و BCL-2 تقترح فيها استخدام العلاجية المحتملة تيروزين كيناز تثبيط لبروتون 12 .

هنا يمكننا وصف بروتوكول كامل من التحقق من صحة جسم اختيار عنصر التحكم المناسب الأنسجة ومضاعفة استخدام لمفوما FFPE الآلي الأنسجة، مع تحليل في نهاية المطاف للشرائح ملطخة باستخدام المسح التصوير الكمي في علم الأمراض النظام.

Protocol

وتم الحصول على جميع الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول قيد "سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب" دراسة 2014/00693.

1-التحديد والتحقق من صحة من الأجسام المضادة

ملاحظة: قبل الشروع في إنشاء أي فريق متعدد، تأكد من أن جميع الأجسام المضادة وصمة قوة، تحديد فقط مستضد الهدف من الفائدة. ويهدف إلى تحديد الأجسام المضادة التي تعترف على وجه التحديد مستضد الاهتمام بأقسام الأنسجة.

  1. لجسم مع استخدام البحوث الراسخة، أو الاستخدام السريري الروتيني في المدينة، تأكيد الشروط مثل تمييع استرجاعها وجسم حانمه بأداء5،المدينة التقليدية13 في الأنسجة التحكم الإيجابي والسلبي الأقسام. لأقسام الأنسجة البشرية المنشأ، التأكد من وجود الموافقات الأخلاقيات المناسبة في المكان قبل بدء التجارب.
    ملاحظة: عناصر إيجابية هي الأنسجة التي من المتوقع أن نعرب عن antigen للفائدة، وضوابط السلبية هي تلك التي لم تفعل ذلك. يتم اختيار الأنسجة لوزة حميدة كعنصر تحكم أنسجة جيد للأورام اللمفاوية المستضدات لأنها تحتوي على خليط من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا ب، وخلايا T، وعرض مستضد الخلايا، فضلا عن الخلايا الظهارية واللحمية. هذا الأخير بمثابة الضوابط الداخلية السلبية مفيدة.
  2. لأهداف غير معروفة أو الأجسام المضادة التجارية مع عدم كفاية البيانات المنشورة، إجراء التحقق من صحة جسم عن طريق إنشاء الإيجابية المتطابقة وكتل التحكم السلبية FFPE خلية14، استخدام كريسبر المغلوب أو siRNA تدق إلى أسفل للمستضد للفائدة في خط خلية مناسبة من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية. استخدام كتل هذه الخلية FFPE بدلاً من الأنسجة السيطرة الإيجابية والسلبية للمدينة التقليدية وفقا للخطوة 1، 1.
    ملاحظة: تستخدم خلايا هيلا أو 293T عادة لمولدات المضادات التي ليست من نوع الخلية المحددة، كما يصعب خطوط الخلايا اللمفاوية من ترانسفيكت. لمولدات المضادات التي هي اللمفاويات محددة، يمكن استخدام خطوط الخلايا اللمفاوية مع توصيل الفيروسية أو انهانسر كطريقة لإيصال الجينات (أن كان ذلك بكفاءة منخفضة).

2-تخطيط التسلسل من الأجسام المضادة وفلوروفوريس للفريق متعدد

  1. خطة تسلسل المواد الكاشفة لتلطيخ متعدد النهائي. على سبيل المثال، هنا تسلسل لبروتوكول متعدد كان مقرراً، أولاً، Bcl-6؛ وثانيا، Bcl-2؛ وثالثاً، ج-حركة؛ الرابعة، CD20؛ خامسا، Ki67.
    ملاحظة: لاتخاذ قرار بشأن التسلسل، الأجسام المضادة مع تقارب ضعف تتطلب تركيزات أعلى ينبغي أن تكون الملون أولاً في تلطيخ متعدد النهائي. وتطبق عالية تقارب الأجسام المضادة التي من المحتمل أن تكون مقاومة لجولات متعددة من تجريد الميكروويف آخر في بروتوكول متعدد لتجنب تلطيخ غير محدد.
  2. خطة الشريك فلوروفوري لكل جسم في الفريق. انظر الجدول 1 و الجدول للمواد للاختيارات الموجودة في هذا المثال.
    ملاحظة: أن تقرر على الشريك فلوروفوري لكل جسم، اختر fluorophores طيفيا متميزة للأجسام المضادة مع أنماط مشابهة للتعريب داخل الخلية والأنسجة. سيؤدي ذلك إلى تقليل التداخل الطيفي وصعوبة مع اتقانا.

3-أساس تيراميدي مونوبليكس إذا كان في فريق متعدد محاكاة 5-من نوع plex

ملاحظة: في هذا المثال، بروتوكول CD20 تناقش، من المزمع كجسم الرابعة في تسلسل متعدد الموصوفة أعلاه. سوف يختلف عدد خطوات تجريد إضافية لموقف الجسم في التسلسل.

  1. قطع المقاطع 3 ميكرون رقيقة الأنسجة السيطرة الإيجابية والسلبية باستخدام مبضع ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية مجهر بولي-L-يسين-المغلفة.
  2. دو المقاطع استخدام حل مقاصة مناسبة 3 x ل 4 دقيقة. ترطيب الشرائح في الكحول 100% والكحول 90% والكحول 70%، 4 دقيقة. وضع الشرائح في الماء المقطر لمدة 2-3 دقائق.
  3. وضع الشرائح في وعاء زجاجي الميكروويف آمنة في المخزن مؤقت استرجاع مستضد قياسية (متاح تجارياً) أن تزج الشرائح. إجراء استرداد حانمه الناجمة عن الحرارة (هير) باستخدام ميكروويف مناسبة، في حل استرجاع مستضد pH9 عند 98 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي الموجات ذات ضغط تتراوح ما بين 800-1,100 وات، ويمكن أن يكون الأمثل هير تبعاً لذلك. في هذه الحالة، استخدم معالج أنسجة متعددة الوظائف تعمل بالموجات الدقيقة (مفتوحة للهواء) هير وتجريد. الإعدادات الأولية لاسترجاع حانمه خاصة تستند إلى المعرفة المسبقة من المدينة التقليدية.
  4. إجراء جولات إضافية من تجريد الميكروويف (الثلاثة في هذه القضية، لجسم الرابعة في لوحة)، وكل جولة بقوة 100% إلى 98 درجة مئوية و 20% طاقة لمدة 10 دقيقة الحفاظ على نفس درجة الحرارة. أن تهدئة الشرائح في الماء المقطر لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: إجراء عدة جولات من تجريد الميكروويف أثناء الخطوة إذا مونوبليكس للكشف عن مستضد المستهدفة لنفس العدد من تدفئة الخطوات كما هو الحال في متعدد المقترحة. حيث من المقرر CD20 كجسم الرابعة، الميكروويف تجريد x 3 قبل ومرة واحدة بعد القيام في الحضانة جسم الأولية.
  5. فحص وتجديد المخزن المؤقت بعد كل 5 دقائق خلال تجريد إضافية تعمل بالموجات الدقيقة. الأهم من ذلك، لا تدع الشرائح تجف خلال إجراءات تجريد متعددة. عندما أخذ الشرائح من الموجات الدقيقة، استخدام الملقط والقفازات المقاومة للحرارة لوضعها في جرة منفصلة من الماء المقطر. انتظر حل استرجاع مستضد بارد بطبيعة الحال.
  6. حظر نشاط البيروكسيديز الأنسجة باستخدام كتلة تجارية البيروكسيديز لمدة 10 دقائق (يمكن استخدام بيروكسيد الهيدروجين 3% ككاشف بديل). المياه والصرف الصحي مع تريس مخزنة المالحة (تبس) ومنظفات النطاق لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: TBS تتألف من 50 تريس Cl، ودرجة الحموضة 7.5، و 150 ملم NaCl.TBS جعل تبس-د
  7. كتلة مع جسم مخفف أو ألبومين المصل البقري لمدة 15 دقيقة تليها الحضانة مع جسم الأولية للفائدة (مثلاً، CD20، إضعاف 1:2,000 في جسم مخفف، انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة يغسل x 3 مع د تبس المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق في كل مرة. ينبغي أن يكون هناك العازلة د تبس يكفي أن تزج الشريحة تماما في جميع خطوات الغسيل.
    ملاحظة: يمكن استخدام ألبومين المصل البقري كجسم بديل مادة. حجم جسم مخفف يعتمد على حجم الأنسجة، تتراوح بين 50 ميليلتر (لعينات خزعة) 400 ميليلتر (لعينات الختان أو عينات الأنسجة ميكرواري).
  8. احتضان مع مناسبة الفجل البيروكسيديز (HRP)-صنف على أنه جسم الثانوية، اختيرت على أساس الأنواع الأصلية لجسم الابتدائي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أغسل x 3 مع د تبس المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  9. تطبيق مناسبة المستندة إلى تيراميدي نيون كاشف (1/100 في مادة التضخيم) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، للسماح بتصريف فلوروفوري إلى عينة الأنسجة في المواقع الربط جسم الأولية. أغسل x 3 مع د تبس المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  10. تنفيذ إضافية المستندة إلى الموجات الدقيقة تجريد لإزالة جسم الابتدائي والثانوي. كرر حسب الاقتضاء استناداً إلى موضع الجسم في التسلسل.
  11. ضع الشريحة في الماء المقطر لتبرد. احتضان مع DAPI (تخفيف 1: 100 في جسم مخفف) عن 10 دقيقة، تليها غسل x 3 مع د تبس المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق في كل مرة. الجاف للمنطقة على الشريحة دون الأنسجة مع مناديل وجبل الشريحة مع تصاعد المناسبة وسائل الإعلام.
  12. صورة الشريحة (انظر المادتين 6 و 7 من هذا البروتوكول) وتحديد مدى ملاءمة تلطيخ (كما هو محدد بتمييز واضح من الأنسجة السيطرة الإيجابية والسلبية).
    ملاحظة: إذا كان نمط المصبوغة غير صحيحة، إعادة مونوبليكس تلطيخ بعد تعديل واحد أو أكثر من المعلمات التالية: الخطوات عدد استرجاع الحرارة، مقدار استرجاع الحرارة، والفترة الحضانة/تركيز الأجسام المضادة (الابتدائي و الثانوي)، وضع جسم في التسلسل، واختيار فلوروفوري. مونوبليكس تلطيخ خطوة عادة ما يتطلب عدة جولات من الأمثل للحصول على مجموعة مناسبة من المعلمات لتلطيخ المناسبة. فمن المستحسن لاختبار مجموعة من فلوروفوريس مع كل جسم الأولية، وهذا سيوفر المرونة في تحديد مجموعة متعدد النهائي.

4-تكرار مونوبليكس لكل جسم في بروتوكول متعدد

  1. كرر مونوبليكس تلطيخ للأجسام المضادة الأخرى بطريقة مشابهة عن طريق ضبط عدد الموجات تجريد الخطوات، استناداً إلى موضع الجسم في التسلسل. على سبيل المثال، عند تنفيذ مونوبليكس تلطيخ لجسم ثالث في فريق متعدد ستة-من نوع plex، إجراء خطوتين تجريد الميكروويف قبل وثلاث خطوات تجريد الميكروويف بعد الاحتضان الابتدائي جسم.
    ملاحظة: من المهم أن نقدر أن التجريد القائم على الموجات الدقيقة من الأجسام المضادة كما يعرض العينة هير. إذا كان جسم معين يتطلب استراتيجية استرجاع حانمه مختلفة، هذا يحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند التخطيط لتسلسل متعدد. في هذا المثال، يتطلب استرجاع حانمه Ki67 الأس الهيدروجيني 9، لمدة 30 دقيقة. منذ 25 دقيقة من هنا وسوف يتم قبل تلطيخ KI67 في بروتوكول متسلسلة، وإلا مين 5 إضافي من هير مطلوبة.

5-متعدد تلطيخ البروتوكول

ملاحظة: المضي قدما مع متعدد تلطيخ البروتوكول إلا بعد وقد تم تحسين كافة المكونات باستخدام مونوبليكس إذا تلطيخ. استعراض النتائج من تلطيخ مونوبليكس وتصميم جدول يبين التخطيط النهائي وسام متعدد واختيار فلوروفوري لكل جسم. تفاصيل تركيز الأجسام المضادة، مدة تلطيخ، والتسلسل وطبيعة استرجاع الحرارة لكل جسم المستخدمة هنا يرد في الجدول 1.

  1. قص 3 أقسام ميكرون رقيقة من الأنسجة السيطرة الإيجابية والسلبية، وكذلك الأنسجة المستهدفة للفائدة (هنا، فب عينات من الأورام اللمفاوية)، باستخدام مبضع، ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية مجهر بولي-L-يسين-المغلفة (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: إدراج عناصر إيجابية وسلبية لكل جسم في الفريق من المستحسن، جنبا إلى جنب مع العينات الفعلية لمتعدد. وهذا يسمح لتأكيد أن البروتوكول المصبوغة أنجز بشكل صحيح.
  2. دو والقيام باسترجاع الحرارة المستحثة حانمه (هير) وكتلة الأنسجة البيروكسيديز النشاط كما هو الحال في الخطوات بروتوكول مونوبليكس 3.3-3.5.
  3. احتضان مع جسم الأولية الأولى في التسلسل متعدد الأمثل، كما سبق أن قرر استخدام الخطوة إذا مونوبليكس. في هذا المثال، BCL-6، في 01:30 تمييع في جسم مادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة (انظر الجدول للمواد)، كانت الخطوة الأولى من بروتوكول متعدد. يغسل مع TBS-د المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق.
  4. احتضان بمناسبة المسمى HRP ثانوية جسم مضاد استناداً إلى هذه الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في السابق خطوة (انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة أغسل مع TBS-د المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق.
  5. تطبيق الأمثل القائم على تيراميدي نيون الكاشف (Cy5 في هذا المثال، 1: 100 في التضخيم مخفف، انظر الجدول للمواد) مع حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد الاحتضان، يغسل مع TBS-د المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يستند اختيار الكاشف الفلورسنت المستندة إلى تيراميدي على مونوبليكس الأمثل إذا.
  6. التحقق من كفاءة تلطيخ من جسم أول استخدام مجهر مناسبة (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: يمكن أن يتم المؤقتة التصوير الشيكات بسهولة إذا كانت العينة الشفافة أو شريحة واحدة. إذا، ومع ذلك، يتم تنفيذ وصمة عار على شرائح متعددة، وهذا قد يكون غير عملي، وقد أغفلت هذه الخطوة.
  7. إجراء تجريد الموجات الدقيقة لجسم الثاني في البروتوكول، واستخدام الظروف الأمثل في الخطوة مونوبليكس. ثم المضي قدما في تلطيخ جسم الابتدائية الثانية (هنا، BCL2) مع الجسم المضاد الثانوي المسمى برنامج الصحة الإنجابية وكاشف فلوري المستندة إلى تيراميدي (هنا، 520، انظر الجدول للمواد). التحقق من كفاءة تلطيخ تحت مجهر فلوري وبعد انتهاء الجولة الثانية لتلطيخ.
  8. وبالمثل، كرر الإجراء الثالث، باستخدام الأجسام المضادة الرابع والخامس في التسلسل (هنا، ج-حركة و CD20 و ki67، على التوالي، مع فلوروفوريس 540 570 و 620، على التوالي). إجراء تدقيقات التصوير ما بين كل خطوة إذا كان ذلك ممكناً.
  9. إضافة كونتيرستين نووية (DAPI، وتمييع 1: 100 في جسم مادة) لمدة 10 دقائق، ويغسل ثم، 2 x في تبس-د لمدة 5 دقائق.
  10. جبل الشرائح باستخدام كاشف تصاعد مناسبة.

6-إعداد مكتبة طيفية الشرائح

ملاحظة: الأقسام 6-8 من هذا البروتوكول فريدة من نوعها لمتعدد من التجارب التي يتم تصويرها باستخدام كاميرا طيفية.

  1. قم بإنشاء مكتبة الشرائح (الصور مرجع واحد-وصمة عار) لكل فلوروفوري و DAPI وأوتوفلوريسسينسي على أنسجة عنصر التحكم نفسه، لاستخدامها لتحليل الصور المتعددة الأطياف.
    1. قطع المقاطع رقيقة ميكرومتر 2 × 3 من نوع الأنسجة للفائدة (هنا، عينة اللمفاوية أو لوزة كعنصر تحكم) باستخدام مبضع ووضع المقاطع على الشرائح الزجاجية مجهر بولي-L-يسين-المغلفة.
    2. عملية كل الشرائح باستخدام بروتوكول مونوبليكس (مع كل تجريد والغسيل الخطوات)، ولكن دون إضافة جسم أو فلوروفوري.
    3. شريحة واحدة مع DAPI حسب الخطوة 5.9 وإجازة واحد أونستاينيد (لتوليد الطيف أوتوفلوريسسينسي الأنسجة) وصمة عار.
      ملاحظة: يمكن استخدام الشرائح مونوبليكس الأمثل (مع صبغة صف واحد، دون DAPI) كمكتبة طيفية الشرائح لتوليد الأطياف من كل صبغة الأسفار.
  2. تفحص هذه المجموعة من الشرائح باستخدام عوامل التصفية المناسبة وتحميلها إلى مكتبة تحليل الصور.

7. التصوير الطيفي

  1. مسح الشرائح مونوبليكس
    1. اختر عوامل التصفية من المرشحات القياسية المتوفرة برنامج التحصين الموسع-الأسفار (DAPI، فيتك، CY3، تكساس الأحمر و CY5) المناسبة ل fluorophore العاملين لحسابهم.
      ملاحظة: يبين الجدول 215مكعبات تصفية الموصى بها ل fluorophores المحددة المستخدمة في هذا المثال.
    2. فحص كل علامة في قناتها fluorescence المقابلة لتحديد وقت تعرض مناسبة للحصول على إشارة نظيفة. التركيز على عنصر الأنسجة التي من المفترض أن يكون أقوى إشارة للعلامة.
    3. تحديد وقت تعرض ثابتة لكل أكثر (تركيبة جسم-fluorophore)، تسمح بإجراء المقارنات عبر عينة من كثافة بكسل (على الرغم من أن بعض المنشآت التجارية لديها استراتيجيات التطبيع لمراعاة الاختلافات في التعرض).
      1. لاتخاذ قرار بشأن وقت تعرض ثابتة لقناة معينة، استخدام إعداد كاميرا حية لضبط وقت التعرض حتى هناك لا توجد مناطق زائدة في صورة كاميرا حية، وكرر هذه العملية لكل القنوات.
    4. بعد مسح الشرائح مونوبليكس، توليد الصور برايتفيلد المحاكاة (إذا الدالة غير متوفرة في البرمجيات المستخدمة) بصريا مقارنة مع نمط المدينة العادية وتحديد ما إذا كان نمط المصبوغةالصحيح (الشكل 1 والشكل 2 ).
  2. مسح العينات متعدد (الشرائح الشفافة/عينات متعددة)
    1. قم بإعداد المعلمات البصرية كما هو موضح لمسح الصور مونوبليكس (الخطوة 6، 1). أولاً، ضبط التركيز يدوياً أو تلقائياً (اتبع تعليمات الصورة المحددة تفحص الجهاز). ثانيا، قم بضبط وقت التعرض لكل قناة فلوري التأكد من أن جميع النوى في الجمعية التونسية للأمهات، أو جميع المناطق على شريحة، معرضون على نحو ملائم.
      ملاحظة: المنطقة المحددة لضبط وقت التعرض مهم. المستخدمين بحاجة إلى اختيار منطقة إشارة أقوى لكل عامل تصفية (أيإشارة Ki67 أقوى في منطقة مركز جيرمنال لوزة من منطقة مركز نونجيرمينال؛ ومن ثم، يجب على المستخدمين استخدام منطقة مركز جيرمنال على تعرض مناسب الوقت). يمكن اعتماد المستخدمين أيضا وظيفة تصحيح أوفيرساتوريشن نظام التصوير إذا كانت متوفرة.
    2. مسح الشرائح الشفافة تحت وضع مسح الجمعية التونسية للأمهات إذا كان متوفراً في نظام التصوير، مع خوارزمية ضبط تلقائي للصورة مناسبة.
    3. لقسم الأنسجة كل الشرائح، الحصول على الشرائح استعرضها أخصائي مؤهل لتحديد الصور الأمثل من مناطق الورم الأكثر تمثيلاً.
      ملاحظة: البروتوكول الموصوفة هنا على أساس نظام تحليل مجهر/صورة محددة (انظر الجدول للمواد). وهناك برنامج تحليل الصور التي يمكن مسح وتحليل متعدد الشرائح المدينة7وآلات أخرى.

8-بيانات التحليل

  1. التخطيط والتقييم برياناليسيس
    1. استخدام الشريحة إشارة أوتوفلوريسسينسي طرح أوتوفلوريسسينسي من الصور الممسوحة ضوئياً للتحليل.
    2. استعراض الصور قبل التحليل التأكد من أنها في التركيز ودون تلطيخ التحف.
    3. استخدام علامة ورم (مثلاً، CD20 في هذا المثال) لتحديد خلايا فائدة والمضي قدما في تقسيم الخلية والتهديف، وتحليل دفعي النهج. حدد الخلايا CD20 إيجابي للتحليل.
      ملاحظة: على سبيل المثال، في دلبكل تحليل عينات هنا، بالإعداد والمعلمات التي تم تعريفها لتقسيم الخلية تعتمد على حجم النووية وكثافة، بل محددة لبرنامج تحليل الصورة المستخدمة (مثلاً، DAPI يعني كثافة بكسل في أقل من 0.05؛ حجم ما بين 80-320 بكسل، مع تقسيم حساسية في 2 [هذا هو معلمة خاصة بالبرامج التي تعتمد اعتماداً كبيرا على مورفولوجيا الورم: للخلايا السرطانية الصغيرة، تقسيم من 0.7-1 مناسبة؛ للخلايا السرطانية كبيرة، تقسيم يمكن تعديلها حتى 4]).
    4. طلب الطبيب المؤهل لاستعراض الصور الفردية وتقرر ما إذا كان تقسيم الأنسجة المطلوبة تحديد مناطق أثري خلية الورم واستبعاد المناطق مع نخر أريريجيون orand وفرة الخلايا رد الفعل. إذا كان مطلوباً تجزئة النسيج إضافية، ثم حدد مناطق المراقبة الملائمة (مثل ورم الخلايا/ستروما/نخر) والتحقق من أن البرنامج تحليل الصورة بشكل صحيح يمكن تحديد هذه المناطق
    5. المضي قدما في تقسيم الخلية بعد تقسيم الأنسجة (أن وجدت)، طلب أخصائي مؤهل لمراجعة خريطة تقسيم الخلية لضمان دقة تجزئة المقصود نهج5.
    6. تحديد أهم بيولوجيا/سريرياً الأسلوب المناسب لتحليل للعلامات البيولوجية معين من الفائدة (مثلالنسبة المئوية الإيجابية أو كثافة يعني كل خلية).
    7. حدد قيمة وقف لكل علامة (بالنسبة المئوية الإيجابية).
    8. تحديد قيمة الكثافة البصرية الإيجابية وقف إنتاج المواد الانشطارية لكل علامة بالاقتران مع أخصائي. إنشاء رسوم بيانية بتحليل توزيع التردد الكثافة العلامة/خلية في البرامج الإحصائية المناسبة (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: الرسم بياني قيمة كثافة يمكن أن تقدم لمحة عامة عن توزيع كثافة إشارة.
    9. تحديد تقريبي وقف إنتاج المواد الانشطارية من الرسم البياني، والتحقق من ذلك مع استعراض الطبيب الشرعي، ترتبط بانقطاع يدوياً مصممة على الصور المحددة. وفي بعض الحالات، وقف واحد موحد لن يكون ممكناً بسبب تقلب في تلطيخ، وسيلزم قيمة إنتاج دليل لكل عينة.
      ملاحظة: ينبغي أن يتم القسم 8.1 في برمجيات تحليل الصورة (انظر الجدول للمواد)، ما لم يحدد خلاف ذلك.
  2. تمييز الخلايا الإيجابية والسلبية
    1. لكل علامة من الفائدة، وفقا لعدد قطع مصممة (من خلال رسوم بيانية أو يدوياً)، استخدام "IF" أو صيغة منطق مماثل لوضع علامة إيجابية وسلبية الخلايا مع وضع علامة القيمة: رقم 1 للخلايا إيجابية، رقم 0 للخلايا السلبية.
    2. للايجابية لجميع العلامات، اضرب قيمة ملحوظة لكل علامة (0 أو 1) مع المنتجات في أعمدة منفصلة. إذا المنتج يساوي 1، فهذا يعني أن الخلية إيجابية بالنسبة لكافة علامات. الإيجابية والسلبية لعلامة معينة، استخدام خوارزمية منطق إذا.
      ملاحظة: 8.2 القسم يحتاج إلى القيام به في برنامج الإحصاءات (انظر الجدول للمواد).
  3. توليد البيانات النسبة المئوية وبيانات رقمية باستخدام جدول محوري
    1. توليد البيانات النسبة المئوية لعلامات محددة من الفائدة، داخل خلايا محددة (مثلاً، CD20-إيجابية الخلايا أو الخلايا السلبية CD20) (الشكل 6).
    2. إدراج جدول محوري في ورقة البيانات.
    3. لحساب النسبة المئوية الإيجابية لعلامة واحدة، مثل CD20، حدد الدالة SUM تحت الجزء قيمة من الجدول المحوري لحساب إجمالي عدد الخلايا CD20 إيجابي باستخدام مجموع CD20+ الخلايا مقسوماً عدد مجموع الخلايا. والنتيجة هي CD20+ الخلية النسبة المئوية داخل نواة واحدة أو عدد دراسة واحدة (يعتمد على اختيار صف الجدول المحوري).
    4. لحساب النسبة المئوية الإيجابية من علامات متعددة باستخدام نفس الأسلوب (الشكل 3).
    5. توليد البيانات الرقمية. استخراج العد تطبيع متوسط لكل علامة لكل نواة أو كل رقم الدراسة عن طريق الحصول على متوسط كثافة كل علامة لمصلحة جميع الخانات التي درست في عينة (الشكل 4).
      ملاحظة: القيمة الوسطية لا يمكن اشتقاق في الجدول المحوري مباشرة. يمكن الحصول عليها باستخدام هذه الصيغة: متوسط (إذا كان (عمود رقم الدراسة = عدد دراسة محددة، عمود للقيمة التي تم تسويتها)).
  4. رسم البيانات في رسم بياني مناسب
    1. ارسم النتائج الإيجابية النسبة المئوية أو متوسط كثافة كل علامة في خلية نوع من الفائدة بطريقة مناسبة لإجراء مزيد من الاختبارات الإحصائية والعرض التقديمي.
    2. إنشاء قطع دوت تقديم تصور لإعداد وتوزيع.
      ملاحظة: تمثل البيانات مع شريط الرسوم البيانية لا تنقل معلومات عن التوزيع. كما يوصي بقطع تقدير كوسيلة جيدة لتمثيل البيانات، مع التركيز على حجم الاختلاف بين العينات16.

النتائج

صور وسط المدينة عينة DLBCL مع ج-حركة وإعادة ترتيب الجينات BCL2 (مزدوج--ضرب سرطان الغدد الليمفاوية) يرد في الشكل 1. ويبين الشكل 2 الصور محاكاة مشرق الميدان المناعي. يشير الرقم 3 إلى توليد بيانات النسبة المئوية. يعرض الرق...

Discussion

وسط المدينة لديه القدرة على تمكين أخصائيي علم الأمراض لصقل دياجنوستيككريتيريا في علم الأمراض اللمفاوية وتحليل دور المؤشرات الحيوية في أنواع الخلايا المحددة تجاه تنبؤ بالنتائج السريرية. كأسلوب جديد في بحث، يتم تطبيق وسط المدينة متزايدة إلى تحديد الكمية والمكانية لمعلمات متعددة محصنة من...

Disclosures

A.D.J. تلقت تمويلاً من بيركينيلمير اتجاه السفر لحضور اجتماعات مجموعة المستخدم. المؤلفون أي مصلحة أخرى الصراع للكشف عن.

Acknowledgements

س-ب. ن. و A.D.J. معتمدة من قبل وزارة الصحة في "سنغافورة الوطنية الطبية المجلس الانتقال الجوائز البحثية" (نمرك/تا/0020/2013 ونمرك/تا/0052/2016). يعترف الكتاب "منحة بحثية يون سيو يونغ" إلى A.D.J. من "جامعة سرطان معهد سنغافورة الوطنية" نحو شراء مجهر التصوير الطيفي فكترا. وافقت هذه الدراسة "سنغافورة NHG المجال محددة استعراض المجلس ب" (2014/00693).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody diluentDAKOREF S3022Blocking
Peroxidase Blocking SolutionDAKOS2023For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscopePerkin ElmerVectra2.0.8Spectral imaging
absolute EthanolEMSURE1.00983.2500Ethyl alcohol for rehydration
Amplification DiluentPERKIN ELMERFP1135Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-LabeledPERKIN ELMERNEF822001EASecondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-LabeledPERKIN ELMERNEF812001EASecondary antibody
BCL2DAKOclone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)primary antibody
BCL6LEICANCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)primary antibody
CD20DAKOClone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)primary antibody
c-MYCABCAMY 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)primary antibody
Cy 5PERKIN ELMERFP1171Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7Graph padStatisitcal software
HistoClear Clearing AgentSIGMAH2779-1LHistoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software		Perkin ElmerInform Software 2.2.1Data Analysis software
KI67DAKOClone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processorMilestoneMicrowave for Heat induced epitope retrieval
MicrowavePANASONICNN-ST651MMicrowave stripping
MowiolSIGMA ALDRICH81381 Aldrich Mowiol® 4-88mounting media
Opal 570PERKIN ELMERFP1488Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520PERKIN ELMERFP1487B21Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540PERKIN ELMERFP1494Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620PERKIN ELMERFP1495Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slideFISHER SCIENTIFIC120-550-15Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPIPERKIN ELMERFP1490nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)DAKOS2367For HIER
Tris Buffer saline (TBS)1st BASEBUF3030 20X4Lfor buffer wash
Tween 20SIGMA ALDRICHP1379-1LTween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User's Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 Multiplexed

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved