إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Summary

هذا البروتوكول على حد سواء بصريا يتصل إعداد الحبل الشوكي الدماغ وتوضح إعداد شرائح عرضية جذع الدماغ بطريقة تدريجية شاملة. أنه صمم لزيادة إمكانية تكرار نتائج وتعزز احتمال الحصول على شرائح قابلة للاستمرار، وطويلة الأمد، إيقاعي نشطة لتسجيل الإخراج العصبية من مناطق الدماغ الجهاز التنفسي.

Abstract

يتم إنشاء إيقاع الشهيقيه الثدييات من شبكة الخلايا العصبية في منطقة لب يسمى preBötzinger في مجمع (pBC)، التي تنتج إشارة القيادة الإيقاعي انكماش العضلات الشهيقيه. النشاط العصبي الإيقاعية المتولدة في لجنة البرنامج والميزانية وإلى تجمعات الخلايا العصبية الأخرى لمحرك الأقراص قد درس عضلات التنفس باستخدام مختلف النهج، بما في ذلك كتلة من الأعصاب التسجيلات والتسجيلات شريحة عرضية. ومع ذلك، أساليب سبق نشرها لا على نطاق واسع وصف عملية تشريح النخاع الشوكي الدماغ بطريقة شفافة واستنساخه للدراسات المستقبلية. هنا، يقدم نظرة شاملة لأسلوب يستخدم لتكاثر قطع شرائح الدماغ النشطة إيقاعي يحتوي على الدوائر العصبية ضرورية وكافية لتوليد ونقل محرك الأقراص الشهيقيه. يستند هذا العمل إلى الحبل الشوكي الدماغ الكهربية البروتوكولات السابقة تعزيز احتمال موثوق بها الحصول على شرائح قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة لتسجيل إخراج الخلايا العصبية من لجنة البرنامج والميزانية، الخلايا العصبية premotor hypoglossal (المجنحة الثاني عشر)، و هيبوجلوسال الخلايا العصبية الحركية (بالمليون الثاني عشر). ويتوسع العمل قدم الطرق المنشورة السابقة بتقديم توضيحات مفصلة، خطوة بخطوة للتشريح، من الفئران كله ألجرو، إلى شريحة في المختبر الذي يحتوي على rootlets الثاني عشر.

Introduction

وتوفر الشبكة العصبية الجهاز التنفسي من جذع الدماغ مجال خصبة لفهم الخصائص العامة للشبكات العصبية الإيقاعي. على وجه الخصوص، المصلحة في تطوير القوارض الولدان في التنفس، وفهم كيفية تطور إيقاع التنفس. وهذا قد يكون تم استخدام نهج متعدد المستويات، بما في ذلك فيفو بليثيسموجرافي الحيوان كله، في المختبر كتلة تسجيلات العصبية، وفي المختبر شريحة التسجيلات التي تحتوي على مولد إيقاع التنفس. الاختزالية في المختبر أون الكتلة وشريحة التسجيلات طريقة مفيدة للاستخدام عند استجواب الآليات وراء رهيثموجينيسيس الجهاز التنفسي والدوائر العصبية في منطقة الحبل الشوكي الدماغ النامية القوارض. ويشمل تطوير الجهاز التنفسي تقريبا أنواع الخلايا 40، تتميز بإطلاق النار النمط، بما في ذلك الجهاز التنفسي المركزي^1،2. وتشمل الشبكة الجهاز التنفسي وسط مجموعة من الخلايا العصبية نشطة إيقاعي يقع في لب فينترولاتيرال روسترال^،من¹³. يتم إنشاء رهيثموجينيسيس الرئوي الثدييات من أوتورهيثميك إينتيرنيورون الشبكة التي يطلق عليها اسم preBötzinger معقدة (pBC)، التي كانت مترجمة تجريبيا عن طريق التحضير الكتلة شريحة واون من الثدييات حديثي الولادة جذع الدماغ-الشوكي الحبال^3،4،،من^56،،من⁷⁸. يؤدي وظيفة مماثلة للعقدة sinoatrial (SA) في القلب هذه المنطقة ويقوم بإنشاء نظام توقيت الشهيقيه للتنفس بالسيارة. ويتم إيقاع الشهيقيه من لجنة البرنامج والميزانية، إلى مناطق أخرى في جذع الدماغ (بما في ذلك نواة موتور hypoglossal) وتجمعات السيارات العمود الفقري (مثل فرنك الخلايا العصبية الحركية التي تدفع الحجاب الحاجز)⁹.

النشاط الإيقاعي يمكن الحصول عليها باستخدام جذع الدماغ الحبل الشوكي أون الكتلة الاستعدادات أو شرائح من مجموعة متنوعة من السكان الخلية، بما في ذلك C3 C5 العصب rootlets، rootlets العصب الثاني عشر، نواة موتور hypoglossal (بالمليون الثاني عشر)، والخلايا العصبية premotor hypoglossal (ثاني عشر المجنحة)، و لجنة البرنامج والميزانية^3،10،،من¹¹¹². بينما نجحت هذه أساليب جمع البيانات عبر عدد قليل من المختبرات، العديد من البروتوكولات لا تعرض بطريقة يتم استنساخه بالكامل للباحثين الجديد دخول الميدان. يتطلب الحصول على قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة في التحضيرات الكتلة وشريحة اهتمام حاد بالتفصيل من خلال جميع الخطوات للتشريح وبروتوكول قطع شريحة. البروتوكولات السابقة على نطاق واسع تصف مختلف إجراءات التسجيل والكهربية، ولكن تفتقر إلى التفاصيل في الجزء الأكثر أهمية للحصول على إعداد أنسجة قابلة للتطبيق: تنفيذ إجراء تشريح وشريحة الحبل الشوكي جذع الدماغ.

يتطلب كفاءة الحصول على تحضير الكتلة أو شريحة إيقاعي نشطة وقابلة للتطبيق في الحبل الشوكي الدماغ الكهربية تسجيلات إجراء جميع الخطوات بشكل صحيح، بعناية وسرعة (عادة، الإجراء برمته ذات الصلة يمكن أن تكون هنا إجراء حوالي 30 دقيقة). وتشمل النقاط الحرجة البروتوكول الكهربية الحبل الشوكي الدماغ التي قد لا مسبقاً كذلك وصفت تشريح العصب rootlets وإجراء تشريح على فيبرتوم. هذا البروتوكول الأول من التدرجي مرئي تشريح النخاع الشوكي الدماغ جديد من الباحثين والخبراء في هذا المجال. ويوضح هذا البروتوكول أيضا دقة التقنيات الجراحية، والمعالم، وغيرها من الإجراءات لمساعدة الباحثين مستقبلا في توحيد شرائح و كتلة الأعمال التحضيرية لاحتواء الدوائر الدقيقة المطلوبة في كل تجربة. يمكن استخدام الإجراءات المعروضة هنا في الجراء الولدان الجرذ والفأر.

Protocol

تم قبول البروتوكول التالي ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة لوما ليندا. يتم اتباع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للمعاملة الأخلاقية للحيوانات في جميع التجارب على الحيوانات في المختبر. وقد أيدت جميع المعايير الأخلاقية الأفراد الذين يؤدون هذا البروتوكول.

1-الحلول

1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام).
   1. إعداد جديدة قام مساء اليوم أمام تجربة في دفعات 1 لتر باستخدام ما يلي وصفه: 7.250 ز كلوريد الصوديوم (124 ملم)، 0.224 ز بوكل (3 مم)، 2.100 ز ناكو₃ (25 مم)، 0.069 ز نة₂بو₄ • ح₂س (0.5 ملم)، 0.247 ز مجسو₄ • 7 ح₂ O (1.0 مم)، و 5.410 ز د-الجلوكوز (30 مم)، ز 0.221 كاكل₂ • 2 ح₂س (1.5 مم). دائماً إضافة كاكل₂ • 2 ح₂س آخر.
   2. يذوب المكونات في 1 لتر مياه. يحرك لمدة 20-30 دقيقة.
   3. قياس درجة الحموضة من قام وضبط إلى 7.40 ± 0.02 استخدام كميات صغيرة (عادة < 0.5 مل) من هيدروكسيد الصوديوم أو كوه أو HCl مخفف.
      ملاحظة: يمكن تخزينها في الثلاجة (4 درجات مئوية، ودرجة الحموضة 7.40 ± 0.02) قام مستعدا لمدة ثلاثة أيام قبل أن يؤثر النمو البكتيري على صلاحية الأنسجة أثناء تجربة. استخدم 0.2 ميكرون المرشحات لتقليل التلوث بالفطريات أو البكتيريا الموجودة في المختبر منذ التجارب يمكن أن تستمر ما يصل إلى 36 س. للكفاءة، قد الارتقاء بوصفه قام وصف لدفعات ل 4 بعد البروتوكول نفسه، وهذا الحجم سوف تستمر لمدة تصل إلى ثلاثة أيام تجارب.

2-إعداد التشريح وتلاعب فيبرتوم

1. إعداد شفرة.
   1. استخدام شفرات الحلاقة الطازج ذو حدين لقطع الأنسجة على فيبرتوم. أغسل الشفرة مع الإيثانول 100% والشطف بالمياه قبل قطع أو العض بليد في نصف وإدراج الشفرة في تصاعد المشبك في فيبرتوم.
   2. تغيير الشفرة كل مرة إعداد أنسجة جديدة هي التي شنت على فيبرتوم لتقطيع أو إذا تخفيضات في لوح البرافين بينما تشريح. أي بقايا البارافين سيجعل من المستحيل تقريبا قطع نظيفة من خلال الأنسجة العصبية في الأطفال حديثي الولادة.
2. قم بإعداد لوح شمع البارافين.
   1. استخدام أي شمع البارافين أسلوب التضمين. ضع 10 غم من تضمين الوسائط في كوب زجاج تتحمل حرارة واستخدام الحرارة المنخفضة لإذابة الخرز شمع البارافين للسائل.
   2. إضافة حوالي 0.5 غم مسحوق الجرافيت ومزيج حل شامل وموحد في البارافين السائل.
   3. استخدام لوح بلاستيكية صغيرة كالركيزة البارافين. قطع قطعة صغيرة (0.5-1 سم وما يقرب من 2 × 2 سم² على نطاق واسع) من البلاستيك (البولي أو الألومنيوم يمكن أيضا استخدامها). استخدام الملف في الماكنة الأخاديد التسويد في البلاستيك أستهيس سيضمن أن البارافين تتمسك بالبلاستيك.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام إبرة حقن ز 18 ساخنة على مكان الزاوية ثقوب في الورقة لضمان أن تلتزم البارافين-الجرافيت المخلوط بالبلاستيك.
   4. استخدام الجزء الخلفي من قضيب نصيحة القطن بالتنقيط مزيج البارافين-الجرافيت على البلاستيك بغمس قضيب في الخليط المنصهر البارافين-الجرافيت مرارا وتكرارا، وتتساقط الملاط على كتلة البلاستيك، وبناء البارافين-الجرافيت إلى حوالي 1.5 سم في سمك على رأس البلاستيكية.
   5. مجرد طبقة سميكة بما فيه الكفاية من مزيج البارافين-الجرافيت مودعة لدى الكتلة، تعيين كتلة جانبا لتبرد ثم الشكل لاستيعاب الحبل الشوكي جذع الدماغ.

3-تشريح وعزله نيوراكسيس

1. إجراء التشريح الأولى وأنيسثيتيزيشن.
   ملاحظة: الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة قد تتراوح في حجمها الجنينية يوم 18 (E18) بعد الولادة يوم 10-20 في الفئران أو الجرذان تتراوح E18 يوما بعد الولادة 5/6. يمكن استخدام الجرذان أو الفئران من أي سلالة أو العلاج، أو نوع الجنس، اعتماداً على التصميم التجريبي. إجراء التخدير والتشريح الأولى تحت غطاء دخان حيث يتم استخدام إيسوفلوراني (0.25 مل في دائرة 25 مل).
   1. وزن ألجرو وثم وضعه في دائرة تخدير ليحتوي على 0.25 مل إيسوفلوراني توضع على 2 × 2 بوصة² قطعة من الشاش. بعد وصول الحيوان إلى طائرة جراحية التخدير (يتم التحقق برشة أخمص القدمين مع لا انسحاب العاكسة)، دبوس الحيوان على طبق بيتري مليئة الاستومر البارافين أو السيليكون.
      ملاحظة: القوارض الولدان أيضا قد تكون تخديره عبر كريوانيسثيسيا^13،14, isoflurane تبخير¹⁵، أو حقن¹⁶ متوازنة مع الأكسجين.
   2. ضع الجانب البطني الحيوان إلى أسفل وجعل شق من خط الوسط من خلف العينين إلى منطقة منتصف القطني في العمود الفقري مع شفرة المبضع عدد 10 أو 11 أو المقص الجراحي. تعكس البشرة وديسيريبراتي الحيوان على مستوى خياطة الجداري/القفوية (انظر الشكل 1) وإزالة الجلد ترانسيكتينج الحيوان تحت الحجاب الحاجز. قم بإزالة الأسلحة بالقطع في مفصل الكتف مع مقص أو مشرط.
   3. بمجرد إزالة الجلد، نقل الحيوان إلى دائرة التروية مع سيليكون الاستوميرين الأسفل لمزيد من التشريح، وإعداد الحبل الشوكي جذع الدماغ.
   4. فقاعة خزان قام (زجاجة الجانب المنفذ 500 مل) بشكل مستمر مع المثلجة (4 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.40 ± 0.02) قام والأوكسجين مع خليط من 95% O₂ و 5% أول أكسيد الكربون₂ (وتسمى أيضا "كاربوجين"). أثناء التشريح، استخدام قام مبردة لمسح دورياً الدائرة بتوفير قام اﻷوكسيجين الطازجة في جميع أنحاء عزلة الحبل الشوكي جذع الدماغ.
      ملاحظة: يمكن رؤية خلايا الدم الحمراء في الشرايين والاوردة المتبقية، وعندما بما فيه الكفاية اﻷوكسيجين، هذه أحمر.
   5. استخدام نضح خطورة التدفق عبر الأنابيب ومحبس الحنفية، إلى بشكل متقطع أو بشكل مستمر نتخلل الأنسجة مع اﻷوكسيجين قام (بلعه وحدة التخزين، أو عن طريق بطيئة بالتنقيط استخدام محبس الحنفية, حوالي 0.5-1.0 مل/دقيقة). وهذا الأكسجين في الأنسجة ويحافظ على حقل جراحية واضحة.
   6. إزالة السوائل الزائدة حسب الحاجة بنظام الترشيح شفط فراغ.
   7. إجراء التشريح استخدام مجهر تشريح. ويفضل نموذج تكبير مستمر للسماح بتسوية غرامة للتكبير، والسماح للتصور الأمثل لمنطقة الاهتمام خلال كل خطوة من التشريح.
      ملاحظة: أدوات الجراحة أوصى تشمل طائفة من ملقط مسنن الأنسجة، الملقط حادة، الملقط #5، ملقط الأنسجة المائلة، طائفة من مقص تشريح الصغرى (مقص الربيع)، والحشرات منتظمة ودبابيس تشريح الصغرى.
   8. كشف الدماغ عبر خط منتصف الجزء من الجمجمة على طول خياطة السهمي ثم دبوس أسفل اللوحات ينعكس مع دبابيس صغيرة تشريح ودبوس في العمود الفقري في نهاية والذيلية إلى أسفل قاعة التشريح باستخدام ز 27 المغطاة سيليكون إبرة.
      ملاحظة: ويتطلب بقية التشريح مجهر تشريح توفير صورة أوضح للأنسجة والمعالم المستخدمة لضمان أقصى احتمال الحصول على إخراج وهمية الإيقاعي في rootlets الجمجمة للدماغ والعمود الفقري rootlets. تنفيذ الخطوات التالية للتشريح باستخدام مقص الربيع متوسطة أو قزحية مقص وملقط غرامة.
2. على الفور نقل جذع معزولة من الحيوان إلى غرفة تشريح التهوية. ضع الجانب الأنسجة الظهرية يصل مع نهاية روسترال (الدماغ) التي تواجه جبهة الدائرة. دبوس الأنسجة في الكتفين ونهاية والذيلية أكثر من الحبل الشوكي.
   1. جعل شق منتصف السهمي عن طريق الجمجمة بعد خياطة الجدارية لتجنب إتلاف اللحاء والدماغ الكامنة في الجمجمة.
      ملاحظة: نسيج العظام الأطفال حديثي الولادة هو ليس كاملا متكلسة وهو هش جداً. نسيج العظام/ستكون مرنة إلى حد ما، ولكن أكثر صرامة من الضامة المحيطة وأنسجة العضلات.
   2. استخدام مقص الربيع أو القزحية المتوسط لقص خيوط والقفويه الجمجمة، بدءاً خياطة السهمي وتعمل أفقياً. سيؤدي هذا إلى إنشاء "اللوحات" للجمجمة التي يمكن أن تنعكس والمثبتة لترسيخ الجزء روسترال من الجمجمة وتوفير بعض الاستقرار للأنسجة (انظر الشكل 2أ).
   3. بعد تعكس اللوحات الجمجمة، وقطع بقية قشرة الدماغ، تاركاً الجزء والذيلية من المخيخ (ودودة) سليمة نسبيا (الشكل 2ب).
3. أداء الصفيحة الظهرية.
   1. إزالة العضلات المحيطة بالجمجمة والعمود الفقري باستخدام مقص الربيع الصغير والملقط. إزالة الأنسجة على طول الجانب الظهرية من القفص الصدري، ترك القفص الصدري سليمة، كما أن هذا سوف يعلق لاحقاً إلى ربط الأنسجة أثناء الاستئصال البطني، تقليل فرصة الضرر للحبل الشوكي.
   2. قص بعناية بعيداً عمليات الأفقي عن العمود الفقري باستخدام مقص الربيع متوسطة أو مقص آيريس غرامة. قص بعيداً أي أنسجة تغمر بونس ولب. الآن ستكون مرئية بوضوح (الشكل 2ج) ودودة، المخيخ، بونس، وبداية من الحبل الشوكي.
4. إجراء الاستئصال البطني.
   1. رفض الجانب الأنسجة الظهرية ودبوس في القفص الصدري والأكثر والذيلية نهاية العمود الفقري. دبوس في الجانب روسترال من الأنسجة باستمرار استخدام اللوحات الجمجمة (الشكل 3أ).
   2. إزالة النصف البطني من القفص الصدري، بما في ذلك القص، وجميع أجهزة البطن باستخدام نفس المقص والملقط. تشريح الأنسجة اللينة بعيداً يعلق على القفص الصدري فضح الأضلاع والحبل الشوكي (الشكل 3ب).
   3. إزالة اللسان المريء والقصبة الهوائية، والحنجرة، وجميع الآخرين الأنسجة اللينة وعضلات تعلوها قاعدة الجمجمة والعمود الفقري (كما يتضح في الشكل 3ج).
   4. تشريح الأنسجة السطحية البالته الثابت. تحديد الحنك الصلب عن طريق تحديد موقع لوحة مستطيلة من العظام في قاعدة الجمجمة مع المسافة بادئة شكل الخامس على ذلك (الشكل 3ج). قص على طول خط الوسط للحنك، بعناية رفعه إلى أعلى، وأداء عرضية قطع لإزالته (الشكل 4أ).
   5. تبدأ الاستئصال البطني عن طريق إزالة عن تعريض السطح البطني جذع الدماغ والحبل الشوكي من أول فقرة سرطان عنق الرحم لحوالي الصدر فقرة 7 (T7) كما هو موضح في الشكل 4ب.
   6. وفي هذه المرحلة، سوف تكون rootlets البطني مرئية. استخدام تشريح مايكرو الصغيرة أو مقص الربيع، الحرص على جعل التخفيضات أقرب عن وكما بعيداً عن الأصل جذور في الحبل الشوكي قدر الإمكان؛ تجنب تمتد الجذور.
   7. 5-10 ملم على طول جانبي العمود الفقري في عن القصاصة. لا تقطع قريبة جداً للنخاع الشوكي أو في الفقرات. تسمح هذه الخطوة إزالة فقرات عنق الرحم للكشف عن الحبل الشوكي. تجنب قطع في rootlets.
   8. قص rootlets حوالي 20-25 مم (ثنائي) على طول العمود الفقري (T7 تقريبا). في جميع أنحاء هذا الإجراء تجنب قطع في الحبل الشوكي والتلاعب بحواف الفقرات كما هو موضح في الشكل 4ج.
   9. إزالة C1 و C2 و C3 برفع حافة روسترال لكل من الفقرات بعناية والقطع عن كثب تحت العظم. أقرب إلى عظم القص بذل، ويعد في روتليت. استخدام مدمن مخدرات أو بنت الملقط للمساعدة في تحقيق من أحكام قبضتهم على كل فقرة عنق الرحم أثناء إجراء تخفيضات (الشكل 4ج).
   10. حالما يتم عزل الطول المطلوب للحبل الشوكي وتشريح من العمود الفقري، جعل قطع عرضية لإزالة الحبل الشوكي (الشكل 5A و الرقم 5ب).
5. إزالة الأم الجافية.
   ملاحظة: الحبل الشوكي الدماغ معزولة يمكن استخدامها لتسجيل كتلة في المختبر كما تم وصفه سابقا^3،7. مع الحبل الشوكي الدماغ إزالتها من العمود الفقري، يجب إزالة دوراً توفير الوصول الأمثل لأقطاب شفط لإجراء التسجيلات من قطع الجمجمة والعمود الفقري روتليس. بالإضافة إلى ذلك، إزالة دوراً يجعل من الممكن نظيفة شريحة جذع الدماغ، والحصول على شرائح رقيقة إيقاعي نشطة لتسجيل في المختبر.
   1. عناية روتليس دبوس معزولة جذع الدماغ-الشوكي الحبل الأنسجة الظهرية الجانبية يصل السماح بالوصول إلى بلده دوراً المحيطة الجمجمة (الشكل 5ب). وينبغي تطبيق دبابيس من خلال الهامش الجانبي من جذع الدماغ، روسترال إلى rootlets الثاني عشر.
   2. إزالة دوراً من سطح الظهرية جذع الدماغ برفع في بلده دوراً بالملقط غرامة (#5) في الهامش الظهرية دوراً وقطع من جانبية للأنسي عبر طول جذع الدماغ مع مقص الربيع الجميلة. كن حذراً لتجنب قطع في الدماغ نفسه. بلطف رفع الأوعية الدموية من سطح الدماغ وقطع لتجنب عائق النصل فيبرتوم عند تقطيع جذع الدماغ.
   3. عناية تشريح دوراً من الجوانب الآنسي والوحشي للدماغ، كما rootlets الأعصاب القحفية يمر بلده دوراً وسهولة وقع بعيداً عندما يرفع دوراً. تقليل احتمالية حدوث rootlets يجري اقتلع بقطع بلطف حولها مع مقص الربيع الصغيرة.
   4. الوجه الحبل الشوكي الدماغ حيث أن يواجه السطح البطني و rootlets الجمجمة مرئية بوضوح. تشريح دوراً من الجهة الظهرية من جذع الدماغ رفع في بلده دوراً بلطف مباشرة عبر postrema المنطقة، قطع من روسترال إلى والذيلية. سوف تظهر postrema المنطقة الوردي قليلاً بسبب العدد الكبير من ميكروكابيلاريس بيرفوسينج في هذه المنطقة.
   5. استخدام pin الحشرات الجميلة لندف بعيداً أي دوراً المتبقية وإزالة المتبقي من الأوعية الدموية بالقرب من rootlets الجمجمة وسرطان عنق الرحم.

4-شريحة البروتوكول

1. بعد إزالة في دوراً، مكان في الدماغ في وسط منصة البارافين على كتلة البلاستيك (يشار إليه فيما يلي "كتلة قطع"). دبوس والذيلية نهاية الدماغ عن طريق الحبل الشوكي القاصي استخدام دبابيس الحشرات الدقيقة التي تم اقتطاعها بطول لا يزيد عن 1 سم كما هو موضح في الشكل 5ج.
2. محاذاة الكتلة قطع البارافين المغطاة جذع الدماغ المثبتة في حامل كتلة فيبرتوم حيث أن الشفرة تخفيضات التعامد على وجه روسترال جذع الدماغ.
3. جعل شريحة أولى لإزالة الأنسجة متفاوتاً، دخيلة على نهاية روسترال معظم. يمكن أن يكون هذا الخفض الأولى 200-300 ميكرون عادة ولكن بعناية تجنب إزالة rootlets الجمجمة التاسع والعاشر والثاني عشر. هذه الخطوة عادة ما تكشف عن مدى والذيلية نواة الوجه (السابع) و rootlets جلوسوفارينجيل ويجعل من الممكن لمحاذاة جذع الدماغ حيث يكون الوجه الاسمية المستوية إلى شفرة فيبرتوم. إجراء تعديلات صغيرة عند الاقتضاء لكفالة قدم المساواة-بلاناريتي وإجراء تخفيضات صغيرة لإزالة أنسجة غير متكافئ.
   ملاحظة: Rootlets Glossopharyngeal (تاسعا) ستكون مرئية في الحافة الجانبية للدماغ واحدة يقطع كل شريحة المتعاقبة، وهذه توفر معلما لمسافة rostro والذيلية للدوائر العصبية جذع الدماغ اللازمة لتوليد الإيقاع. على الجانب البطني من الدماغ، rootlets هيبوجلوسال (ثاني عشر) ينبغي أيضا مرئية والذيلية طفيفة في الوجه قطع عرض rootlets التاسع. ستكون معلما نهائي obex (نقطة في الدماغ البشري الذي يضيق البطين الرابع لتصبح القناة المركزية للحبل الشوكي) في وجه الظهرية جذع الدماغ. مع هذه النقاط الثلاث من مرجع مرئي، الصحيح القطع المنشأة (انظر الشكل 6A) وسيتم الحصول على شريحة نشطة إيقاعي موثوق بها.
4. يستمر قطع روسترال إلى والذيلية rootlets التاسع بالقرب من سطح قطع وجه جذع الدماغ.
5. الرجوع إلى الرقم 6 للمعالم والتوجه الصحيح. ضبط البارافين-لوح في المشبك فيبرتوم حيث أن زاوية ترانسيكشن القادم سوف إنشاء شكل طفيف جداً "آسفين" لقص الشريحة وقطع شرائح من حوالي 100-200 ميكرون حتى يمكن أن تكون معالم وصف يرى بوضوح (الشكل 6A).
   ملاحظة: قطع هذا آسفين طفيفا يزيد من العدد من الخلايا العصبية الحركية الثاني عشر أسر في الشريحة ويزيد من احتمال الحصول على النشاط الإيقاعي أثناء التسجيل. باستخدام المعالم الموصوفة (rootlets روسترال من حزمة العصب glossopharyngeal، rootlets من حزمة العصب هيبوجلوسال، obex) سوف تضمن أن الشريحة تحتوي على تكاثر على الأقل جزء كبير من لجنة البرنامج والميزانية (الشكل 6ب).
6. قص شريحة 300-500 ميكرون من جذع الدماغ من هذه العلامات نيورواناتوميكال روسترال للقبض على لجنة البرنامج والميزانية، وانتقال الدوائر المرتبطة.
   ملاحظة: سيحتوي شريحة "مثالية" روتليت روسترال أكثر من حزمة روتليت هيبوجلوسال للحصول على نشاط الشهيقيه موثوق بها دون اللجوء إلى التسجيلات السطحية باستخدام شفط كهربائي عبر المكاني إيقاع-توليد/يحيل بها داخل جذع الدماغ.

5-تسجيل الإجراءات

1. ضع الشريحة في دائرة تسجيل ونتخلل باستمرار مع قام (0.5-1.0 مل/دقيقة) واستخدام أقطاب شفط أو خارج الخلية للنشاط السكاني سجل من rootlets الثاني عشر، أو من لجنة البرنامج والميزانية، "بمنس الثاني عشر"، أو الثاني عشر موتونيورونس. للحصول على إجراءات تسجيل مفصلة، انظر المنشورات السابقة في الحبل الشوكي الدماغ الكهربية والتصحيح لقط^10،11.

النتائج

الطريقة المعروضة هنا يسمح باحث المهتمة في الحصول على شرائح إيقاعي النشطة من جذع الدماغ تكاثر وموثوق بها قص شريحة قابلة للحياة وقوية تتيح تسجيل الإخراج موتور وهمية لعدة ساعات. ويمكن التقاط جميع عناصر الدارة العصبية الحد الأدنى اللازم لتوليد ويحيل بها إيقاع الشهيقيه في ش?...

Discussion

تكييف البروتوكول المقدمة هنا إلى كتلة en أو شريحة سير العمل مفيد للمختبرات والدراسات التي تود أن تستخدم أما جذع الدماغ الشوكي كتلة و/أو رقيقة شريحة الأعمال التحضيرية للتسجيلات الكهربية. طريقة التشريح وشريحة عرض، جنبا إلى جنب مع الأساليب التي ذكرت سابقا قبل الآخرين^17،?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
KCl	Sigma Aldrich	P5405-1KG
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1
NaH2PO4 •H2O	Sigma Aldrch	S9638-25G
CaCl2•2H2O	Sigma Aldrich	C7902-500G
MgSO4•7H2O	Sigma Aldrich	M7774-500G
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W	AmScope	H2L50-AY
Dissection Microscope	Leica	M-60
Vibratome 1000 Plus	Vibratome	W3 69-0353
Magnetic Base	Kanetic	MB-B-DG6C
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades	Wilkinson	97573
Histoclear	Sigma-Aldrich	H2779
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5/45 Forcep	Fine Science Tools	11251-35
Scalpel Blades #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handel #3	Fine Science Tools	10003-12
Spring Scissors Straight	Fine Science Tools	15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight	Fine Science Tools	11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight	Roboz	RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved	Roboz	RS-5621
Insect pins, 0	Fine Science Tools/8840604	26000-35
Insect pins, 0, SS	Fine Science Tools	26001-35
Insect pins, 00	Fine Science Tools	26000-30
Insect pins, 00, SS	Fine Science Tools	26001-30
Insect pins, 000	Fine Science Tools	26000-25
Insect pins, 000, SS	Fine Science Tools	26001-25
Minutien pins, 0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10
Minutien pins, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Minutien pins, 0.2 mm	Fine Science Tools	26002-20
Fisher Tissue prep Parafin	fisher	T56-5
Graphite	fisher	G67-500
Delrin Plastic	Grainger	3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle	BD	305195