JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתקשר ההכנה גזע המוח-עמוד השדרה של מבהיר את הכנת פרוסות רוחבי גזע המוח באופן מקיף שלב אחר שלב. זה נועד להגדיל את הפארמצבטית ולשפר את הסבירות של קבלת פרוסות קיימא, לאורך זמן, בקצב אחיד-פעיל עבור הקלטה פלט עצבית מהאזורים הנשימה של גזע המוח.

Abstract

בתרבית של קצב inspiratory מופק ברשת העצבית באזור של לשד בשם preBötzinger את מורכבות (ות ת), אשר מייצר אות נהיגה קצבית התכווצות של השרירים inspiratory. פעילות עצבית הקצבי שנוצר נכסים ובנין ונשאנו לבריכות עצביים אחרים לכונן שמערכת השרירים של הנשימה עשויים להילמד תוך שימוש בשיטות שונות, כולל en bloc עצב הקלטות, הקלטות פרוסה רוחבי. עם זאת, שיטות שפורסמו בעבר לא בהרחבה תיארו את תהליך ניתוח גזע המוח-השדרה באופן שקוף לשחזור עבור מחקרים עתידיים. כאן, אנו מציגים סקירה מקיפה של שיטה המשמשת reproducibly חותכים פרוסות גזע המוח בקצב אחיד-פעיל המכיל את המעגלים עצביים חיוני ומספיק עבור הפקת ושידור נסיעה inspiratory. עבודה זו מתבססת על פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה הקודם כדי להגביר את הסבירות של אמין קבלת פרוסות בקצב אחיד-פעיל ובר קיימא עבור הקלטה עצביים ופלט נכסים ובנין, הנוירונים premotor hypoglossal (נויטרופיל XII), ו hypoglossal מוטורי לגלוקוז (XII MN). העבודה הציגה ומרחיב על שיטות קודמות שפורסמו על-ידי מתן איורים מפורט, צעד אחר צעד של הקרע, מן החולדה כל גור, פרוסה במבחנה המכילה את rootlets XII.

Introduction

הרשת העצבית בדרכי הנשימה של גזע המוח מספק תחום פורייה להבנת מאפייניה של קצבי רשתות עצביות. בפרט, העניין הוא בפיתוח של מכרסם neonatal נושם והבנה איך מתפתח בקצב הנשימה. זה עשוי להיות נעשה שימוש בגישה מרובת רמות, כולל ויוו plethysmography כל בעלי חיים, אין ויטרו en bloc עצב הקלטות, במבחנה לחתוך הקלטות מכילות את הגנרטור קצב הנשימה. רדיוקציוניסטי בהקלטות חוץ גופית en הגוש ופרוסות הן שיטה יתרון לשימוש בעת חקירת המנגנון מאחורי rhythmogenesis הנשימה ואת המעגלים העצביים באזור גזע המוח-עמוד השדרה של פיתוח מכרסמים. מערכת הנשימה פיתוח כולל כ 40 סוגי תאים, המאופיינת על ידי ירי דפוס, כולל אלה של מרכז הנשימה1,2. לרשת מרכזי הנשימה כוללת קבוצה של נוירונים פעילים בקצב ממוקם לשד ventrolateral rostral1,3. Rhythmogenesis הנשימה יונקים נוצר מן autorhythmic interneuron רשת כינו את preBötzinger מורכבים (ות ת), אשר היה מקומי השפעול דרך ההכנות הגוש פרוסה והן en של מידע יונקים neonatal גזע המוח-שדרתית חוטי3,4,5,6,7,8. אזור זה משמש פונקציה דומה סינוס-פרוזדור (SA) בלב ויוצרת מערכת תזמון inspiratory נסיעה נשימה. מ נכסים ובנין, הקצב inspiratory מתבצע באזורים אחרים של גזע המוח (כולל את הגרעין מנוע hypoglossal), בריכות מנוע בעמוד השדרה (כגון הנוירונים מנוע הסרעפת לנהוג הסרעפת)9.

פעילות אומנותית ניתן להשיג באמצעות גזע המוח חוט השדרה en הגוש ההכנות או פרוסות ממגוון רחב של אוכלוסיות תאים, כולל C3-C5 עצב rootlets, rootlets עצב XII, גרעין מנוע hypoglossal (XII MN), hypoglossal premotor נוירונים (נויטרופיל XII), ו נכסים ובנין3,10,11,12. בעוד אלה שיטות איסוף הנתונים היו הצלחה מעבר קומץ של מעבדות, רבים מן הפרוטוקולים לא מוצגים באופן שאינו לשחזור באופן מלא עבור חוקרים חדשים להזין את השדה. קבלת en קיימא ופעיל בקצב ההכנות הגוש ופרוסות דורש תשומת לב חדה לפרטים דרך כל השלבים של דיסקציה, פרוטוקול חיתוך פרוסה. הפרוטוקולים הקודמים בהרחבה לתאר את ההקלטה הליכים שונים, אלקטרופיזיולוגיה, עדיין מחסור פירוט בחלק הקריטי ביותר של קבלת הכנה מעשית רקמות: ביצוע ההליך חיתוך ופרוסות גזע המוח-השדרה.

קבלת ביעילות en בקצב אחיד-פעיל בר -קיימא הגוש או פרוסה הכנה גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה הקלטות דורש כי כל השלבים להתבצע כראוי, בזהירות ובמהירות (בדרך כלל, כל התהליך קשורים כאן יכול להיות הופיעה כ 30 דקות). נקודות קריטיות של פרוטוקול אלקטרופיזיולוגיה גזע המוח-השדרה לא קודם לכן טוב שתוארו כוללים את הקרע של עצב rootlets, את ההליך עם פרוסות על vibratome. פרוטוקול זה הוא הראשון stepwise באופן חזותי את הקרע גזע המוח-השדרה עבור חוקרים חדשים והן מומחים בתחום. פרוטוקול זה מסביר באופן יסודי גם טכניקות ניתוחיות, ציוני דרך, הליכים אחרים כדי לסייע לחוקרים עתידיים ביצירת אחידות פרוסות והכנות en bloc להכיל את המעגלים המדויק הרצוי ניסוי. הגורים neonatal עכבר ועכבר יכולים לשמש ההליכים המובאים כאן.

Protocol

להלן כללי התנהגות מקובלים ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת לומה לינדה. הנחיות NIH יחס מוסרי לבעלי חיים הם בעקבותיו כל הניסויים שבוצעו במעבדה. כל סטנדרטים אתיים אושרו על ידי יחידים ביצוע פרוטוקול זה.

1. פתרונות

  1. להכין מלאכותית לנוזל חוט השדרה (כלנית חדד).
    1. להכין טרי חנה המבר ערב קודם ניסוי בקבוצות 1 ליטר באמצעות הבאות המתכון: 7.250 g NaCl (124 מ מ), 0.224 גרם אשלגן כלורי (3 מ מ), g 2.100 NaHCO3 (25 מ מ), g 0.069 NaH2PO4 • H2O (0.5 מ מ), 0.247 g MgSO4 • 7 שעות2 O (1.0 מ מ), ו- 5.410 g D-גלוקוז (30 מ מ), 0.221 g CaCl2 • 2 H2O (1.5 מ מ). תמיד להוסיף CaCl2 • 2 H2O אחרונה.
    2. להמיס את הרכיבים לתוך 1 ליטר של מים יונים. מערבבים למשך 20-30 דקות.
    3. למדוד את רמת החומציות של כלנית חדד ולהתאים את 7.40 ± 0.02 שימוש באמצעי אחסון קטן (בדרך כלל < 0.5 מ ל) של NaOH שתדללו, קו או HCl.
      הערה: חנה המבר מוכן ניתן לאחסן במקרר (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02) שלושה ימים לפני התפתחות חיידקים משפיעה על יכולת הקיום של הרקמה במהלך ניסוי. השתמש 0.2 µm מסננים כדי לצמצם זיהום על ידי פטריה או חיידקים המצויים במעבדה מאז ניסויים יכולים להימשך עד 36 שעות. ליעילות, המתכון כלנית חדד תיאר ייתכן וניתן לשנותם 4 L אצוות בעקבות באותו הפרוטוקול, אמצעי אחסון זה יימשך עד שלושה ימים של ניסויים.

2. הכנת לנתיחה ושמא Vibratome

  1. להגדיר את הלהב.
    1. השתמש סכיני טריים פיפיות עבור חיתוך רקמה על vibratome. לשטוף את הסכין עם 100% אתנול, לשטוף עם מים יונים לפני חיתוך או הצמדה הלהב לשניים, הוספת את הלהב לתוך ההרכבה להיסגר על vibratome.
    2. לשנות את הלהב בכל פעם הכנה רקמה חדשה, מותקן על vibratome שמגיע או אם זה מוריד מערך הניתוחים פרפין בזמן החיתוך. שאריות פרפין יעשה את זה כמעט בלתי אפשרי לחתוך נקיה רקמה עצבית neonatal.
  2. כוונן לוח פרפין.
    1. השתמש בכל בנוסח הטבעה פרפין. מקום 10 גרם של הטמעת מדיה בתוך זכוכית חום-סובלנית והשתמש בחום נמוך כדי להמיס את החרוזים פרפין לנוזל.
    2. להוסיף כ- 0.5 גר' אבקת גרפיט, לערבב פתרון יסודי, בצורה אחידה לתוך פרפין נוזלי.
    3. להשתמש לוח פלסטיק קטן המצע פרפין. לחתוך חתיכה קטנה (0.5 - 1 ס מ עבה, כ 2 x 2 ס"מ2 רחב) של פלסטיק (פוליקרבונט או אלומיניום יכול לשמש גם). להשתמש בקובץ של מכונאי כדי לגרד חריצים לתוך הפלסטיק נצחית ובלתי מעורערת יבטיח כי הפרפין לאנאפוליס הפלסטיק.
      הערה: לחלופין, השתמש מחט תת-עורית 18 גרם מחומם כדי למקם את החורים בזווית הגיליון כדי להבטיח כי התערובת פרפין-גרפיט לאנאפוליס הפלסטיק.
    4. השתמשי באחורי המוליך עצה כותנה לטפטף את התערובת פרפין-גרפיט על הפלסטיק שוב ושוב טובלים את המוליך לתוך התערובת פרפין מותכת-גרפיט, מטפטפים את slurry אל הרחוב פלסטיק ועל בניית הפרפין-גרפיט כדי כ 1.5 ס מ עובי מעל הפלסטיק.
    5. ברגע שכבה עבה מספיק של המיקס פרפין-גרפיט הופקד על הרחוב, הגדר את גוש בצד מגניב, אז הצורה כדי להכיל את גזע המוח-השדרה.

3. ניתוח ובידוד של Neuraxis

  1. לבצע ניתוח ראשוני של ההרדמה.
    הערה:     חיות השתמשו במחקר זה עשויים לנוע בגודל מיום עובריים 18 (E18) ליום כמחנכת 10-20 עכברים או חולדות ועד היום כמחנכת E18 5/6. חולדות או עכברים מכל זן, טיפול, או מגדר עשוי לשמש, בהתאם לעיצוב הניסיונית. מבצעים הרדמה ניתוח ראשוני ברדס fume מאז איזופלוריין משמש (0.25 mL בתוך תא 25 מ ל).
    1. שוקל הכלבלב, ואז למקם אותו חדר הרדמה המכיל 0.25 mL של איזופלוריין מונחת 2 x 2 ס מ2 פיסת גזה. לאחר החיה מגיע מטוס כירורגי של הרדמה (נבדק על ידי צביטה הבוהן עם אין רפלקס הנסיגה), סיכת החיה על צלחת פטרי מלא elastomer פרפין או סיליקון.
      הערה: גם להיות מורדם neonatal מכרסמים באמצעות13,cryoanesthesia14, איזופלוריין אידוי15, או הזרקת16 מאוזנת עם חמצן.
    2. במקום הצד הבטני בעלי חיים למטה ולעשות קו האמצע חתך של ממש מאחורי העיניים באזור המותני באמצע השדרה עם להב סכין מספר 10 או 11 או מספריים כירורגיים. לשקף את העור, decerebrate החיה ברמה של התפר הקודקודית/העורפית (ראה איור 1) ולהסיר את העור transecting החיה מתחת לסרעפת. ואז להסיר את הזרועות על ידי חיתוך המשותפת כתף עם מספריים או אזמל.
    3. לאחר הסרת העור, להעביר תא זלוף עם סיליקון elastomerin התחתון עבור עוד ניתוח והכנה של גזע המוח-השדרה החיה.
    4. בועה של מאגר כלנית חדד (בקבוק הצדדית 500 מ"ל) ברציפות עם צוננת (4 ° C, pH 7.40 ± 0.02) חנה המבר ואת חמצן בתערובת של 95% O2 ו- 5% CO2 (נקרא גם"carbogen"). בזמן, השתמש חנה המבר צוננת לרוקן מעת לעת את התא, מתן חנה המבר מחומצן טריים לאורך בידוד של חוט השדרה-גזע המוח.
      הערה: כדוריות דם אדומות ניתן לראות העורקים והוורידים הנותרים ואלה, כאשר מספיק חמצן, אדום בהיר.
    5. השתמש זלוף זרימת הכבידה באמצעות צינורות של צימוד, כדי לסירוגין או ברציפות perfuse הרקמה עם חנה המבר מחומצן (בולוס נפח או באמצעות איטי טפטוף באמצעות של צימוד, כ 0.5 - 1.0 mL/min). זה מחמצן את הרקמה ושומר על שדה כירורגית ברור.
    6. הסרת עודפי נוזלים כנדרש על ידי מערכת סינון היניקה ואקום.
    7. לבצע את הקרע באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. מודל רציף זום הוא העדיף כדי לאפשר התאמת משובח של ההגדלה ולאפשר להדמיה אופטימלית של האזור עניין במהלך כל שלב של הקרע.
      הערה: כלים למיקרו מומלץ לכלול מגוון של רקמות במיתולגיות מלקחיים מלקחיים בוטה, מלקחיים #5, רקמות בזווית מלקחיים, מגוון של מספריים לנתח מיקרו (מעיין מספריים), וחרק רגיל וסיכות לנתח מיקרו.
    8. לחשוף את המוח דרך מקטע קו אמצע של הגולגולת לאורך התפר המשונן ואז לרתק את המדפים משתקף עם סיכות לנתח מיקרו ולהדק השדרה בסוף סימטרית בתחתית מצופה סיליקון לחדר ניתוח באמצעות 27 G מחט.
      הערה: השאר הקרע דורש מיקרוסקופ לנתיחה לספק את התצוגה הברורה של רקמות, ציוני דרך להשתמש כדי להבטיח את הסבירות המרבית של קבלת פלט פיקטיבי קצבית את rootlets הגולגולת של גזע המוח, עמוד השדרה rootlets. בצע את השלבים הבאים של הקרע בעזרת מספריים האביב בינוני או מספריים איריס ומלקחיים בסדר.
  2. מיד העברת המטען מבודד של החיה חדר דיסקציה קצף. במקום הצד הגבי רקמות עם תום rostral (המוח) מול החלק הקדמי של החדר. להצמיד את הרקמה הכתפיים ובסוף הכי סימטרית של חוט השדרה.
    1. עושים חתך מאמצע-הווריד דרך הגולגולת בעקבות את התפר הקודקוד כדי למנוע נזק בקליפת המוח, גזע המוח שבבסיס הגולגולת.
      הערה: רקמת העצם neonatal לא התקשחה באופן מלא, והוא מאוד שביר. לרקמת העצם/יהיה גמיש במידה, אבל קשה יותר החיבור שמסביב ואת רקמת השריר.
    2. להשתמש במספריים באביב או איריס בינוני כדי לגזור את התפרים העורפית של הגולגולת, שמתחילים בהתפר המשונן ועבודה רוחבית. פעולה זו תיצור "כנפיים" של הגולגולת כי ייתכן משתקפת ויש המוצמדת לשורת לעגן את החלק rostral של הגולגולת, מספקים יציבות ברקמות (ראה איור 2א).
    3. לאחר המשקף את המדפים הגולגולת, לחתוך את שאר קליפת המוח, עוזב את סימטרית החלק של המוח הקטן (vermis) ללא פגע יחסית (איור 2B).
  3. לבצע laminectomy הגבי.
    1. הסר את מערכת השרירים המקיפים את הגולגולת ואת עמוד השדרה באמצעות מלקחיים ומספריים האביב מיקרו. הסרת רקמת לאורך הצד הגבי של כלוב הצלעות, עוזב את כלוב הצלעות ללא פגע, כפי שזה ניתן להצמיד מאוחר יותר לעגן את הרקמה במהלך laminectomy הגחון, למזער את הסיכוי של נזק לחוט השדרה.
    2. בזהירות לגזור משם תהליכי לרוחב סחוס בחוליות באמצעות מספריים האביב בינוני או מספריים איריס משובחים. לחתוך כל רקמות המכסים את פונס ו לשד. Vermis, המוח הקטן, פונס ו תחילתו של חוט השדרה עכשיו יהיה נראה בבירור (איור 2C).
  4. לבצע laminectomy הגחון.
    1. להנמיך את הצד הגבי רקמות ולהדק הצלעות ובסוף סימטרית ביותר של עמוד השדרה. להצמיד את הצד rostral של רקמת באמצעות המשק הגולגולת (איור 3א).
    2. הסר את החצי הגחון של כלוב הצלעות, עצם החזה כולל כל אברי הבטן בעזרת מלקחיים ומספריים באותו. לנתח משם רקמות רכות מחוברת קשת הצלעות לחשוף את הצלעות ועמוד השדרה (איור 3ב).
    3. הסר את הלשון, הוושט, קנה הנשימה, הגרון, כל אחרים רקמות רכות ואת השרירים המכסים בבסיס הגולגולת, עמוד השדרה (כפי שניתן לראות באיור 3C).
    4. לפרק רקמות המכסים על משטח קשה. לזהות בחך באיתור צלחת מלבנית של העצם בבסיס הגולגולת עם כניסה V-צורה על זה (איור 3ג'). חתך לאורך הקו האמצעי של החיך, בזהירות להרים את זה כלפי מעלה, ולבצע רוחבי לחתוך כדי להסיר אותו (איור 4א).
    5. מתחילים עם laminectomy הגחוני על-ידי הסרת שנבזזו חשיפת השטח הגחון של גזע המוח, חוט השדרה של צוואר הרחם החוליה הראשונה כדי כ בית החזה חוליה 7 (T7) כפי שניתן לראות באיור 4B.
    6. בשלב זה, rootlets הגחון יהיה גלוי. באמצעות ניתוח מיקרו קטן או מעיין מספריים, שמור על עצמך כדי. לעשות חתכים קרוב של סחוס, רחוק ממקור של שורשים-חוט השדרה ככל האפשר; הימנע מתיחה השורשים.
    7. חיתוך 5-10 מ מ לאורך צידי השדרה-שנבזזו. Not גזור קרוב מדי אל חוט השדרה או אל החוליות. שלב זה מאפשר הסרה של חוליות צוואר הרחם כדי לחשוף את חוט השדרה. הימנע לחתוך את rootlets.
    8. לגזור rootlets כ 20-25 מ מ (נשימה) לאורך עמוד השדרה (כ T7). במהלך הליך זה להימנע לחתוך לתוך חוט השדרה ולטפל על הקצוות של החוליות כפי שניתן לראות באיור 4C.
    9. הסר C1, C2, C3 על ידי הרמת קצה אחד של החוליות rostral ובזהירות החיתוך מקרוב מתחת לעצם. קרוב לעצם כי החתך, ככל rootlet. שימוש מכור או כפופות מלקחיים כדי לסייע להשגת אחיזה חזקה על כל חוליית הצוואר בעת ביצוע חתכים (איור 4C).
    10. לאחר לאורך הרצוי של חוט השדרה הוא מבודד, גזור מן בעמודה השדרה, לבצע חתך רוחבי כדי להסיר את חוט השדרה (איור 5א ואיור 5B).
  5. הסר הדורה.
    הערה:     מבודדים גזע המוח-השדרה יכול לשמש עבור הקלטה en bloc במבחנה כבר שתואר לעיל3,7. עם גזע המוח-השדרה להסיר את עמוד השדרה, יש להסיר את דורא כדי לספק גישה אופטימלית עבור אלקטרודות היניקה לבצע הקלטות מתוך החתך הגולגולת, עמוד השדרה rootles. בנוסף, ההסרה של השכבה הקשה של המוח מאפשר נקיה לחתוך את גזע המוח ולקבל פרוסות דקות בקצב פעיל עבור הקלטת במבחנה.
    1. בזהירות pin מבודדים גזע המוח-השדרה בצידו הגבי רקמות למעלה כדי לאפשר גישה השכבה הקשה של המוח המקיפים את הגולגולת rootles (איור 5B). צריך להיות מיושם סיכות דרך השוליים הצדדיים של גזע המוח, rostral כדי rootlets השנים עשר.
    2. להסיר את השכבה הקשה של המוח מפני השטח הגבי של גזע המוח על ידי הרמת השכבה הקשה של המוח עם מלקחיים בסדר (#5) בקצה תחום הגבי של דורה, חצו מן הצד המדיאלי האורך של גזע המוח עם מספריים אביבי נאה. להיות זהירים כדי למנוע חיתוך לתוך גזע המוח עצמו. בעדינות להרים את כלי הדם מפני השטח גזע המוח וחותכים כדי למנוע מכשול של הלהב vibratome בעת חלוקתה לגזע המוח.
    3. בזהירות לנתח דורא מן ההיבטים המדיאלי, לרוחב של גזע המוח, וגם rootlets עצבי הגולגולת עוברים דרך השכבה הקשה של המוח בקלות נקרעים. משם בעת הסרת השכבה הקשה של המוח. לצמצם את הסבירות של rootlets להיות הוריד ידי בעדינות חיתוך סביבם במספריים מעיין קטן.
    4. להעיף את גזע המוח-השדרה כך (גחוני) פונה, rootlets הגולגולת הם נראים בבירור. לנתח את דורא מן הצד הגבי של גזע המוח על-ידי בעדינות הרמת השכבה הקשה של המוח ישירות מעל postrema באזור, גזירה מן rostral סימטרית. Postrema אזור יופיע ורוד מעט בשל המספר הגדול של microcapillaries מה קורה באזור.
    5. השתמש סיכה חרקים בסדר כדי לקנטר משם כל דורא הנותרים ולהסיר כלי הדם הנותרים בסמיכות rootlets הגולגולת ואת צוואר הרחם.

4. פרוסה פרוטוקול

  1. לאחר הסרת השכבה הקשה של המוח, מקום לגזע המוח במרכז של פלטפורמת פרפין על הבלוק פלסטיק (ןלהל הרחוב"חיתוך"). להצמיד הסוף סימטרית של גזע המוח דרך חוט השדרה דיסטלי באמצעות סיכות חרקים בסדר זה היה גזוז לא יותר מ 1 ס"מ אורך כמוצג באיור 5C.
  2. יישר לבלוק מכוסה פרפין חיתוך עם המוצמד לגזע המוח בהמחזיק בלוק vibratome כך הלהב חתכים בניצב את פניו rostral של גזע המוח.
  3. להפוך פרוסה הראשונית כדי להסיר את הרקמה לא אחידה, שאינם שייכים בקצה rostral ביותר. החתך הראשוני הזה יכול להיות 200-300 מיקרומטר בדרך כלל אבל בזהירות למנוע הסרה של rootlets הגולגולת התשיעי, X, ויב. שלב זה בדרך כלל תחשוף את היקף סימטרית לגרעין פנים (VII), את rootlets glossopharyngeal, מאפשרת ליישר את גזע המוח כך שהפנים שלה par-מישורי הלהב vibratome. לעשות שינויים קטנים לפי הצורך כדי להבטיח par-סבתא סורגת ולבצע חתכים קטנים כדי להסיר רקמות לא אחידה.
    הערה: Rootlets Glossopharyngeal (IX) יהיה גלוי על קצה לרוחב של גזע המוח כפי אחד חותך כל פרוסה רצופים, אלה מספקות נקודת ציון המרחק rostro-סימטרית גזע המוח המעגלים העצביים הכרחי עבור קצב-דור. בצד הגחוני של גזע המוח, rootlets hypoglossal (XII) צריך גם להיות גלוי מעט סימטרית להתמודד לחתוך מציג את rootlets התשיעי. נקודת ציון סופי יהיה obex (נקודת במוח האנושי שבו הנוזלים הרביעי מצמצם להפוך התעלה המרכזית של חוט השדרה) על פני הגבי של גזע המוח. עם אלה שלוש נקודות התייחסות גלויה, שהמישור החותך הנכונה היא נוסדה (ראה איור 6א), פרוסה בקצב אחיד-פעיל ניתן להשיג באופן אמין.
  4. המשך חיתוך rostral-כדי-סימטרית עד rootlets התשיעי נמצאים קרוב לפני השטח של הפנים לחתוך של גזע המוח.
  5. עיין באיור 6 לקבלת ציוני הדרך והכיוון הנכון. להתאים את המתים-הפרפין ב המלחציים vibratome כך הזווית הבא של חיתוך ליצור צורת "טריז" קלים מאוד כדי לחתוך הפרוסה חותכים פרוסות של 100-200 מיקרומטר עד ציוני הדרך המתוארת ניתן לראות בבירור (איור 6א).
    הערה: חותכים טריז קלה זו מגדילה את מספר השנים עשר מוטורי לגלוקוז בשבי הפרוסה ומגדיל את הסיכוי של קבלת פעילות קצבית במהלך ההקלטה. באמצעות ציוני הדרך המתואר (rostral rootlets הצרור והלוע, rootlets מן הקיבוץ עצב, obex) יבטיח כי הפרוסה reproducibly מכיל לפחות חלק גדול נכסים ובנין (איור 6B).
  6. לחתוך פרוסה מיקרומטר 300-500 של גזע המוח מ אלה סמנים neuroanatomical rostral כדי ללכוד את נכסים ובנין ומקושרת שידור המעגלים.
    הערה: פרוסה "אידאלי" יכיל את rootlet ביותר rostral של הקיבוץ hypoglossal rootlet אמין לקבל פעילות inspiratory מבלי להזדקק הקלטות השטח באמצעות אלקטרודה היניקה של מעל קצב יצירת/משדר לוקוסים בתוך גזע המוח.

5. הקלטה נהלים

  1. הצב את הפרוסה בחדר ההקלטה, perfuse ללא הרף עם כלנית חדד (0.5 - 1.0 mL/min) והשתמש אלקטרודות יניקה או חוץ-תאית לפעילות האוכלוסייה הרשומה את rootlets XII או נכסים ובנין, יב PMNs, או XII motoneurons. להליכי הקלטה מפורטת, לראות פרסומים קודמים על גזע המוח-השדרה אלקטרופיזיולוגיה, תיקון10,clamping11.

תוצאות

השיטה המוצגת כאן מאפשר חוקר מעוניינת לקבל פרוסות פעיל בקצב של גזע המוח reproducibly ובאמינות חותך קיימא, חסון, שיאפשר הקלטה של פלט מנוע פיקטיבי במשך שעות רבות. כל הרכיבים מעגלים עצביים מינימלית הכרחי עבור הפקת ושידור קצב inspiratory ניתן ללכוד פרוסה דק בשיטה זו. רכיבים אלה כוללים: preB...

Discussion

התאמת הפרוטוקול המוצגים כאן לתוך הגוש en או פרוסה זרימת העבודה היא יתרון עבור מעבדות ולחתוך מחקרים כי הייתי רוצה לנצל גם en bloc גזע המוח-השדרה ו/או דק ההכנות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה. שיטת חיתוך ופרוסות שהוצגו, בשילוב עם שיטות דיווח בעבר על-ידי אחרים17,18,

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

S.B.P הוא אחד מנמעני לומה לינדה אוניברסיטת קיץ לתואר ראשון מחקר לאגודה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher ScientificS271-500
KClSigma AldrichP5405-1KG
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1
NaH2PO4 •H2OSigma AldrchS9638-25G
CaCl2•2H2OSigma AldrichC7902-500G
MgSO4•7H2OSigma AldrichM7774-500G
D-GlucoseSigma AldrichG8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 WAmScopeH2L50-AY
Dissection MicroscopeLeicaM-60
Vibratome 1000 PlusVibratomeW3 69-0353
Magnetic BaseKaneticMB-B-DG6C
Isoflurane, USPPatterson VeterinaryNDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge BladesWilkinson97573
HistoclearSigma-AldrichH2779
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5/45 ForcepFine Science Tools11251-35
Scalpel Blades #10Fine Science Tools10010-00
Scalpel Handel #3Fine Science Tools10003-12
Spring Scissors Straight Fine Science Tools15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straightFine Science Tools11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; StraightRobozRS-5650
Vannas Scissors 3" CurvedRobozRS-5621
Insect pins, 0Fine Science Tools/884060426000-35 
Insect pins, 0, SSFine Science Tools26001-35
Insect pins, 00Fine Science Tools26000-30
Insect pins, 00, SSFine Science Tools26001-30
Insect pins, 000Fine Science Tools26000-25
Insect pins, 000, SSFine Science Tools26001-25
Minutien pins, 0.10 mmFine Science Tools26002-10
Minutien pins, 0.15 mmFine Science Tools26002-15
Minutien pins, 0.2 mmFine Science Tools26002-20
Fisher Tissue prep Parafin fisherT56-5
Graphite fisher G67-500
Delrin Plastic Grainger3HMT2
18 Gauge Hypodermic NeedleBD305195

References

  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
  10. Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145vibratomeenrootletsrootlets

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved