멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

요약

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

초록

Immunohistochemical (IHC) 방법 가벼운 현미경 검사 법에 의해 단백질 표정에 현장 분석에 대 한 연구와 진단 목적을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 시각화 및 정량화 기존의 비 IHC를 사용 하 여 단일 조직 섹션에서 여러 개의 항 원에의 도전 이다. 멀티플렉스 이미징 관계가 특히 림프 종 연구와 진단, 마커 복잡 한 종양 microenvironment의 맥락에서 해석 될 수 있다. 여기 우리는 멀티플렉스 형광 IHC 림프 종에 대 한 관심의 특정 세포 유형에 여러 대상의 양적 평가 있도록 얼룩에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 방법 측면 커버 유효성 검사 항 체, 항 체 최적화, 림프의 표식이 있는 멀티플렉스 최적화, 데이터 분석, 특정 뒤 조직 microarray (TMA) 슬라이드 및 슬라이드, 스캔의 얼룩 림프 종 참조. 이 메서드를 사용 하 여 모두 관심과 백분율 양성의 감 적의 평균 강도 대 한 점수는 정량 분석을 더 촉진 하기 위하여 생성 됩니다. 멀티플렉싱 샘플 사용률을 최소화 하 고 각 표식에 대 한 관심의 공간 정보를 제공 합니다.

서문

림프 신생 세포의 억제 되지 않는 악성 확산에 의해 발생 합니다. 이 세포 면역 시스템의 중요 한 구성 요소 이며, 골 수, 림프절, 비장, 및 다른 점 막 관련 림프 시스템 등 기본 2 차 면역 기관에 지역화. 림프 신생 형태학, immunophenotype, 유전자 기능 및 임상 프레 젠 테이 션을 포함 하 여 특징의 별자리에 따라 분류는 누가 장애의 다른 유형의 그룹입니다. 각 매개 변수는 역할을, 하는 동안 혈통 정의 기능을 유지 하 고 인식 하는 B 세포, T 세포 및 자연적인 살인자 (NK) 세포¹에서 파생 된 신생 WHO 분류 시스템에 대 한 기초를 형성.

림프 종의 분류에 키 림프 톨²의 다양 한 하위의 백혈구 표면 표식에 대 한 항 체의 특성화 되었습니다. Immunohistochemistry (IHC) 전통적으로 이러한 마커 분석에 사용 되었습니다과 가벼운 현미경 ^{통해 구상 될 수 있다 세포 및 조직 기반 분자 검출에 특정 항 원-항 체 인식의 원리에 따라 그러나 3}. 기존의 밝은 필드 비 멀티플렉스 IHC에서 단일 슬라이드에 여러 목표물의 식별 한계가 있기 때문에 그것은 종종 단일 조직 섹션에 여러 개의 색상 신호를 안정적으로 구분 하기 어려운-특히 매우 낮은 식⁴의 항 원에 대 한 육안 평가 및 정량화 얼룩의 주관적, 분석 및 데이터 해석⁵에 변화를 일으키는 될 수 있습니다.

따라서, 기존의 IHC에 포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 샘플은 림프 종 같은 면역학 다양 한 질병에 여러 목표물의 동시 검색 가능 합니다. 또한, 주변의 면역 세포에서 종양 약 세포를 구별 하지 않습니다 정확 하 게. 이 림프 종에 소설 biomarkers의 관련성을 보고 하는 연구를 방해. 이러한 맥락에서 다중 형광 IHC (mf-IHC) 제공 유망한 대안 항 coexpression의 양적 평가 허용 및 제한 보존 하는 동안 더 높은 정밀도로 공간 관계^6,7. 이 이미징 기술은 디지털 이미지 분석 소프트웨어와 제휴는 때 데이터 해석은 보다 효율적 및 종양과 microenvironment이^8,9의 연구를 용이 하 게 한다. 이 프로토콜에는 tyramide 기반 면역 형광 (IF) 다중화 방법 신호를 증폭 하는 적용 되 고 같은 종^5,7 에 개발도 그 어떤 호스트 종에서 어떤 IHC 검증 항 체와 호환 ^{, 10}. 1 차 및 이차 항 체는 여러 얼룩의 순차 응용 프로그램에 대 한 허용 하는 각 단계 후 박탈 될 수 있도록 관심의 조직에 fluorophore의 직접 활용에 대 한 tyramide 기반 프로토콜 허용 항 체 분 없이.

멀티플렉스 전략 목표 및 림프 종에서 그들의 변종 면역학 패턴을 식별 하 여 예 후와 치료 결과 예측 하는 데 유용 있을 것입니다. IHC T와 B 림프 구 마커 및 angioimmunoblastic T-세포 림프 종 (AITL)에서 T-follicular 도우미 마커 패널의 연구에 대 한 우리의 실험실에 적용 된 다중 형광 주변 T 세포 림프 종의 하위 공격적으로 임상 특징 동작 및 종양이¹¹. 이 방법의 유틸리티는 또한 확산 큰 B-세포 림프 종 (DLBCL) 어디 Bruton의 티로신 키 니 아 제 억제의 잠재적인 치료 사용 제안 동시 C-MYC 및 BCL-2 식을 B 세포 수용 체의 신호 증가에 나와 있는 ¹² .

여기 우리는 적절 한 컨트롤 조직 선택 항 체 유효성 검사에서 전체 프로토콜 설명 및 림프 FFPE를 사용 하 여 멀티플렉싱 조직, 스캔을 사용 하 여 스테인드 슬라이드의 최종 분석 자동화 양적 병리학 이미징 시스템입니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 조직 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에서 가져온 2014/00693 공부.

1. 선택과 항 체의 유효성 검사

참고: 어떤 멀티플렉스 패널의 설립을 계속 하기 전에 모든 항 체 얼룩이 튼튼하게, 관심의 대상 항만 식별 해야 합니다. 목표는 구체적으로 조직 단면도의 항 원 인식 하는 항 체를 선택 하는.

1. 잘 설립 연구 사용, 또는 임상 사용 IHC에서 항 체에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어 조직에 기존의 IHC^5,13 를 수행 하 여 epitope 검색 및 항 체 희석 등 조건 확인 섹션입니다. 인간 근원의 조직 단면도, 실험 시작 전에 장소에 적절 한 윤리 클리어런스는 확인 합니다.
   참고: 긍정적인 통제는 관심사의 항 원을 표현 하는 것으로 예상 된다 조직 그리고 부정적인 컨트롤 하지 않는. B 세포 등 면역 세포, T 세포 항 원 선물 세포 뿐만 아니라 실질과 상피 세포의 혼합물을 포함 하기 때문에 양성 편도 선 조직 림프 종 항 원에 대 한 좋은 조직 제어로 선택 된다. 후자의 역할을 유용한 부정적인 내부 제어 합니다.
2. 알 수 없는 대상 또는 부족 한 게시 된 데이터와 함께 상업 항 체를 만들어 일치 긍정적인 항 체 유효성 검사를 수행 하 고 부정적인 제어 FFPE 셀 블록¹⁴, CRISPR 노크 아웃 또는 siRNA를 사용 하 여 관심의 항 원의 녹 다운 표준 분자 생물학 기법을 통해 적절 한 셀 라인. 단계 1.1에 의하여 기존의 IHC에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어 조직 대신 이러한 FFPE 셀 블록을 사용 합니다.
   참고: 헬러 또는 293T 세포 항 세포 형 하지 않은 일반적으로 사용 됩니다 특정 림프 종 세포 라인은 transfect 어렵다. 있는 특정 림프 구 항 원에 대 한 림프 종 세포 선은 사용할 수 있습니다 바이러스 성 변환 또는 electroporation 유전자 배달의 모드와 (와 낮은 효능).

2. 다중 패널에 대 한 항 체 및 Fluorophores의 시퀀스 계획

1. 최종 멀티플렉스 얼룩에 대 한 시 약의 순서를 계획 합니다. 예를 들어 여기 다중 프로토콜 시퀀스 처음 계획으로 첫째, Bcl-6; 두 번째, Bcl-2; 셋째, C-Myc; 넷째, CD20; 다섯째, Ki67입니다.
   참고: 시퀀스에 대 한 결정, 항 체는 약한 선호도 높은 농도 요구 한다 얼룩이 질 먼저 최종 멀티플렉스 얼룩에. 전자 레인지 스트립의 여러 라운드에 저항력이 될 가능성이 높은 친 화력 항 체 마지막을 일반적인 얼룩이 지기 피하기 위해 다중 프로토콜에 적용 됩니다.
2. 패널에서 각 항 체에 대 한 fluorophore 파트너 계획. 이 예제에서 선택에 대 한 표 1 및 테이블의 자료 를 참조.
   참고: 각 항 체의 fluorophore 파트너에 대 한 결정, 괴기 하 게 명료한 fluorophores 지역화 셀 및 조직 내에서 비슷한 패턴을 가진 항 체에 대 한 선택. 이 스펙트럼 오버랩 그리고 unmixing 문제가 최소화 됩니다.

3. 수염 Tyramide 기반 시뮬레이션된 5-플렉스 멀티플렉스 패널에 있는 경우

참고:이 예제에서는 CD20 위한 프로토콜은 논의 위에서 설명한 다중 순서로 4 항 체로 계획. 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 대 한 추가 벗기는 단계 수가 다릅니다.

1. 톰을 사용 하 여 양수 및 음수 제어 조직의 3 µ m 얇은 섹션을 잘라내어 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드에 섹션을 배치.
2. 3 하는 적절 한 청소 솔루션을 사용 하 여 섹션 dewax x 4 분. 100% 알코올, 90% 알코올, 및 70% 알코올, 4 분에 슬라이드 리하이드레이션 2-3 분 증류수에 슬라이드를 넣어.
3. 표준 항 원 검색 버퍼 (상용)에 전자 레인지-안전 유리 항아리에 슬라이드를 잠글 슬라이드를 놓습니다. 25 분에 98 ° C에 pH9 항 원 검색 솔루션에 적합 한 전자 레인지를 사용 하 여 열 유도 epitope 검색 (여기)를 수행 합니다.
   참고: 800-1100 와트에서 배열 하는 압력을 가진 모든 전자 레인지를 사용할 수 있습니다, 그리고 여기에 따라 최적화할 수 있습니다. 이 경우에, 다기능 전자 레인지 조직 프로세서 (공기에 오픈) 여기와 스트립 사용 되었다. 특정 epitope의 검색에 대 한 초기 설정은 기존의 IHC에서 사전 지식을 기반으로 합니다.
4. 전자 레인지 (3 패널에서 제 4 항 체에 대 한이 경우에) 스트립의 추가 라운드, 98 ° C에 100% 파워와 동일한 온도 10 분 20% 전원 각 라운드를 수행 합니다. 적어도 10 분 동안 증류수에 슬라이드 아래로 냉각 하십시오.
   참고: 마이크로파 난방 제안 된 멀티플렉스에서 단계의 동일한 수에 대상 항 원 노출 수염 경우 단계 스트립의 여러 라운드를 수행 합니다. CD20 4 항 체로 계획, 이후 스트립 전에 3 배 및 1 차적인 항 체 외피를 하 고 후 한 번 전자 레인지 할.
5. 확인 하 고 추가 전자 레인지 스트립 하는 동안 5 분 마다 후 버퍼를 보충. 중요 한 것은, 슬라이드 여러 스트립 절차 동안 완전히 말리 게 하지 마십시오. 전자 레인지에서 슬라이드를 찍을 때 사용 하 여 집게 및 내 열 장갑 증류수의 별도 항아리에 그들을 배치. 자연스럽 게 냉각 항 원 검색 솔루션에 대 한 기다립니다.
6. 10 분 동안 상업 과산화 효소 블록을 사용 하 여 조직 과산화 효소 활동을 차단 (3%의 과산화 수소는 다른 시 약으로 사용할 수 있습니다). Tris 버퍼 염 분 (TBS)와 5 분 동안 비 세제 세척.
   참고: TBS 50 mM Tris Cl, pH 7.5, 및 150 mM NaCl.TBS TBS. 수 있도록 구성 되어
7. 항 체 희석 액 또는 관심의 1 차적인 항 체를 가진 외피 다음 15 분 동안 소 혈 청 알 부 민 블록 (예를 들어, CD20, 1:2,000 항 체 희석 액에 희석 재료의 표참조) 30 분에 대 한 실 온에서 3 x 세척 TBS-D 5 분 각 시간에 대 한 버퍼입니다. 충분 한 TBS 차원 버퍼 슬라이드 모든 세척 단계에 완전히 몰입할 수 있어야 합니다.
   참고: 소 혈 청 알 부 민 대체 항 체 희석제로 사용할 수 있습니다. 항 체 희석 액의 볼륨 (위해 절단 샘플 조직 microarray) 400 µ L까지 (대 한 생 검 견본) 50 µ L에서 조직의 크기에 따라 달라 집니다.
8. 적절 한 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 품 어-실 온에서 15 분에 대 한 1 차적인 항 체 근원의 종 기초 선택 이라는 2 차 항 체. 워시 5 분 TBS 차원 버퍼와 3 배 각 시간.
9. 적절 한 tyramide 기반 형광 시 약 (증폭 희석제에 1: 100)을 적용 하 고 5 분 동안 실 온에 fluorophore 1 차적인 항 체 바인딩 사이트에서 조직 샘플을 활용 수 있도록 품 어. 워시 5 분 TBS 차원 버퍼와 3 배 각 시간.
10. 수행 하는 추가 전자 레인지 기반 스트립 차 및 2 차 항 체를 제거 하. 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 따라 필요에 따라 반복 합니다.
11. 장소를 증류수에 슬라이드. 10 분 뒤에 씻어 DAPI에서 (항 체 희석 액 1: 100 희석)와 품 어 5 분 각 시간에 대 한 TBS 차원 버퍼와 3 배. 물티슈와 티슈 없이 슬라이드에 영역을 건조 하 고 적절 한 설치 미디어와 슬라이드를 탑재.
12. 이미지 슬라이드 (참조 섹션 6과 7이이 프로토콜의) 얼룩 (으로 긍정적이 고 부정적인 제어 조직의 분명 차별에 의해 정의 된)의 적합성을 결정 하 고.
    참고: 얼룩 패턴 올바르지 않으면, 다시 다음 매개 변수 중 하나 이상을 조정 후 얼룩 수염: 열 검색 수 단계, 열 검색, 부 화 기간/항 체의 농도의 금액 (기본 및 보조), 시퀀스, 그리고 fluorophore의 선택에서 항 체의 위치. 단계를 일반적으로 얼룩이 수염 적합 한 적절 한 얼룩에 대 한 매개 변수 집합을 얻기 위해 최적화의 여러 라운드를 필요 합니다. 그것은이 마지막 다중 집합 결정에 유연성을 제공 합니다 각 1 차 항 체로 fluorophores의 범위를 테스트 하는 것이 좋습니다.

4. 각 항 체는 다중 프로토콜에 대 한 수염의 반복

1. 시퀀스에 있는 항 체의 위치에 따라 단계를 제거 하는 전자 레인지의 수를 조정 하 여 비슷한 방법으로 다른 항 체에 대 한 얼룩 수염을 반복 합니다. 예를 들어, 6-플렉스 멀티플렉스 패널에 제 3 항 체에 대 한 얼룩 수염을 수행할 때 수행 하기 전에 두 전자 렌지 스트립 단계 및 3 전자 레인지 벗기는 단계 1 차적인 항 체 외피 후.
   참고: 그것은 그도 여기에 샘플을 제공 항 체의 전자 레인지 기반 스트립을 감사 하는 것이 중요입니다. 경우 특정 항 체는 다른 epitope 검색 전략,이 다중 시퀀스를 계획할 때 고려 될 필요가 있다. 이 예제에서는 Ki67 epitope 검색 pH 9, 30 분 필요합니다. 여기의 25 분 이전에 할 수 때문에 필요는 KI67 순차적 프로토콜, 여기만 있는 여분의 5 분에에서 얼룩.

5. 다중 프로토콜을 얼룩이 지기

참고: 모든 구성 요소 얼룩 경우 수염을 사용 하 여 최적화 된 후에 프로토콜을 얼룩이 지는 멀티 플렉스 진행. 수염 얼룩의 결과 검토 하 고 멀티 플렉스 및 각 항 체에 대 한 fluorophore의 선택 순서는 최종 레이아웃을 보여 주는 테이블을 디자인 합니다. 항 체 농도의 세부 사항을, 얼룩, 그리고 시퀀스의 기간 및 여기에 사용 된 각 항 체에 대 한 열 검색의 표 1에 제공 됩니다.

1. 긍정적이 고 부정적인 제어 조직의 컷 3 µ m 얇은 섹션 (여기, 림프 종의 FFPE 샘플) 관심의 대상 조직으로는 톰을 사용 하 고 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 섹션을 놓습니다.
   참고: 패널에서 각 항 체에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 포함은 권장, 멀티 플렉스에 대 한 실제 예제와 함께. 얼룩 프로토콜 올바르게 수행한 확인 가능 합니다.
2. Dewax, 열 유도 epitope 검색 (여기)를 수행 하 고 수염 프로토콜 단계 3.3-3.5에서 조직 과산화 효소 활동을 차단.
3. 이전 수염 경우 단계를 사용 하 여 결정 하는 최적화 된 다중 시퀀스의 첫 번째 주 항 체와 함께 품 어. 이 예제에서 BCL-6, 1시 30분에 60 분 동안 실내 온도에 희석제 항 체에 희석 ( 재료의 표참조), 다중 프로토콜의 첫 번째 단계를 했다. 5 분 동안 TBS 차원 버퍼 씻어.
4. 적절 한 HRP 붙인 2 차 항 체로 사전에 사용 되는 기본 항 체의 종류에 따라 품 어 TBS 차원 버퍼 5 분 10 분 세척에 대 한 실 온에서 ( 재료의 표참조) 단계.
5. 최적화 된 tyramide 기반 형광 시 약 (증폭 희석제에 1: 100이 예에서 Cy5 재료의 표참조) 5 분 동안 실 온에서 부 화와 함께 적용 합니다. 부 화 후 5 분 동안 TBS 차원 버퍼 씻어.
   참고: tyramide 기반 형광 시 약의 선택은에 따라 최적화 된 수염 경우.
6. 적절 한 현미경을 사용 하 여 첫 번째 항 체의 얼룩의 효율성을 확인 ( 재료의 표참조).
   참고: 중간 검사 이미징 샘플 TMA 또는 단일 슬라이드 경우 쉽게 할 수 있습니다. 그러나 경우,, 얼룩 여러 슬라이드에 수행 되 고, 두 일 수 있습니다 그리고이 단계를 생략할 수 있다.
7. 전자 레인지 수염 단계에서 최적화 된 조건을 사용 하 여 프로토콜에서 두 번째 항 체에 대 한 스트립을 수행 합니다. 그런 다음, 두 번째 주 항 체의 얼룩과 진행 (여기, BCL2) HRP에 꼬리표를 붙이는 이차 항 체와 형광 시 약 tyramide 기반 (여기, 520, 재료의 표참조). 얼룩이 지기의 두 번째 라운드의 완료 후에 형광 현미경 얼룩의 효율성을 확인 하십시오.
8. 마찬가지로, 세 번째를 사용 하 여 프로시저를 반복 시퀀스에서 제 4, 및 5 항 체 (여기, c-Myc, CD20와 ki67, fluorophores 570, 540, 및 620와 각각, 각각). 가능한 경우 각 단계 사이 이미징 검사를 수행 합니다.
9. 10 분 동안 핵 counterstain (DAPI, 희석제 항 체에서 1: 100 희석)를 추가 하 고, 다음, 5 분 동안 TBS d에서 2 x을 씻어.
10. 적절 한 장착 시 약을 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.

6. 준비 스펙트럼 라이브러리의 슬라이드

참고: 섹션 6-8이이 프로토콜의 스펙트럼 카메라를 사용 하 여 몇 군데는 멀티플렉스 실험 독특합니다.

1. Multispectral 이미지 분석에 사용할 동일한 제어 조직에 각 fluorophore, DAPI, 및 autofluorescence에 대 한 라이브러리 슬라이드 (단일 얼룩 참조 이미지)를 만듭니다.
   1. (여기, 림프 종 샘플 또는 제어로 편도 선)의 조직 형식의 2 x 3 µ m 얇은 섹션 잘라내기는 톰을 사용 하 여 및 현미경 폴 리-L-리 신-코팅 유리 슬라이드에 섹션을 배치.
   2. 두 프로세스 (와 모든 스트립 단계 세척), 수염 프로토콜을 사용 하 여 슬라이드 항 체 또는 fluorophore 추가 하지 않고.
   3. 얼룩 DAPI 단계 5.9 당 하나의 슬라이드와 떠나 한 슬라이드 흠 없는 (조직 autofluorescence 스펙트럼의 생성)에 대 한.
      참고: (DAPI 없이 단일 형광 염료)와 최적화 된 수염 슬라이드 사용할 수 있습니다으로 스펙트럼 라이브러리 슬라이드 각 형광 염료의 스펙트럼 생성 하.
2. 이러한 적절 한 필터를 사용 하 여 슬라이드의 스캔 하 고 이미지 분석 라이브러리에 그들을 업로드.

7. 스펙트럼 이미징

1. 수염 슬라이드 스캔
   1. 사용 가능한 표준 피 형광 필터 (DAPI, FITC, CY3, 텍사스 레드와 CY5) 고용된 fluorophore 적합에서 필터를 선택 하십시오.
      참고:이 예제에 사용 된 특정 fluorophores에 대 한 권장된 필터 큐브 표 2¹⁵에 표시 됩니다.
   2. 깨끗 한 신호를 적당 한 노출 시간을 식별 하는 해당 형광 채널에서 각 표식을 검사 합니다. 표식에 대 한 강한 신호 되어 조직 구성 요소에 초점을.
   3. (비록 일부 상용 플랫폼 표준화 전략 노출에서 차이 담당 하는) 픽셀 강도의 간 샘플 비교를 허용 하도록 각 분석 (항 체 fluorophore 조합)에 대 한 고정된 노출 시간을 결정 합니다.
      1. 특정된 채널에 대 한 고정된 노출 시간에 대 한 결정, 라이브 카메라 설정을 사용 하 여 라이브 카메라 이미지에 아무 설쳐 영역까지 노출 시간을 조정 하 고 모든 채널에 대 한 이것을 반복 합니다.
   4. 수염 슬라이드를 스캔 생성 시뮬레이션된 명시 이미지 (함수가 사용 하는 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우에) 정상적인 IHC 패턴으로 시각적으로 비교 하 고정확한 (그림 1 및 그림 2 얼룩 패턴 인지 확인 하려면 ).
2. 다중 샘플 스캔 (TMA 슬라이드 / 여러 샘플)
   1. 수염 이미지 (단계 6.1) 스캔에 대 한 설명 된 대로 광학 매개 변수를 설정 합니다. 첫째, 초점을 조정 하는 수동 또는 자동으로 (특정 이미지 검색 시스템의 지시에 따라). 둘째,는 TMA에 모든 코어 또는 모든 슬라이드에 적절 하 게 노출 되도록 형광 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
      참고: 영역 노출 시간을 조절 하려면 선택이 중요 합니다. 사용자가 각 필터에 대 한 강한 신호 영역을 선택 해야 (즉, Ki67 신호는 nongerminal 센터 지역 보다 편도 선 어린 싹 센터 지역에 강한, 따라서, 사용자는 적절 한 노출에서 설정 새싹 센터 영역을 사용 해야 시간)입니다. 사용자가 또한 사용 가능한 경우 이미징 시스템의 oversaturation 보정 기능을 채택할 수 있다.
   2. TMA 스캐닝 모드 경우 이미징 시스템과 적절 한 자동 초점 알고리즘에서에서 사용할 수 있는 TMA 슬라이드를 스캔 합니다.
   3. 전체 조직 섹션 슬라이드, 슬라이드 가장 대표적인 종양 분야에서 최적의 이미지를 선택 하는 자격 갖춘된 병리학 자에 의해 검토를 얻을.
      참고: 여기에 설명 된 프로토콜 기반 정의 현미경/이미지 분석 시스템 ( 재료의 표참조). 다른 기계 및 이미지 분석 소프트웨어를 스캔 하 고 멀티플렉스 IHC 슬라이드⁷을 분석할 수 있다.

8. 데이터 분석

1. Preanalysis 평가 및 계획
   1. Autofluorescence에 대 한 참조 슬라이드를 사용 하 여 분석에 대 한 스캔 한 이미지에서 autofluorescence를 뺍니다.
   2. 아티팩트를 얼룩 없이 그들에 초점을 분석 하기 전에 이미지를 검토 합니다.
   3. 종양 마커 (예를 들어,이 예제에서 CD20) 관심사의 세포를 사용 하 여와 셀 분할, 점수, 및 배치 분석 진행을 접근. CD20-긍정적인 분석에 대 한 셀을 선택 합니다.
      참고: 예를 들어는 DLBCL에서 샘플 분석 여기, 설정 및 핵 크기를 기반으로하는 셀 세분화 하 고 강렬 하지만 사용 하는 이미지 분석 소프트웨어에는 정의 된 매개 변수 (예를 들어는 DAPI 의미에서 픽셀 강도 최소 0.05; 2 분할 감도 80-320 픽셀 사이 크기 [이것이 종양의 형태에 크게 의존 하는 소프트웨어 특정 매개 변수: 작은 종양 세포, 분할에 대 한의 0.7-1 적절 한 이며 큰 종양 세포에 대 한 분할 조정 될 수 있다 최대 하 4]).
   4. 개별 이미지를 검토 하 여 조직 세분화 종양 농축 셀 영역을 선택 하 고 괴 사 arearegion orand 풍부한 반응 셀 영역을 제외 하는 데 필요한 여부 결정 된 병리학 자에 대 한 요청입니다. 추가 조직 세분화가 필요한 경우 다음 적절 한 제어 영역 (예: 종양 세포/기질/괴 사)를 선택 하 고 이미지 분석 소프트웨어 같은 영역을 식별 올바르게 수 확인
   5. 조직 세분화 (있을 경우), 후 셀 분할 진행 의도 세분화의 충실도 보장 하기 위해 셀 분할 지도 검토 된 병리학 접근⁵요청.
   6. 가장 생물학/임상 적절 한 분석 방법 (예를 들어, 백분율 양성, 또는 셀 당 평균 강도)의 주어진된 biomarker에 대 한 확인 합니다.
   7. 컷오프 값 (백분율 양성)에 대 한 각 마커를 선택 합니다.
   8. 병리학 자와 함께에서 각 표식에 대 한 광 강도 긍정적인 컷오프 값을 결정 합니다. 적절 한 통계 소프트웨어의 강도/셀 표식의 주파수 분포를 분석 하 여 히스토그램을 생성 ( 재료의 표참조).
      참고: 강도 값 히스토그램 신호 농도의 분포에 대 한 개요를 제공할 수 있습니다.
   9. 히스토그램에서 대략적인 인하를 결정 하 고 병리학 자 검토, 선택 된 이미지에 수동으로 결정된 컷 오프와 상관 관계를이 확인 합니다. 경우에 따라 균일 한 단일 잘라 얼룩, 다양성 때문에 가능한 되지 않습니다 하 고 각 샘플에 대 한 수동 컷오프 값이 요구 될 것 이다.
      참고: 섹션 8.1에서에서 이루어져야 한다 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 별도로 지정 하지 않는 한.
2. 긍정적이 고 부정적인 셀 표시
   1. (히스토그램을 통해 또는 수동으로) 결정, 차단 번호에 따라 관심의 각 마커를 사용 하 여 "IF" 또는 비슷한 논리 수식을 표시와 함께 긍정적이 고 부정적인 셀 값 표시: 1 긍정적인 세포에 대 한 숫자, 번호 0 부정적인 세포에 대 한.
   2. 모든 마커의 양성을 위해 각 마커 (1 또는 0) 별도 열에 제품의 표시 값을 곱하면 됩니다. 제품 1 인, 셀은 모든 표시에 대 한 긍정적인 의미 합니다. 양성 및 특정 마커의 부정에 대 한 IF 논리 알고리즘을 사용 합니다.
      참고: 섹션 8.2 통계 소프트웨어에서 일을 해야 ( 재료의 표참조).
3. 백분율 데이터 및 피벗 테이블을 사용 하 여 숫자 데이터를 생성
   1. 백분율 데이터 정의 된 셀 (예를 들어, CD20 양성 세포, 또는 CD20-부정적인 세포) 내 관심의 특정 마커를 생성 (그림 6).
   2. 데이터 시트에는 피벗 테이블을 삽입 합니다.
   3. 단일 마커, CD20, 등의 양성 비율을 계산 하는 CD20의 합계를 사용 하 여 CD20 양성 세포의 총 수를 계산 하려면 피벗 테이블의 값 부분에서 SUM 함수를 선택⁺ 세포로 나눈는 총 셀 수입니다. 결과는 CD20⁺ 세포 하나의 코어 또는 (피벗 테이블 행의 선택에 따라) 한 연구 수 비율.
   4. 같은 방법 (그림 3). 을 사용 하 여 여러 마커의 양성 비율을 계산
   5. 숫자 데이터를 생성 합니다. 각 마커는 샘플 (그림 4)에서 공부 하는 모든 셀의 평균 강도 취득 하 여 각 코어 또는 각 연구 수의 각 표식에 대 한 중간 정규화 된 수를 추출 합니다.
      참고: 중앙값 수 없습니다 파생 될 피벗 테이블에서 직접. 이 수식을 사용 하 여 파생 될 수 있다: 중간 (IF (열 연구 수의 = 특정 연구 번호, 정규화 된 값의 열)).
4. 적합 한 그래프에 데이터 플롯
   1. 백분율 양성 또는 추가 통계 테스트 및 프레 젠 테이 션에 대 한 적절 한 방식으로 관심 유형의 셀에 표식 당 평균 강도 결과 플롯 합니다.
   2. 숫자와 분포의 시각화를 제공 하기 위해 점 플롯을 만듭니다.
      참고: 막대 그래프와 데이터를 나타내는지 않습니다 전달 하지 배포에 대 한 정보. 추정 플롯 또한 샘플¹⁶사이의 차이의 크기에 중점을 두고 데이터 표현 위한 좋은 방법으로 권장 됩니다.

결과

mf IHC BCL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 C-MYC DLBCL 샘플에 대 한 이미지는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 에서는 시뮬레이션된 밝은 필드 immunohistochemical 이미지를 보여 줍니다. 그림 3 백분율 데이터의 생성을 나타냅니다. 그림 4 는 숫자 데이터의 생성에 대 한 중간 공식의 세부 ?...

토론

mf IHC 병리학 림프 병 리에 diagnosticcriteria를 수정 하 고 임상 결과의 예측으로 특정 세포 유형에서 바이오 마커의 역할 분석을 사용 하도록 가능성이 있다. 새로운 연구 방법으로 mf IHC 점점 종양 세포¹⁷의 여러 면역 매개의 양적 및 공간 확인에 적용 됩니다. 종양 마커의 공동 식 mf IHC의 검출 재현성 및 신뢰성⁵표시 되었습니다. 그러나, 기술은 초기와 시 약 및 조?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	REF S3022	Blocking
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope	Perkin Elmer	Vectra2.0.8	Spectral imaging
absolute Ethanol	EMSURE	1.00983.2500	Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent	PERKIN ELMER	FP1135	Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF822001EA	Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF812001EA	Secondary antibody
BCL2	DAKO	clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)	primary antibody
BCL6	LEICA	NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)	primary antibody
CD20	DAKO	Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)	primary antibody
c-MYC	ABCAM	Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)	primary antibody
Cy 5	PERKIN ELMER	FP1171	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7	Graph pad		Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent	SIGMA	H2779-1L	Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	Inform Software 2.2.1	Data Analysis software
KI67	DAKO	Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)	primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor	Milestone		Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave	PANASONIC	NN-ST651M	Microwave stripping
Mowiol	SIGMA ALDRICH	81381 Aldrich Mowiol® 4-88	mounting media
Opal 570	PERKIN ELMER	FP1488	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520	PERKIN ELMER	FP1487B21	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540	PERKIN ELMER	FP1494	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620	PERKIN ELMER	FP1495	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI	PERKIN ELMER	FP1490	nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)	DAKO	S2367	For HIER
Tris Buffer saline (TBS)	1st BASE	BUF3030 20X4L	for buffer wash
Tween 20	SIGMA ALDRICH	P1379-1L	Tween