Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.

Résumé

Immunohistochimie (IHC) méthodes pour l’analyse in situ d’expression de la protéine au microscope photonique sont un outil puissant pour la recherche et des fins de diagnostic. Cependant, la visualisation et la quantification des antigènes multiples dans une section de tissu unique aide IHC chromogène conventionnel est difficile. L’imagerie multiplexé est particulièrement pertinent dans la recherche de lymphome et de diagnostics, où les marqueurs devront être interprétées dans le contexte d’un micro-environnement tumoral complexe. Nous décrivons ici un protocole pour multiplexé IHC fluorescent coloration afin de permettre l’évaluation quantitative de cibles multiples dans les types spécifiques de cellules d’intérêt dans le lymphome. La méthode couvre les aspects de validation de l’anticorps, l’optimisation de l’anticorps, l’optimisation multiplexe avec des marqueurs des sous-types de lymphomes, la coloration des lames de tissu microarray (TMA) et la numérisation des diapositives, suivie d’analyse de données, avec spécifiques référence de lymphome. En utilisant cette méthode, partitions pour les deux l’intensité moyenne d’un marqueur d’intérêt et la pourcentage de positivité sont générées afin de faciliter la poursuite des analyses quantitatives. Multiplexage minimise l’utilisation de l’échantillon et fournit de l’information spatiale pour chaque marqueur d’intérêt.

Introduction

Les tumeurs lymphoïdes sont causés par la prolifération maligne anarchique des lymphocytes. Ces cellules sont des composantes essentielles du système immunitaire et localiser les organes immunitaires primaires et secondaires, tels que la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, la rate et autre système lymphoïde associé aux muqueuses. Les tumeurs lymphoïdes sont un groupe hétérogène d’affections qui sont classées basé sur une constellation de caractéristiques, dont la morphologie lymphoblastiques, les caractéristiques génétiques et présentation clinique. Tandis que chaque paramètre joue un rôle, lignée reste une caractéristique déterminante et constitue la base pour le système de classification OMS qui reconnaît les néoplasmes dérivés de cellules B et les lymphocytes T natural killer (NK) cellules¹.

Clé à la classification du lymphome est la caractérisation des anticorps contre les marqueurs de surface de leucocytes des différents sous-types de lymphocytes². L’immunohistochimie (IHC) a été utilisé traditionnellement pour l’analyse de ces marqueurs et repose sur le principe de la reconnaissance de l’antigène-anticorps spécifique pour détecter des molécules axée sur les cellules et les tissus qui peuvent être visualisées par le microscope photonique ³. Toutefois, l’identification de cibles multiples sur une seule diapositive, par conventionnel lumineux-zone chromogène multiplex IHC a des limites car il est souvent difficile de distinguer de multiples signaux de couleur sur une section de tissu unique fiable — surtout pour les antigènes avec une expression très faible⁴. Évaluation visuelle et la quantification de coloration peuvent aussi être subjectives, provoquant la variabilité dans l’analyse et les données interprétation⁵.

IHC classique sur des échantillons (FFIP) fixés au formol, paraffine n’est donc pas possible pour la détection simultanée de multiples cibles immunologiquement diverses maladies comme le lymphome. En outre, la distinction lymphocytes néoplasiques des cellules immunitaires environnantes est souvent imprécise. Cela empêche les études examinant la pertinence de nouveaux biomarqueurs dans le lymphome. Dans ce contexte, multiplexe fluorescent IHC (mf-IHC) offre une alternative prometteuse, car il permet l’évaluation quantitative de la coexpression de l’antigène et une relation spatiale avec une plus grande précision tout en conservant un limité d’échantillons^6,7. Lorsque cette technologie d’imagerie est en partenariat avec le logiciel d’analyse de l’image numérique, l’interprétation des données est rendue plus efficace et facilite l’étude de la tumeur et microenvironnement hétérogénéité^8,9. Dans ce protocole, une base tyramide immunofluorescence (IF) méthode de multiplexage est appliquée pour amplifier le signal et est compatible avec n’importe quel anticorps IHC-validé de toute espèce d’hôte, même ceux mis au point à la même espèce^{5,7 , 10}. le protocole tyramide permet la conjugaison directe du fluorophore au tissu d’intérêt pour que les anticorps primaires et secondaires peuvent être dépouillés après chaque étape, permettant l’application séquentielle de plusieurs taches sans la réactivité des anticorps.

Une stratégie multiplexée sera utile pour prédire le pronostic et le traitement des résultats par l’identification des cibles et leurs profils immunologiques variant dans les lymphomes. Multiplexe fluorescent IHC a été appliquée dans notre laboratoire pour l’étude d’un panel de marqueurs T et les lymphocytes B et T-folliculaire d’assistance dans le lymphome de T-cellule d’angioimmunoblastic (AITL), un sous-type d’un lymphome à cellules T périphérique caractérisée par agressivité clinique comportement et tumeur hétérogénéité¹¹. L’utilité de cette méthode est également illustrée en diffus grand lymphome B (LMNH) où la signalisation accrue d’un récepteur des cellules B avec l’expression simultanée de C-MYC et BCL-2 suggère l’utilisation thérapeutique potentielle d’inhibition de la tyrosine kinase de Bruton ¹² .

Nous décrivons ici l’ensemble du protocole de validation de l’anticorps à la sélection des tissus appropriés de contrôle et de multiplexage à l’aide de lymphome FFIP tissus, avec une éventuelle analyse de lames colorées en utilisant un balayage automatisé d’imagerie quantitative pathologie système.

Protocole

Tous les tissus utilisés dans le présent protocole ont été obtenus sous la Singapour NHG domaine spécifique Review Board B étudier 2014/00693.

1. sélection et Validation des anticorps

Remarque : Avant de procéder à la mise en place d’un panneau de multiplex, assurez-vous que tous les anticorps tachent robuste, identifiant uniquement l’antigène cible d’intérêt. Le but est de sélectionner des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l’antigène d’intérêt dans des sections de tissu.

1. Pour un anticorps avec utilisation de recherche bien établies, ou utilisation clinique courante dans IHC, confirmer les conditions tels que la dilution de récupération et d’anticorps epitope en effectuant des classiques IHC^5,13 sur les tissus de témoins positifs et négatifs sections. Pour des coupes de tissus d’origine humaine, faire en sorte que les dégagements de déontologie appropriés soient en place avant d’entreprendre des expériences.
   Remarque : Des contrôles positifs sont les tissus qui sont censés exprimer l’antigène d’intérêt et contrôles négatifs sont ceux qui ne le font pas. Tissus d’amygdales bénigne sont choisie comme un contrôle de bon tissu pour les antigènes de lymphome car il contient un mélange de cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules T et cellules présentatrices d’antigène, ainsi que les cellules stromales et épithéliales. Ces derniers servent de contrôles internes négatives utiles.
2. Pour cibles inconnues ou anticorps commerciaux ayant pas suffisamment de données publiées, effectuer la validation de l’anticorps en créant le positif correspondant et cellule FFIP contrôle négatif bloque¹⁴, à l’aide de CRISPR knock out ou siRNA précipitation de l’antigène d’intérêt dans une lignée de cellules appropriées grâce à des techniques de la biologie moléculaire standard. Utiliser ces blocs de cellules FFPE en remplacement de tissus témoins positifs et négatifs pour IHC conventionnel comme par l’Etape 1.1.
   Remarque : Les cellules HeLa ou 293 t sont couramment utilisés pour les antigènes qui ne sont pas de type cellulaire spécifique, car les lignées de cellules de lymphome sont difficiles à transfecter. Pour les antigènes qui sont spécifiques des lymphocytes, lignées de cellules de lymphome peuvent servir avec transduction virale ou électroporation comme le mode de livraison de gène (quoique avec une efficacité faible).

2. planification de la séquence des anticorps et des Fluorophores pour le panneau Multiplex

1. Planifier la séquence des réactifs pour la coloration multiplex final. Par exemple, ici la séquence du protocole multiplex a été initialement prévue comme premier, Bcl-6 ; Deuxièmement, Bcl-2 ; Troisièmement, C-Myc ; quatrième, CD20 ; Cinquièmement, Ki67.
   Remarque : Pour décider de la séquence, anticorps ayant une affinité faible nécessitant des concentrations plus élevées devraient être teint tout d’abord la coloration multiplex final. Des anticorps de haute affinité qui risquent d’être résistant à plusieurs séries de décapage des micro-ondes sont appliqués en dernier dans le protocole multiplex pour éviter la coloration non spécifique.
2. Plan le fluorophore de partenaire pour chacun des anticorps dans le panneau. Voir le tableau 1 et Table des matières pour les choix dans cet exemple.
   Remarque : Pour choisir le partenaire de fluorophore pour chacun des anticorps, choisissez fluorophores spectralement distinctes pour les anticorps ayant des profils similaires de localisation au sein de la cellule et les tissus. Cela réduira le chevauchement spectrale et la difficulté avec la déconvolution.

3. Monoplex Tyramide-base dans le cas d’un panneau de Multiplex 5-plex simulé

Remarque : Dans cet exemple, le protocole pour CD20 on discute, qu’il est prévu que l’anticorps quatrième dans une séquence multiplexe décrite ci-dessus. Le nombre d’étapes supplémentaires de décapage sera différente pour la position de l’anticorps dans la séquence.

1. Coupes 3 µm-mince de tissu de témoins positifs et négatifs à l’aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope.
2. Déparaffinage les sections à l’aide d’une solution de compensation appropriée 3 x 4 min chaque. Réhydrater les diapositives d’alcool à 100 %, alcool à 90 % et 70 % d’alcool, 4 min chaque. Placer les lames dans l’eau distillée pendant 2-3 min.
3. Déposer les lames dans un bocal en verre résistant aux micro-ondes dans un tampon d’extraction antigène standard (disponible dans le commerce) pour plonger les lames. Effectuer la chaleur démasquage par (HIER) à l’aide de micro-ondes adapté, en solution de récupération pH9 antigène à 98 ° C pendant 25 min.
   Remarque : N’importe quel micro-onde avec une pression allant de 800-1 100 Watts peut être utilisé, et HIER peut être optimisée en conséquence. Dans ce cas, un traitement de tissu micro-ondes multifonctions (ouvert à l’air) a été utilisé pour HIER et décapage. Les paramètres initiaux pour la récupération d’un épitope particulier sont basés sur la connaissance préalable de l’IHC classique.
4. Effectuer des rondes supplémentaires de micro-ondes décapage (trois dans ce cas, pour le quatrième anticorps dans un panneau), chaque tour avec 100 % de puissance à 98 ° C et 20 % pendant 10 min afin de maintenir la même température. Refroidir les lames dans l’eau distillée pendant au moins 10 min.
   Remarque : Effectuez plusieurs séries de micro-ondes décapage durant l’étape de IF monoplex pour exposer l’antigène cible pour le même nombre d’étapes comme dans le multiplex proposé de chauffage. Depuis CD20 est prévu que l’anticorps quatrième, mettez au micro-ondes 3 x avant et une fois après avoir fait l’incubation de l’anticorps primaire de décapage.
5. Vérifier et de reconstituer la mémoire tampon après toutes les 5 min pendant le stripping micro-ondes supplémentaires. Surtout, ne laissez pas diapositives dessécher pendant les opérations de décapage multiples. Lorsque vous prenez la glisse hors du micro-ondes, utiliser forceps et des gants résistant à la chaleur pour les placer dans un pot séparé de l’eau distillée. Attendez que la solution de récupération de l’antigène refroidir naturellement.
6. Bloquer l’activité peroxydase de tissus en utilisant un bloc commercial peroxydase pendant 10 min (peroxyde d’hydrogène 3 % peut être utilisée comme réactif remplaçant). Lavage avec une solution saline tamponnée Tris (SCT) et un détergent non ionique pendant 5 min.
   NOTE : SCT est composé de 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 et 150 mM NaCl.TBS de faire du SCT-D.
7. Bloc avec diluant d’anticorps ou d’albumine de sérum pendant 15 min, suivie d’une incubation avec l’anticorps primaire d’intérêt (p. ex., CD20, 1:2,000 dilution dans le diluant de l’anticorps, voir Table des matières) à température ambiante pendant 30 min. laver 3 x avec TBS-D tampon pendant 5 minutes chaque fois. Il devrait y avoir suffisamment tampon TBS-D de plonger la lame complètement dans toutes les étapes de lavage.
   Remarque : L’albumine sérique Bovine peut être utilisé comme un autre anticorps diluant. Le volume de diluant anticorps dépend de la taille du tissu, allant de 50 µL (pour les échantillons de biopsie) à 400 µL (pour les échantillons de l’excision ou des échantillons de tissu microarray).
8. Incuber à une peroxydase de raifort approprié (pr)-anticorps secondaire, choisi en fonction de l’espèce d’origine de l’anticorps primaire pendant 15 min à température ambiante. Laver 3 fois avec le tampon TBS-D pendant 5 min chaque fois.
9. Appliquez un approprié basé sur tyramide réactif fluorescent (1/100 dans l’amplification diluant) et incuber à température ambiante pendant 5 min, afin de permettre un fluorophore conjugaison à l’échantillon de tissu sur les sites de liaison de l’anticorps primaire. Laver 3 fois avec le tampon TBS-D pendant 5 min chaque fois.
10. Effectuer un décapage d’axée sur les micro-ondes supplémentaires pour éliminer les anticorps primaires et secondaires. Répéter au besoin basé sur la position de l’anticorps dans la séquence.
11. Placez la lame dans l’eau distillée pour refroidir. Incuber au DAPI (dilution au 1/100 dans le diluant anticorps) pendant 10 min, suivie de lavage 3 x avec le tampon TBS-D pendant 5 minutes chaque fois. Séchez la zone sur la lame sans le tissu avec des lingettes et monter la diapositive avec supports de montage approprié.
12. L’image de la diapositive (voir sections 6 et 7 du présent protocole) et déterminer l’à-propos de la coloration (tel que défini par une discrimination manifeste des tissus témoins positifs et négatifs).
    Remarque : Si le motif de coloration est incorrect, refaire la monoplex coloration après avoir réglé une ou plusieurs des paramètres suivants : le nombre de récupération de chaleur les étapes, le montant de la récupération de la chaleur, la période d’incubation/concentration d’anticorps (primaire et secondaire), la position des anticorps dans la séquence et le choix du fluorophore. La monoplex étape de coloration généralement nécessite plusieurs cycles d’optimisation pour obtenir un ensemble approprié de paramètres pour une coloration appropriée. Il est conseillé de tester une gamme de fluorophores avec chaque anticorps primaire, comme cela vous donnera la flexibilité pour décider de la dernière série de multiplexe.

4. répétition de la Monoplex pour chacun des anticorps dans le protocole Multiplex

1. Répéter le monoplex coloration pour les autres anticorps de façon similaire, en ajustant le nombre de mesures, basés sur la position de l’anticorps dans la séquence de décapage à micro-ondes. Par exemple, lors de l’exécution monoplex de coloration pour l’anticorps troisième dans un panneau de multiplex de six-plex, effectuer deux étapes de décapage micro-ondes avant et trois étapes de décapage de micro-ondes après l’incubation de l’anticorps primaire.
   Remarque : Il est important de comprendre que le décapage axée sur les micro-ondes des anticorps expose également l’exemple d’HIER. Si un anticorps spécifique nécessite une stratégie de récupération différents épitopes, ceci doit être pris en compte lors de la planification de la séquence multiplexe. Dans cet exemple, Ki67 démasquage nécessite pH 9, pendant 30 min. Étant donné que 25 min d’HIER se fera avant KI67 coloration dans le protocole séquentiel, seulement 5 min supplémentaire d’HIER sont nécessaires.

5. multiplex souillant le protocole

Remarque : Passez avec le multiplex souillant le protocole qu’une fois tous les composants ont été optimisées à l’aide de monoplex si la coloration. Examiner les résultats de la coloration monoplex et concevoir un tableau montrant la disposition finale de l’ordre de multiplex et le choix du fluorophore pour chacun des anticorps. La concentration d’anticorps, la durée de la coloration et la séquence et la nature de la récupération de chaleur pour chaque anticorps utilisé ici sont en détail dans le tableau 1.

1. Sections de coupe 3 µm-mince de tissu de témoins positifs et négatifs, ainsi comme le tissu de cible d’intérêt (ici, échantillons FFPE de lymphome), aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope (voir Table des matières).
   NOTE : Inclusion des contrôles positifs et négatifs pour chaque anticorps dans le panneau est conseillable, ainsi que les échantillons réels pour multiplex. Cela permet une confirmation que le protocole de coloration a été effectué correctement.
2. Déparaffinage, effectuer le démasquage par chaleur (HIER) et bloquer l’activité peroxydasique tissu comme dans les étapes de protocole monoplex 3,3 à 3,5.
3. Incubation avec l’anticorps primaire premier de la séquence de multiplexe optimisée, comme précédemment déterminée à l’aide de l’étape de IF monoplex. Dans cet exemple, BCL-6, à un 01:30 dilution en anticorps diluant à température ambiante pendant 60 min (voir Table des matières), a été la première étape du protocole multiplex. Laver avec le tampon TBS-D pendant 5 min.
4. Incubez avec un anticorps secondaire marqué au HRP approprié basé sur l’espèce de l’anticorps primaire utilisé dans l’avant étape (voir la Table des matières) à température ambiante pendant 10 min. Lavez avec un tampon TBS-D pendant 5 min.
5. Appliquer l’optimisé axée sur les tyramide fluorescent réactif (Cy5 dans cet exemple, 1/100 dans le diluant de l’amplification, voir Table des matières) avec une incubation à température ambiante pendant 5 min. Après l’incubation, laver avec le tampon TBS-D pendant 5 min.
   Remarque : Le choix du réactif fluorescent axée sur la tyramide repose sur la monoplex optimisée si.
6. Vérifier l’efficacité de la coloration du premier anticorps à l’aide d’un microscope approprié (voir la Table des matières).
   NOTE : Intérimaire d’imagerie des chèques peut être fait avec une facilité si l’échantillon est une TMA ou une seule diapositive. Si, toutefois, la tache est effectuée sur plusieurs diapositives, c’est peut-être peu pratique, et cette étape peut être omise.
7. Effectuer des micro-ondes décapage pour le deuxième anticorps dans le protocole, à l’aide de conditions optimisées à l’étape de monoplex. Ensuite, procéder à la coloration de l’anticorps primaire deuxième (en l’occurrence, BCL2) avec l’anticorps secondaire marqué au HRP et réactif fluorescent à base de tyramide (ici, 520, voir Table des matières). Vérifier l’efficacité de la coloration sous un microscope à fluorescence à l’issue du second tour de la coloration.
8. De même, répétez la procédure à l’aide de la troisième, quatrième et cinquième anticorps dans la séquence (ici, c-Myc, CD20 et ki67, respectivement, avec des fluorophores 570, 540 et 620, respectivement). Effectuer des contrôles d’imagerie entre chaque étape si possible.
9. Ajouter un contre-colorant nucléaire (DAPI, dilution au 1/100 en anticorps diluant) pendant 10 min et, ensuite, laver 2 x à SCT-D pendant 5 minutes chaque.
10. Monter les diapositives à l’aide d’un réactif de fixation appropriée.

6. préparation de diapositives spectrales bibliothèque

NOTE : Articles 6 à 8 du présent protocole sont uniques à multiplexé des expériences qui sont imagés à l’aide d’une caméra spectrale.

1. Créer bibliothèque de diapositives (images de référence de single-tache) pour chaque fluorophore, DAPI et autofluorescence sur le tissu témoin même, à utiliser pour l’analyse d’image multispectrale.
   1. Couper des sections de 2 x 3 µm-mince de type tissulaire d’intérêt (ici, un échantillon de lymphome ou une amygdale comme contrôle) à l’aide d’un microtome et déposer les éléments sur lames de verre enduits poly-L-lysine microscope.
   2. Processus les deux diapositives utilisant le protocole de monoplex (avec tous les dépouiller et étapes de lavage), mais sans addition d’anticorps ou fluorophore.
   3. Colorer une diapositive au DAPI comme par l’Etape 5,9 et laisser une diapositive non souillées enregistrée (pour la génération du spectre autofluorescence tissulaire).
      Remarque : Les lames de monoplex optimisée (avec une teinture de fluorescence unique, sans DAPI) utilisable comme bibliothèque spectrale diapositives pour générer des spectres de chaque colorant de fluorescence.
2. Numériser ces ensemble de diapositives à l’aide de filtres appropriés et les télécharger dans la bibliothèque de l’analyse d’images.

7. spectral Imaging

1. Numérisation de diapositives monoplex
   1. Choisir les filtres de filtres disponibles épifluorescente standard (DAPI, FITC, CY3, Texas Red et CY5) appropriés pour le fluorophore indépendant.
      Nota : Les cubes de filtre recommandé pour des fluorophores spécifiques utilisés dans cet exemple sont montrées dans le tableau 2¹⁵.
   2. Examinez chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant pour identifier un temps d’exposition approprié pour obtenir un signal propre. Mettre l’accent sur la composante tissulaire qui est censé pour avoir le signal le plus fort pour le marqueur.
   3. Déterminer un temps d’exposition fixe pour chaque analyte (combinaison anticorps-fluorophore), pour permettre une comparaison croisée-échantillon d’intensité pixel (bien que certaines plates-formes commerciales ont des stratégies de normalisation pour tenir compte des différences dans l’exposition).
      1. Pour statuer sur une durée d’exposition fixe pour une chaîne donnée, utiliser un réglage de la caméra en direct pour régler la durée d’exposition jusqu'à ce qu’il n’y a pas de zones surexposées à l’image de la caméra en direct et répétez cette opération pour tous les canaux.
   4. Après la numérisation des diapositives monoplex, générer des images de fond clair simulée (si la fonction n’est disponible dans le logiciel utilisé) pour comparer visuellement le modèle normal de l’IHC et déterminer si le modèle de coloration est correct (Figure 1 et Figure 2 de ).
2. Analyse des échantillons de multiplexes (TMA diapositives / échantillons multiples)
   1. Définir les paramètres optiques tel que décrit pour la numérisation des images monoplex (étape 6.1). En premier lieu, régler la netteté manuellement ou automatiquement (suivez les instructions de l’image spécifique machine à balayage). Deuxièmement, régler le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent pour s’assurer que tous les cœurs sur une TMA, ou toutes les zones sur une diapositive, sont correctement exposés.
      Remarque : La zone sélectionnée pour ajuster la durée d’exposition est importante. Les utilisateurs doivent choisir la région de signal plus forte pour chaque filtre (c.-à-d.le signal de Ki67 est plus fort dans la région de centre germinatif amygdale que dans la région centre non ; par conséquent, les utilisateurs doivent utiliser la région de centre germinatif fixé à une exposition appropriée temps). Les utilisateurs peuvent adopter également une fonction de correction de sursaturation de l’appareil d’imagerie si elles sont disponibles.
   2. Numériser des diapositives TMA sous un mode balayage TMA s’ils sont disponibles dans le système d’imagerie, avec un algorithme approprié autofocus.
   3. Pour les lames de section de l’ensemble des tissus, téléchargez les diapositives examinés par un pathologiste qualifié pour sélectionner images optimales dans les zones plus représentatives de la tumeur.
      Remarque : Le protocole décrit ici est basé sur un système d’analyse microscope/image définie (voir Table des matières). Il y a des autres machines et logiciels d’analyse image pouvant lire et analyser les multiplex IHC diapositives⁷.

8. analyse des données

1. Planification et évaluation préanalytique
   1. Utilisez la diapositive de référence pour l’autofluorescence pour soustraire l’autofluorescence à partir des images numérisées pour l’analyse.
   2. Revoir les images avant l’analyse pour s’assurer qu’ils sont en discussion et sans tacher les artefacts.
   3. Utiliser un marqueur de tumeur (par exemple, CD20 dans cet exemple) pour identifier les cellules d’intérêt et de procéder à la segmentation de la cellule, cotation et analyse de lots s’approche. Sélectionnez les cellules CD20-positifs pour l’analyse.
      NOTE : par exemple, dans le LMNH échantillons analysés ici, le réglage et les paramètres définis pour la segmentation cellulaire reposent sur la taille du noyau et d’intensité, mais sont spécifiques au logiciel d’analyse de l’image utilisé (p. ex., un DAPI pixel intensité moyenne d’au moins de 0,05 ; taille entre 80-320 pixels, avec une sensibilité de fractionnement à 2 [il s’agit d’un paramètre de logiciel spécifique qui s’appuie fortement sur la morphologie de la tumeur : pour les cellules de petite tumeur, fractionnement de 0,7 - 1 convient ; pour les cellules tumorales grandes, fractionnement peut être réglé vers le haut à 4]).
   4. Demande d’un pathologiste qualifié d’examiner des images individuelles et de décider si la segmentation de tissu est requise pour sélectionner la cellule tumorale enrichi en régions et exclure les cellules réactives abondante nécrose arearegion orand. Si segmentation de tissu supplémentaire est nécessaire, puis sélectionnez les régions de contrôle approprié (par exemple tumeur cellules/stroma/nécrose) et vérifier que le logiciel d’analyse de l’image peut identifier correctement ces régions
   5. Aller de l’avant avec la segmentation cellulaire après segmentation du tissu (le cas échéant), demande un pathologiste qualifié pour examiner le plan de segmentation cellulaire pour garantir la fidélité de la segmentation prévue approche⁵.
   6. Déterminer la méthode la plus biologiquement/cliniquement appropriée d’analyse pour un biomarqueur donnée d’intérêt (par exemple, pourcentage de positivité ou moyenne intensité par cellule).
   7. Choisir une valeur de seuil pour chaque marqueur (par pourcentage de positivité).
   8. Déterminer la valeur de seuil positif d’intensité optique pour chaque marqueur en conjonction avec un pathologiste. Générer des histogrammes en analysant la distribution des fréquences de la cellule/intensité de marqueur dans le logiciel de statistiques appropriées (voir Table des matières).
      Remarque : Un histogramme de valeur d’intensité peut offrir un aperçu de la distribution des intensités du signal.
   9. Déterminer un seuil approximatif de l’histogramme et le vérifier par un examen du pathologiste, en corrélation avec les seuils déterminés manuellement sur des images sélectionnées. Dans certaines situations, un seuil unique uniform ne sera pas possible en raison de la variabilité dans la coloration, et il faudra une valeur de coupure manuelle pour chaque échantillon.
      NOTE : L’article 8.1 se fasse dans le logiciel d’analyse image (voir la Table des matières) sauf indication contraire.
2. Marquage des cellules positives et négatives
   1. Pour chaque marqueur d’intérêt, selon le nombre de seuil déterminé (à travers des histogrammes ou manuellement), utiliser un « IF » ou formule logique similaire pour marquer les cellules positives et négatives avec marqué valeur : numéro 1 pour les cellules positives, numéro 0 pour les cellules négatives.
   2. La positivité de tous les marqueurs, multipliez la valeur nette de chaque marqueur (1 ou 0) avec les produits dans des colonnes distinctes. Si le produit est égal à 1, cela signifie que la cellule est positive pour tous les marqueurs. Pour la positivité et négativité d’un marqueur spécifique, utilisez un algorithme de logique IF.
      NOTE : L’article 8.2 doit être fait dans les logiciels de statistiques (voir Table des matières).
3. Générer des données de pourcentage et de données numériques à l’aide d’un tableau croisé dynamique
   1. Générer des données de pourcentage pour des marqueurs spécifiques d’intérêt, au sein des cellules déterminées (par exemple, CD20 positif de cellules ou cellules négatives CD20) (Figure 6).
   2. Insérer un tableau croisé dynamique dans la feuille de données.
   3. Pour calculer le pourcentage de positivité d’un seul marqueur, comme CD20, sélectionnez la fonction somme en vertu de la partie de la valeur du tableau croisé dynamique pour compter le nombre total de cellules CD20-positifs à l’aide de la somme de la CD20⁺ cellules divisé par la nombre total de cellules. Le résultat est le CD20⁺ cellule pourcentage dans une carotte ou une étude nombre (dépend de la sélection de la ligne de table pivot).
   4. Calculer le pourcentage de positivité des marqueurs multiples en utilisant la même méthode (Figure 3).
   5. Générer des données numériques. Extrait le nombre normalisé médian pour chaque marqueur de chaque carotte ou le numéro de chaque étude en obtenant l’intensité moyenne de chaque marqueur d’intérêt dans toutes les cellules étudiées dans un échantillon (Figure 4).
      Remarque : La valeur médiane ne peuvent pas être dérivée directement dans le tableau croisé dynamique. Il peut être dérivé à l’aide de cette formule : médiane (IF (colonne d’étude nombre = nombre d’étude spécifique, colonne de valeur normalisée)).
4. Tracer les données dans un graphique approprié
   1. Tracer les résultats du pourcentage de positivité ou médiane intensité par marqueur dans un type de cellule d’intérêt de manière appropriée pour les autres analyses statistiques et de présentation.
   2. Créer des emplacements de point de fournir une visualisation du nombre et de la distribution.
      NOTE : Qui représentent des données avec des graphiques à barres n’implique pas d’informations sur la distribution. Estimation de parcelles sont aussi recommandés une bonne méthode de représentation des données, en mettant l’accent sur l’ampleur de la différence entre les échantillons¹⁶.

Résultats

MF-IHC image pour un échantillon de LMNH avec C-MYC et réarrangement génique de BCL2 (double-hit lymphome) sont affichées à la Figure 1. La figure 2 illustre les images simulées lumineux-zone immunohistochimique. La figure 3 indique la génération des données de pourcentage. La figure 4 affiche les détails d’une formule médiane pour la génération de donnée...

Discussion

MF-IHC a le potentiel pour permettre des pathologistes d’affiner diagnosticcriteria en pathologie lymphoïde et d’analyser le rôle des biomarqueurs dans les types spécifiques de cellules vers une prévision des résultats cliniques. Comme une nouvelle méthode de recherche, mf-IHC est plus appliquée à la détermination quantitative et spatiale des multiples paramètres immunitaires des cellules de tumeur¹⁷. La détection de mf-IHC pour la co-expression de biomarqueurs de la tumeur s’est ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	REF S3022	Blocking
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope	Perkin Elmer	Vectra2.0.8	Spectral imaging
absolute Ethanol	EMSURE	1.00983.2500	Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent	PERKIN ELMER	FP1135	Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF822001EA	Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF812001EA	Secondary antibody
BCL2	DAKO	clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)	primary antibody
BCL6	LEICA	NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)	primary antibody
CD20	DAKO	Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)	primary antibody
c-MYC	ABCAM	Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)	primary antibody
Cy 5	PERKIN ELMER	FP1171	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7	Graph pad		Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent	SIGMA	H2779-1L	Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	Inform Software 2.2.1	Data Analysis software
KI67	DAKO	Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)	primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor	Milestone		Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave	PANASONIC	NN-ST651M	Microwave stripping
Mowiol	SIGMA ALDRICH	81381 Aldrich Mowiol® 4-88	mounting media
Opal 570	PERKIN ELMER	FP1488	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520	PERKIN ELMER	FP1487B21	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540	PERKIN ELMER	FP1494	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620	PERKIN ELMER	FP1495	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI	PERKIN ELMER	FP1490	nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)	DAKO	S2367	For HIER
Tris Buffer saline (TBS)	1st BASE	BUF3030 20X4L	for buffer wash
Tween 20	SIGMA ALDRICH	P1379-1L	Tween