מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

Summary

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

Abstract

Immunohistochemical (IHC) שיטות לניתוח מקומיים של ביטוי חלבונים על ידי מיקרוסקופ אור הן כלי רב עוצמה עבור המחקר והן למטרות אבחון. עם זאת, ויזואליזציה של כימות של אנטיגנים מרובים במקטע בודד רקמות באמצעות IHC הדפסות כסף קונבנציונלי הוא מאתגר. הדמיה מרובבת רלוונטי במיוחד לימפומה מחקר, אבחון, שבו סמני צריך לפרש בהקשר של microenvironment הגידול מורכב. כאן נתאר פרוטוקול עבור מרובבת IHC פלורסנט מכתים כדי לאפשר את הערכה כמותית של מטרות מרובות סוגי תאים ספציפיים עניין בלימפומה. השיטה מכסה היבטים של נוגדן אימות, נוגדן אופטימיזציה, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים של סוגי לימפומה, צביעה של רקמת microarray (TMA) שקופיות ולאחר סריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, ספציפיות התייחסות לימפומה. באמצעות שיטה זו, הציונים של עוצמת בשני אכזרי של סמן של עניין את הגישה החיובית אחוז נוצרים כדי להקל עוד יותר על אנליזה כמותית. ריבוב ממזער מדגם ניצול ומספק מידע מרחבי עבור כל סמן עניין.

Introduction

Neoplasms הלימפה נגרמות על ידי מבוקרת ממאיר של לימפוציטים. תאים אלה הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, בתרגום לאיברים המערכת החיסונית ראשוני ומשני, כגון מח העצם, בלוטות הלימפה, טחול, מערכת הלימפה אחרים רירית הקשורים. Neoplasms הלימפה הם קבוצה הטרוגנית של הפרעות אשר מסווגים מבוסס על מערך של תכונות, כולל מורפולוגיה, immunophenotype, תכונות גנטיות של המצגת קליניים. בעוד כל פרמטר ממלא חלק, שושלת היוחסין נשאר המגדיר תכונה ו מהווה את הבסיס עבור מערכת סיווג WHO אשר מזהה neoplasms שמקורם בתאי B ותאי T, טבעי רוצח (NK) תאים¹.

המפתח הסיווג של לימפומה כבר אפיון הנוגדנים נגד ליקוציט סמני פני השטח של תתי סוגים שונים של לימפוציטים². אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לניתוח של סמנים כזה והיא מבוססת על העיקרון של ההכרה אנטיגן-נוגדן ספציפי כדי לזהות מולקולות תאים רקמות מבוססות להיות visualized באמצעות מיקרוסקופ אור ³. עם זאת, הזיהוי של מטרות מרובות בשקופית אחת מאת בהיר-שדות קונבנציונלי IHC מולטיפלקס הדפסות כסף יש מגבלות מאחר שלעיתים קשה להבחין אותות צבע מרובים על קטע רקמה אחת אמינה — במיוחד עבור אנטיגנים עם ביטוי נמוך⁴. הערכה חזותית כימות של צביעת ניתן גם סובייקטיבית, גורם השתנות ניתוח ונתונים לפרשנות⁵.

לכן, IHC המקובלת על דגימות (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע אינו ריאלי עבור גילוי סימולטני של מטרות מרובות במחלות immunologically מגוונות כמו לימפומה. יתר על כן, הבחנה לימפוציטים אמצעים מתאי מערכת החיסון שמסביב לעתים קרובות מדויק. זה מעכבת מחקרים מסתכל על הרלוונטיות של סמנים חדשניים לימפומה. בהקשר זה, IHC מולטיפלקס פלורסנט (mf-IHC) מציע חלופה מבטיח כמו זה מאפשר את הערכה כמותית של אנטיגן coexpression יחסים מרחביים עם דיוק גבוה יותר תוך שימור מוגבלת דגימות^6,7. כאשר טכנולוגיית הדמיה זו היא שותפות עם התוכנה ניתוח תמונה דיגיטלי, פרשנות הנתונים מורכב יותר יעיל ואסטמה ומקילה על המחקר של הגידול, microenvironment הטרוגניות^8,9. ב פרוטוקול זה, המבוסס על tyramide immunofluorescence (אם) שיטת ריבוב מוחל כדי להיקלט והוא תואם עם כל נוגדן IHC לאמת של כל מין המארח, אפילו אלה שפותחו ב-^5,מינים באותו^{7 , 10}. פרוטוקול מבוסס-tyramide מאפשר ההטיה ישירה של fluorophore לרקמות של הריבית כך נוגדן ראשוני ומשני ניתן הברקה לאחר כל שלב, המאפשרות יישום רציף של כתמים מרובים ללא נוגדנים אשיג.

אסטרטגיה מרובבת תהיה שימושית לניבוי תוצאות פרוגנוזה וטיפול על ידי זיהוי מטרות ודפוסי שלהם משתנה אוטואימונית ב לימפומות. מולטיפלקס פלורסנט IHC הוחל שלנו במעבדה לחקר פאנל של סמנים T ו- B לימפוציטים, סמני helper T-הזקיקים angioimmunoblastic T-cell לימפומה (AITL), תת סוג של לימפומה T-cell היקפיים מאופיין על ידי אגרסיבי קליני ההתנהגות ואת הגידול הטרוגניות¹¹. השירות של שיטה זו מומחש גם ב- ' מאטום לשקוף ' B-cell לימפומה גדולים (DLBCL) איפה האיתות מוגברת של קולטן B-cell עם C-MYC סימולטני והביטוי BCL-2 מרמז על השימוש טיפולית פוטנציאל טירוזין קינאז עיכוב של ברוטון ¹² .

כאן נתאר פרוטוקול כולו של נוגדן אימות לבחירה של רקמות הפקד המתאים ואת ריבוב באמצעות לימפומה FFPE רקמות, עם ניתוח בסופו של דבר של ויטראז'ים השקופיות באמצעות סריקה של כלים אוטומטיים הפתולוגיה הכמותית הדמיה מערכת.

Protocol

לכל רקמות בשימוש פרוטוקול זה התקבלו תחת סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B ללמוד 2014/00693.

1. בחירת ובדיקת נוגדנים

הערה: לפני שתמשיך עם הממסד של חלונית מרובבת, ודא כי נוגדנים כל כתם robustly, זיהוי רק היעד אנטיגן עניין. המטרה היא לבחור נוגדנים במיוחד מזהה אנטיגן עניין בסעיפים רקמות.

1. עבור נוגדן עם מחקר ומבוססת בשימוש, או שימוש קליני שגרתי ב- IHC, לאשר תנאים כגון דילול אחזור, נוגדן epitope על-ידי ביצוע IHC קונבנציונלי^5,13 על רקמות בקרה חיובית ושלילית סעיפים. עבור מקטעים רקמות ממקור אנושי, ודא הסיווג המתאים אתיקה במקום לפני ייזום ניסויים.
   הערה: בקרת חיובי ברקמות צפויים להביע אנטיגן עניין הינם פקדים שליליים הם אלה אינם. רקמת שקדים שפיר נבחרה כפקד רקמות טוב עבור לימפומה אנטיגנים מכיוון שהוא מכיל תערובת של תאים חיסוניים כולל תאים B, תאי T, תאים אנטיגן, וכן סטרומה ותאי אפיתל. האחרון לשמש כפקדי שימושי פנימי שלילי.
2. עבור מטרות לא ידוע או נוגדנים מסחרי עם מספיק נתונים שפורסמו, מבצע אימות נוגדן על-ידי יצירת חיוביות בהתאמה, שליטה שלילי FFPE תא חוסם¹⁴, באמצעות CRISPR הנוק-אאוט או siRNA דפיקה למטה של אנטיגן עניין בשורה התא המתאים באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית סטנדרטי. להשתמש אלה בלוקי תא FFPE במקום שליטה חיוביים ושליליים רקמות IHC המקובלת לפי שלב 1.1.
   הערה: הלה או 293T תאים משמשים אנטיגנים שאינם מסוג תאים ספציפיים, כמו שורות תאים לימפומה קשים transfect. אנטיגנים שנמצאים לימפוציט ספציפיים, של שורות תאים לימפומה יכול לשמש עם התמרה חושית ויראלי או אלקטרופורציה המצב של המסירה הגן (אם כי עם יעילות נמוכה).

2. תכנון את הרצף של נוגדנים, Fluorophores לוח מולטיפלקס

1. תוכנית הרצף של ריאגנטים עבור ההכתמה מולטיפלקס הסופי. לדוגמה, כאן הרצף עבור פרוטוקול מולטיפלקס בתחילה תוכנן כמו הראשון, Bcl-6; שנית, Bcl-2; שלישית, C-Myc; רביעית, CD20; החמישי Ki67.
   הערה: כדי להחליט על הרצף, נוגדנים עם משיכה חלשה הדורשים ריכוז גבוה צריך להיות מוכתם לראשונה ב ההכתמה מולטיפלקס הסופי. נוגדנים גבוה-זיקה צפויים להיות עמידים בפני מספר סיבובים של מיקרוגל בנוכחות אחר יוחלו בפעם האחרונה בפרוטוקול מולטיפלקס כדי למנוע כתמים לא ספציפית.
2. תוכנית הזוג fluorophore עבור כל נוגדן בחלונית ' '. ראה טבלה 1 ו לטבלה של חומרים על הבחירות בדוגמה זו.
   הערה: כדי להחליט על הזוג fluorophore עבור כל נוגדן, לבחור fluorophores spectrally נפרדות עבור נוגדנים עם דפוסים דומים של לוקליזציה בתוך התא ובתוך רקמות. זה יהיה למזער חפיפה ספקטרלי וקשיי unmixing.

3. Monoplex Tyramide מבוססי אם בלוח 5 מדומה-פלקס מולטיפלקס

הערה: בדוגמה זו, הפרוטוקול עבור CD20 הנדונה, אשר מתוכנן כמו הנוגדן הרביעית ברצף מולטיפלקס שתוארו לעיל. מספר צעדים נוספים חשפנות יהיו שונים עבור המיקום של הנוגדן ברצף.

1. לחתוך 3 סעיפים מיקרומטר-דק של רקמות חיוביים ושליליים שליטה באמצעות מיקרוטום ומניחים את הסעיפים על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ פולי-L-ליזין-מצופה.
2. Dewax הסעיפים באמצעות פתרון סליקה המתאים 3 x עבור 4 דקות כל אחד. נתרענן השקופיות 100% אלכוהול, 90% אלכוהול, אלכוהול 70%, 4 דקות כל אחד. הכניסו את מגלשות מים מזוקקים למשך 2-3 דקות.
3. מקם את השקופיות בצנצנת זכוכית מיקרוגל-בטוח במאגר אחזור אנטיגן סטנדרטי (זמינים מסחרית) לטבול את השקופיות. לבצע אחזור epitope חום-induced (חיר) שימוש במיקרוגל מתאים, בפתרון pH9 אנטיגן אחזור ב 98 ° C במשך 25 דקות.
   הערה: ניתן להשתמש בכל מיקרוגל עם לחץ הנע בין 800-1100 וואט, חיר ניתן למטב בהתאם. במקרה זה, מעבד רקמות מיקרוגל רב תכליתיים (פתוח לאוויר) שימש חיר, בנוכחות אחר. ההגדרות ההתחלתיות לצורך דליית epitope מסוים מבוססות על הידע מוקדמת מ- IHC קונבנציונלי.
4. לבצע סיבובים נוספים של מיקרוגל בנוכחות אחר (שלושה במקרה זה, על הנוגדן הרביעי פאנל), כל סיבוב עם 100% כוח עד 98 ° C וכוח 20% 10 דקות לשמור על הטמפרטורה. לקרר את השקופיות במים מזוקקים למשך 10 דקות לפחות.
   הערה: לבצע סיבובים מרובים של מיקרוגל בנוכחות אחר במהלך השלב אם monoplex לחשוף אנטיגן מטרה לאותו מספר של חימום הפעולות כמו תירגע המוצע. מאז CD20 מתוכנן כמו הנוגדן הרביעי, מיקרוגל בנוכחות אחר x 3 לפני ושעה אחת לאחר ביצוע הדגירה נוגדן ראשוני.
5. בדוק, לחדש את המאגר לאחר כל 5 דקות במהלך מיקרוגל נוספים בנוכחות אחר. חשוב, לא לתת להתייבש במהלך ההליכים הפשטת מרובות שקופיות. כאשר לוקחים את השקופיות מהמיקרו, להשתמש מלקחיים וכפפות heatproof כדי למקם אותם לתוך צנצנת נפרדת של מים מזוקקים. להמתין לאחזור אנטיגן לתמיסה להתקרר באופן טבעי.
6. לחסום את פעילות peroxidase רקמות באמצעות בלוק peroxidase מסחרי עבור 10 דקות (3% מי חמצן יכול לשמש של ריאגנט חלופי). שטיפה בתמיסת באגירה טריס (TBS), חומר ניקוי nonionic במשך 5 דקות.
   הערה: TBS מורכבת מ 50 מ מ טריס-Cl, pH 7.5 ו- 150 מ מ NaCl.TBS כדי להפוך TBS-ממד.
7. בלוק עם נוגדנים diluent או שור אלבומין למשך 15 דקות ולאחריו דגירה עם נוגדן ראשוני של הריבית (למשל, CD20, 1:2,000 דילול ב נוגדן diluent, ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לשטוף 3 x עם מאגר TBS-D עבור 5 דקות בכל פעם. צריך להיות מאגר TBS-D מספיקות כדי לטבול השקופית לחלוטין כל השלבים כביסה.
   הערה: אלבומין שור יכול לשמש נוגדן חלופי diluent. הנפח של נוגדן diluent תלוי בגודל של הרקמה, ועד 400 µL (עבור דגימות כריתה או דגימות רקמה microarray) µL 50 (עבור דגימות ביופסיה).
8. דגירה עם peroxidase חזרת המתאים (HRP)-נוגדנים משניים עם תוויות ברורות, נבחר על בסיס המינים של המקור של נוגדן ראשוני למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. רחץ 3 x עם TBS-D המאגר עבור 5 דקות בכל פעם.
9. החל מתאים מבוססי tyramide פלורסנט ריאגנט (בטחונות בהגברה diluent), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, כדי לאפשר ההטיה fluorophore כדי דגימת הרקמות באתרים של נוגדן ראשי האיגוד. רחץ 3 x עם TBS-D המאגר עבור 5 דקות בכל פעם.
10. ביצוע של נוספים מבוסס מיקרוגל בנוכחות אחר כדי להסיר את הנוגדן ראשיים ומשניים. חזור על כנדרש בהתבסס על המיקום של הנוגדן ברצף.
11. מקם את השקופית מים מזוקקים להתקרר. דגירה עם דאפי (דילול בטחונות ב נוגדן diluent) למשך 10 דקות, ואחריו שטיפת 3 x עם TBS-D המאגר עבור 5 דקות בכל פעם. לייבש את האזור על השקופית בלי הרקמה עם מגבונים לחים והר השקופית עם המדיה המתאימה הרכבה.
12. תמונת השקופית (ראו סעיפים 6 ו-7 של הפרוטוקול) ולקבוע נאותות ההכתמה (כפי שמוגדר על-ידי אפליה ברורה של הרקמה שליטה חיוביים ושליליים).
    הערה: אם התבנית מכתימים שגוי, בצע מחדש את monoplex מכתים לאחר התאמת אחד או יותר מהפרמטרים הבאים: מספר חום אחזור שלבים, את כמות החום אחזור, תקופת הדגירה/הריכוז של נוגדנים (ראשי ו משני), המיקום של נוגדן הרצף, ואת הבחירה של fluorophore. Monoplex מכתים צעד בדרך כלל דורש מספר סיבובים של מיטוב לקבלת סט מתאים של פרמטרים עבור צביעת המתאים. רצוי לבחון את מגוון של fluorophores עם כל נוגדן ראשוני, כמו זו תספק גמישות בקביעת מולטיפלקס המערכה האחרונה.

4. חזרה Monoplex עבור כל נוגדן בפרוטוקול מולטיפלקס

1. חזור על monoplex מכתים עבור נוגדנים אחרים בצורה דומה על-ידי התאמת מספר מיקרוגל בנוכחות אחר השלבים, בהתבסס על המיקום של הנוגדן ברצף. למשל, בעת ביצוע monoplex מכתים עבור הנוגדן השלישי בלוח מולטיפלקס שש-פלקס, לבצע שני צעדים הפשטת מיקרוגל לפני שלושה צעדים הפשטת מיקרוגל לאחר הדגירה נוגדן ראשוני.
   הערה: חשוב להעריך כי מבוסס מיקרוגל פירוק של נוגדנים גם חושף את הדגימה אל חיר. אם נוגדנים ספציפיים דורש אסטרטגיה אחזור epitope שונים, זה צריך להילקח בחשבון בעת תכנון הרצף מולטיפלקס. בדוגמה זו, אחזור epitope Ki67 דורשת pH 9, למשך 30 דקות. מאז 25 דקות של חיר ייעשה לפני KI67 מכתים בפרוטוקול רציפים, רק 5 דקות נוספות של חיר נחוצים.

5. מגה-פלקס מכתים פרוטוקול

הערה: להמשיך תירגע מכתים פרוטוקול רק לאחר כל הרכיבים מוטבו באמצעות monoplex אם צביעת. סקור את התוצאות של ההכתמה monoplex ולעצב טבלה המציגה את פריסת סופית מסדר מולטיפלקס, הבחירה של fluorophore עבור כל נוגדן. הפרטים של ריכוז נוגדן, משך הזמן של צביעת, ואת רצף והטבע של חום לאחזור עבור כל נוגדן המשמש כאן ניתנת טבלה 1.

1. לחתוך 3 דק מיקרומטר מקטעים של רקמות שליטה חיוביים ושליליים, וכן כמו רקמת המטרה של עניין (כאן, FFPE דגימות של לימפומה), באמצעות מיקרוטום ולמקם הסעיפים בשקופיות זכוכית מיקרוסקופ פולי-L-ליזין-מצופה (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: הכללת פקדי חיוביים ושליליים עבור כל נוגדן בלוח הוא רצוי, יחד עם הדגימות בפועל עבור אולמות הקולנוע. דבר זה מאפשר אישור פרוטוקול ההגדלה בוצעה כראוי.
2. Dewax, לבצע אחזור epitope חום-induced (חיר), לחסום פעילות peroxidase רקמות כמו המדרגות פרוטוקול monoplex 3.3-3.5.
3. דגירה עם הנוגדן הראשי הראשון של רצף מולטיפלקס ממוטבת, כפי שצוין בעבר נקבע באמצעות השלב אם monoplex. בדוגמה זו, BCL-6, בשעה 13:30 דילול ב נוגדן diluent בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות (ראה טבלה של חומרים), היה הצעד הראשון של פרוטוקול מולטיפלקס. לשטוף עם TBS-D מאגר במשך 5 דקות.
4. דגירה עם המתאים מתויג HRP משני נוגדן מבוסס על המינים של הנוגדן העיקרי בשימוש המנזר צעד (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף עם TBS-D מאגר במשך 5 דקות.
5. להחיל אופטימיזציה מבוססי tyramide פלורסנט הכימית (Cy5 בדוגמה זו, בטחונות ב diluent הגברה, ראה טבלה של חומרים) עם הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף עם TBS-D מאגר במשך 5 דקות.
   הערה: הבחירה מהתרכובת פלורסנט מבוססי tyramide מבוסס על monoplex אופטימיזציה אם.
6. לבדוק את היעילות של צביעה של הנוגדן הראשון באמצעות מיקרוסקופ המתאים (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: הביניים הדמיה בדיקות ניתן לבצע זאת בקלות אם המדגם הוא TMA או שקופית בודדת. אם, לעומת זאת, הכתם המבוצעת בשקופיות מרובות, זה עשוי להיות מעשי, שלב זה עשוי להיות מושמט.
7. מבצע מיקרוגל בנוכחות אחר עבור הנוגדן השני בפרוטוקול, שימוש בתנאים אופטימיזציה בשלב monoplex. לאחר מכן, המשך עם צביעה של הנוגדן הראשי השני (כאן, BCL2) עם מתויג HRP נוגדנים משניים, המבוסס על tyramide ריאגנט פלורסנט (כאן, 520, ראה טבלה של חומרים). בדוק את היעילות של צביעת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר השלמת השלב השני של כתמים.
8. באופן דומה, חזור על הפעולות באמצעות השלישי, הרביעי והחמישי נוגדנים ברצף (כאן, c-Myc, CD20, ki67, בהתאמה, עם fluorophores 570, 540, 620, בהתאמה). לבצע בדיקות הדמיה בין כל שלב אם ריאלי.
9. להוסיף counterstain גרעיני (דאפי, בטחונות דילול ב נוגדן diluent) למשך 10 דקות ולשטוף, ואז, 2 x ברה-TBS למשך 5 דקות.
10. לטעון את השקופיות בעזרת של ריאגנט הרכבה המתאים.

6. הכנת ספקטרלי ספריית שקופיות

הערה: סעיפים 6-8 של פרוטוקול זה הם ייחודיים כדי ניסוי מרובבת הם צילמו בעזרת מצלמה ספקטרלי.

1. ליצור ספריית שקופיות (יחיד-כתם הפניה תמונות) עבור כל fluorophore, דאפי, autofluorescence על הרקמה פקד אותו, כדי לשמש לניתוח תמונה מולטי ספקטריאליות.
   1. חותכים 2 x 3 קטעים מיקרומטר-דק של הסוג של ריבית (כאן, מדגם לימפומה או של שקדים כפקד) רקמת באמצעות מיקרוטום ומניחים את הסעיפים על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ פולי-L-ליזין-מצופה.
   2. תהליך שתי שקופיות באמצעות פרוטוקול monoplex (עם כל בנוכחות אחר ושטיפת צעדים), אך ללא תוספת נוגדנים או fluorophore.
   3. להכתים שקופית אחת עם דאפי לפי שלב 5.9 ולהשאיר שקופית אחת מוכתם (עבור הדור של הספקטרום autofluorescence רקמות).
      הערה: השקופיות monoplex אופטימיזציה (עם צבע יחיד פלורסצנטיות, בלי דאפי) יכול לשמש ספקטרלי ספריית השקופיות כדי ליצור ספקטרום של כל צבעי זריחה.
2. סרוק אלה קבוצה של השקופיות באמצעות המסננים המתאימים ולהעלות אותם לתוך הספרייה ניתוח התמונה.

7. ספקטרלי הדמיה

1. סריקת שקופיות monoplex
   1. לבחור את המסננים הזמינים סטנדרטי epi-זריחה מסננים (דאפי, FITC, CY3, טקסס Red ו- CY5) מתאים fluorophore מועסקים.
      הערה: קוביות מומלץ מסנן עבור fluorophores ספציפיים השתמשו בדוגמה זו מוצגות בטבלה 2¹⁵.
   2. לבחון כל סמן בערוץ פלורסצנטיות המקביל שלו לזהות את זמן החשיפה המתאים כדי לקבל אות נקי. מתמקדים הרכיב רקמות יש את האות החזק ביותר של דה מרקר.
   3. לקבוע בזמן חשיפה קבוע עבור כל analyte (נוגדן-fluorophore שילוב), כדי לאפשר השוואה קרוס-sample בעוצמה פיקסל (למרות כמה פלטפורמות מסחריות יש אסטרטגיות נורמליזציה להביא בחשבון הבדלים חשיפה).
      1. כדי להחליט בזמן חשיפה קבוע עבור ערוץ מסוים, להשתמש סביבה מצלמה בשידור חי כדי להתאים את זמן החשיפה עד אין overexposed אזורי בתמונה מצלמה בשידור חי, חזור על הפעולה עבור כל הערוצים.
   4. לאחר סריקת שקופיות monoplex, ליצור תמונות brightfield מדומה (אם הפונקציה זמינה בתוכנה המשמשת) להשוואה ויזואלית עם התבנית IHC נורמלי וכדי לקבוע אם התבנית ההגדלה היא נכונה (איור 1 ו איור 2 ).
2. סריקה דגימות מולטיפלקס (TMA שקופיות / דגימות מרובים)
   1. הגדר את פרמטרי אופטי כמתואר עבור סריקת תמונות monoplex (שלב 6.1). ראשית, להתאים את המוקד באופן ידני או אוטומטי (בצע את ההוראות של התמונה ספציפי סריקת מחשב). שנית, להתאים את זמן החשיפה לכל ערוץ פלורסנט להבטיח כי כל הליבות על TMA או בכל התחומים בשקופית, נחשפים כראוי.
      הערה: האזור שנבחר כדי להתאים את זמן החשיפה הוא חשוב. משתמשים צריכים לבחור את האזור האות החזק ביותר עבור כל מסנן (כלומר, האות Ki67 הוא חזק יותר באזור מרכז נבטי שקדים מאשר באזור המרכז nongerminal; מכאן, משתמשים צריכים להשתמש באזור מרכז נבטי שוכן בגובה חשיפה המתאימה זמן). משתמשים יכולים לאמץ גם פונקצית תיקון oversaturation של מערכת הדמיה אם הם זמינים.
   2. סריקת שקופיות TMA תחת מצב סריקה TMA אם זמינים במערכת דימות, עם אלגוריתם פוקוס אוטומטי המתאים.
   3. סעיף שלם-הרקמה שקופיות, מקבל את השקופיות נבדקו על ידי פתולוג מוסמך כדי לבחור תמונות אופטימלית מאזורי הגידול קנאס.
      הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מבוסס על מערכת ניתוח מיקרוסקופ מוגדר/תמונה (ראה טבלה של חומרים). ישנם אחרים מכונות ותוכנות התמונה ניתוח יכול לסרוק ולנתח IHC מולטיפלקס שקופיות⁷.

8. ניתוח נתונים

1. Preanalysis הערכת ותכנון
   1. השתמש השקופית הפניה עבור autofluorescence כדי לחסר autofluorescence מן התמונות שנסרקו לניתוח.
   2. סקור את התמונות לפני ניתוח כדי להבטיח כי הם בפוקוס וללא כתמים חפצים.
   3. להשתמש את סמן הגידול (למשל, CD20 בדוגמה זו) כדי לזהות תאים עניין, להמשיך עם פילוח תא, ניקוד, וניתוח אצווה מתקרב. בחר תאים CD20-חיובית עבור הניתוח.
      הערה: לדוגמה, ב DLBCL דגימות נותחו, את הגדרת והפרמטרים המוגדרים עבור פילוח תא מבוססים על גודל הגרעין והם אינטנסיביות אבל ספציפיים עבור ניתוח התמונה התוכנה ששימשה (למשל, דאפי אומר עוצמת פיקסל- 0.05 לפחות; גודל בין 80-320 פיקסלים, עם רגישות פיצול-2 [זהו פרמטר תוכנה ספציפית אשר מסתמכת במידה רבה על המורפולוגיה של הגידול: עבור תאים סרטניים קטנים, פיצול של 0.7 - 1 הוא המתאים; עבור תאים סרטניים גדולים, פיצול ניתן להתאים את 4]).
   4. בקשה פתולוג מוסמך לסקור תמונות נפרדות ולהחליט אם הרקמה פילוח נחוץ כדי לבחור אזורי גידול התא מועשר או לא לכלול אזורים עם נמק arearegion orand תגובתי תאים בשפע. אם נדרשת פילוח רקמות נוספות, בחר אזורים הפקד המתאים (כגון גידול תאים/משתית/נמק) ואז לבדוק תוכנת ניתוח התמונה בצורה נכונה יכול לזהות אזורים כאלה
   5. . המשך עם פילוח תא לאחר פילוח רקמות (אם בכלל), בקשה פתולוג מוסמך כדי לסקור את המפה פילוח תא כדי להבטיח את אמינות פילוח המיועד לגשת⁵.
   6. לקבוע ביותר מבחינה ביולוגית/קלינית המתאימה שיטת ניתוח עבור סמן נתון מעניין (למשל, אחוז חיוביות או בעוצמה אומר בכל תא).
   7. בחר ערך ניתוק עבור כל סמן (עבור אחוז חיוביות).
   8. לקבוע את הערך ניתוק חיובית בעוצמה אופטי עבור כל סמן בשיתוף עם הפתולוג. צור היסטוגרמות באמצעות ניתוח ההתפלגות תדר של סמן עוצמת התא בתוכנה המתאימה סטטיסטיקה (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: היסטוגרמה ערך עוצמת יכולים להציע סקירה כללית של חלוקת עוצמות האות.
   9. לקבוע של ניתוק משוער של ההיסטוגרמה, לוודא זאת עם סקירה פתולוג, כדי לתאם עם החתך נקבע באופן ידני-offs בתמונות שנבחרו. במצבים מסוימים, ניתוק אחד אחיד לא יהיה אפשרי עקב השתנות של צביעת ולאחר יידרש ערך ניתוק ידני עבור כל דגימה.
      הערה: סעיף 8.1 צריך להיעשות על התמונה ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) אלא אם צוין אחרת.
2. סימון תאים חיוביים ושליליים
   1. עבור כל סמן של עניין, על-פי המספר ניתוק נחוש (דרך היסטוגרמות או באופן ידני), להשתמש אפשרות או נוסחה זהה הלוגיקה כדי לסמן תאים חיוביים ושליליים עם מסומן ערך: מספר 1 עבור תאים חיוביים, מספר 0 עבור תאים שלילי.
   2. עבור הגישה החיובית של הקריטריונים, הכפל את הערך המסומן של כל סמן (1 או 0) עם המוצרים בעמודות נפרדות. אם המוצר שווה 1, פירוש התא הוא חיובי עבור כל הסמנים. חיוביות ושליליות של סמן ספציפי, להשתמש באלגוריתם אם ההיגיון.
      הערה: סעיף 8.2 שצריך לעשות בתוכנה סטטיסטיקה (ראה טבלה של חומרים).
3. הפקת הנתונים באחוזים ונתונים מספריים באמצעות pivot table
   1. להפקת נתוני אחוז עבור סמני ספציפי של עניין, בתוך תאים מוגדר (למשל, תאים CD20-חיובי או שלילי CD20 תאים) (איור 6).
   2. מוסיף pivot table לגליון נתונים.
   3. כדי לחשב את אחוז חיוביות סמן בודד, כגון CD20, בחר בפונקציה SUM תחת ערך חלק pivot table כדי לספור את המספר הכולל של תאים CD20-חיובית באמצעות סכום CD20⁺ תאים מחולק מספר התאים הכולל. התוצאה היא CD20⁺ תא אחוז בתוך ליבה אחת או מספר מחקר אחד (תלוי על הבחירה של שורת הטבלה pivot).
   4. לחשב את אחוז חיוביות מספר סמני באמצעות אותה שיטה (איור 3).
   5. הפקת נתונים מספריים. לחלץ את ספירת מנורמל החציוני עבור כל סמן של כל ליבה או כל מספר לימוד על ידי קבלת את עוצמת מרושע כל סמן עניין בכל התאים למד בתוך מדגם (איור 4).
      הערה: הערך החציוני לא להיגזר ב- pivot table ישירות. זה ניתן לגזור בעזרת נוסחה זו: חציון (אם (עמודה של מספר לימוד = מספר לימוד ספציפיים, עמודה של ערך מנורמל)).
4. התוויית הנתונים בגרף מתאים
   1. להתוות את תוצאות חיוביות באחוזים או החציוני בעוצמה לכל סמן בסוג התא של הריבית באופן ראוי להמשך הבדיקות סטטיסטי והצגתו.
   2. ליצור נקודה חלקות לספק ויזואליזציה של מספרים והפצה.
      הערה: ייצוג נתונים באמצעות תרשימים לא להעביר מידע על ההפצה. שערוך חלקות מומלצים גם כשיטה טובה לייצוג מידע, תוך שימת דגש על ההשלכות של ההבדל בין דגימות¹⁶.

תוצאות

mf-IHC תמונות עבור מדגם DLBCL עם C-MYC ו שחלוף ג'ין BCL2 (כפול פגע לימפומה) מוצגים באיור1. איור 2 מדגים את התמונות immunohistochemical בהיר-שדה מדומה. איור 3 מציין את הדור של הנתונים באחוזים. איור 4 מציג את הפרטים של נוסחה החציוני ?...

Discussion

mf-IHC יש הפוטנציאל לאפשר פתולוגים לעידון diagnosticcriteria בפתולוגיה הלימפה, כדי לנתח את התפקיד של סמנים ביולוגיים סוגי תאים ספציפיים לכיוון חיזוי של התוצאה הקלינית. כשיטת מחקר חדש, mf-IHC מוחלת יותר ויותר על הזיהוי המרחבי וסטטיסטי של פרמטרים מרובים המערכת החיסונית של תאי הגידול¹⁷. הגילו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	REF S3022	Blocking
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope	Perkin Elmer	Vectra2.0.8	Spectral imaging
absolute Ethanol	EMSURE	1.00983.2500	Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent	PERKIN ELMER	FP1135	Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF822001EA	Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF812001EA	Secondary antibody
BCL2	DAKO	clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)	primary antibody
BCL6	LEICA	NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)	primary antibody
CD20	DAKO	Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)	primary antibody
c-MYC	ABCAM	Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)	primary antibody
Cy 5	PERKIN ELMER	FP1171	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7	Graph pad		Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent	SIGMA	H2779-1L	Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	Inform Software 2.2.1	Data Analysis software
KI67	DAKO	Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)	primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor	Milestone		Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave	PANASONIC	NN-ST651M	Microwave stripping
Mowiol	SIGMA ALDRICH	81381 Aldrich Mowiol® 4-88	mounting media
Opal 570	PERKIN ELMER	FP1488	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520	PERKIN ELMER	FP1487B21	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540	PERKIN ELMER	FP1494	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620	PERKIN ELMER	FP1495	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI	PERKIN ELMER	FP1490	nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)	DAKO	S2367	For HIER
Tris Buffer saline (TBS)	1st BASE	BUF3030 20X4L	for buffer wash
Tween 20	SIGMA ALDRICH	P1379-1L	Tween