Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Resumen

Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.

Resumen

Mamífero ritmo inspiratorio se genera de una red neuronal en una región de la médula llamada la preBötzinger complejo (pBC), que produce una señal que conduce a la contracción rítmica de los músculos inspiratorios. Actividad neuronal rítmica generada en el pBC y llevado a otras piscinas neuronales a la musculatura de la respiración puede ser estudiada mediante varios enfoques, incluyendo en bloque del nervio grabaciones y grabaciones de corte transversal en coche. Sin embargo, métodos previamente publicados no han descrito el proceso de disección de la médula espinal tronco encefálico extensivamente de manera transparente y reproducible para futuros estudios. Aquí, presentamos una visión completa de un método reproducible Cortar rodajas rítmicamente activa del médula oblonga que contiene los circuitos neuronales necesarios y suficientes para generar y transmitir la impulsión inspiratoria. Este trabajo se basa en protocolos anteriores de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico para aumentar la probabilidad de obtener confiablemente sectores viables y rítmicamente activa para grabación salida neuronal de la pBC, neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y neuronas motoras hipoglosos (XII MN). El trabajo presentado se expande sobre los métodos publicados anteriores proporcionando ilustraciones detalladas, paso a paso de la disección, de crías de rata entera, cortar en vitro con las raicillas XII.

Introducción

La red neuronal respiratoria del médula oblonga proporciona un dominio fértil para entender las características generales de las redes neuronales rítmicas. En particular, el interés es en el desarrollo de roedores neonatales respirar y entender cómo se desarrolla el ritmo de la respiración. Esto puede ser hecho usando un acercamiento de niveles múltiples, incluidas en la pletismografía todo animal vivo, in vitro en bloque del nervio grabaciones e in vitro cortar grabaciones que contienen el generador de ritmo de respiración. Reduccionista en vitro en bloque y rebanar las grabaciones son un método ventajoso utilizar al interrogar los mecanismos detrás de rhythmogenesis respiratoria y los circuitos neuronales en la región de la médula espinal tronco encefálico de desarrollo de roedores. El sistema respiratorio en desarrollo incluye aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por el disparo de patrón, los del centro respiratorio^1,2incluidos. La red respiratoria central incluye un grupo de rítmicamente activas neuronas localizadas en la médula ventrolateral rostral^1,3. Mamíferos rhythmogenesis respiratorio se genera de un autorhythmic interneurona red apodado el complejo preBötzinger (pBC), que ha sido localizada experimentalmente mediante preparaciones de rebanada y en bloque de mamíferos neonatal tronco encefálico espinal cordones^3,4,5,6,7,8. Esta región sirve una función similar a la del nódulo sinoauricular (SA) en el corazón y genera un sistema de tiempo inspiratorio para respiración de la unidad. De la pBC, el ritmo inspiratorio es llevado a otras regiones de la médula oblonga (incluyendo el núcleo hipogloso motor) y piscinas de motor espinal (por ejemplo, las neuronas motoras frénicas que impulsan el diafragma)⁹.

Actividad rítmica puede obtenerse utilizando preparaciones de médula oblonga médula espinal en bloque o rebanadas de una variedad de poblaciones celulares, incluyendo raicillas del nervio de C3-C5, raicillas de nervio XII, núcleo motor hipogloso (XII MN), neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y el pBC^3,10,11,12. Mientras que estos métodos de recogida de datos han tenido éxito a través de un puñado de laboratorios, muchos de los protocolos no se presentan de una manera que es totalmente reproducible para nuevos investigadores entrar en el campo. Viable y rítmicamente activa en la obtención de preparaciones y rebanada requiere una aguda atención al detalle a través de todos los pasos de la disección y el protocolo de corte de rebanada. Protocolos anteriores ampliamente describir los diversos procedimientos de grabación y electrofisiología, sin embargo, carecen de detalle en la parte más crítica de la obtención de una preparación de tejido viable: realizar el procedimiento de disección y corte de médula espinal tronco encefálico.

Eficiente la obtención de una preparación de bloque o rebanada de rítmicamente activa y viable en grabaciones de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico requiere realizar todos los pasos correctamente, con cuidado y rápidamente (por lo general, todo el procedimiento relacionado aquí, puede ser realizado en aproximadamente 30 min). Puntos críticos del Protocolo de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico que no han sido previamente bien descritos incluyen la disección de las raicillas del nervio y el procedimiento de corte en el vibratome. Este protocolo es el primero que paso a paso comunicar visualmente la disección de la médula espinal tronco encefálico para nuevos investigadores y expertos en la materia. Este protocolo explica también muy bien las técnicas quirúrgicas, hitos y otros procedimientos para ayudar a futuros investigadores en estandarización de cortes y preparaciones en bloque para contener el circuito exacto deseado en cada experimento. Los procedimientos aquí presentados pueden usarse en cachorros neonatales de rata y ratón.

Protocolo

El siguiente protocolo ha sido aceptado y aprobado por la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Loma Linda. Se siguen pautas de NIH para el tratamiento ético de animales en todos los experimentos con animales realizados en el laboratorio. Todos los estándares éticos fueron confirmados por personas realizar este protocolo.

1. las soluciones

1. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF).
   1. Preparar la aCSF fresco por la noche antes de un experimento en lotes de 1 L con la siguiente receta: 7,250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO₃ (25 mM), 0,069 g NaH₂PO₄ • H₂O (0,5 mM), 0,247 g de MgSO₄ • 7 H₂ O (1,0 mM) y g 5,410 D-glucosa (30 mM), 0,221 g CaCl₂ • 2 H₂O (1.5 mM). Siempre añadir CaCl₂ • 2 H₂O último.
   2. Disolver los componentes en 1 L de agua desionizada. Agitar durante 20-30 min.
   3. Medir el pH de la aCSF y ajustar a 7,40 ± 0.02 con pequeños volúmenes (típicamente < 0,5 mL) de NaOH, KOH o ácido clorhídrico diluido.
      Nota: ACSF preparado puede ser almacenado en el refrigerador (4 ° C, pH 7,40 ± 0.02) tres días antes de que crecimiento bacteriano afecta la viabilidad del tejido durante un experimento. Utilizar 0,2 μm filtros para reducir la contaminación por hongos y bacterias presentes en el laboratorio ya que los experimentos pueden durar hasta 36 h. Para la eficacia, la receta de la aCSF descrita puede ampliarse a 4 L lotes siguiendo el mismo protocolo y este volumen tendrá una duración de hasta tres días de experimentos.

2. preparación de la disección y la plataforma de Vibratome

1. Configurar hoja.
   1. Utilice una hojas de afeitar de doble filo fresco para el tejido en un vibratome corte. Lave la lámina con 100% de etanol y aclare con agua desionizada antes de corte o ajuste de la hoja por la mitad e Inserte la segueta en el montaje de la abrazadera en el vibratome.
   2. Cambiar la cuchilla cada vez que una nueva preparación de tejido se monta en el vibratome para rebanar o si corta de la losa de la parafina mientras corte. Cualquier residuo de la parafina hará casi imposible cortar limpiamente a través de tejido neural neonatal.
2. Configurar placa de cera de parafina.
   1. Utilice la cera de parafina de cualquier estilo de incrustación. Coloque 10 g de medio de inclusión en un vaso de vidrio tolerantes al calor y utilizar fuego para derretir las perlas de cera de parafina líquido.
   2. Agregar aproximadamente 0,5 g de grafito en polvo y solución de la mezcla minuciosa y uniformemente en la parafina líquida.
   3. Utilice una pequeña losa de plástico como el substrato para la parafina. Corte una pieza pequeña (0.5 - 1 cm de espesor y aproximadamente 2 x 2 cm² amplia) de plástico (policarbonato o aluminio puede también ser utilizado). Usar archivo de maquinista a rasguños surcos en el plástico asthis se asegurará de que la parafina se adhiere al plástico.
      Nota: Alternativamente, utilizar una aguja de hipodérmica 18 G climatizada para hacer agujeros de ángulo en la hoja para asegurar que la mezcla de parafina y grafito se adhiere al plástico.
   4. Use la parte posterior de un aplicador de punta de algodón para la mezcla de parafina y grafito en el plástico del goteo por repetidamente sumergir el aplicador en la mezcla de grafito de parafina fundida, chorreando la mezcla sobre los bloques y la construcción del grafito de parafina a aproximadamente 1,5 cm de espesor en la parte superior del plástico.
   5. Una vez que se deposita una capa suficientemente gruesa de la mezcla de parafina y grafito sobre el bloque, establecer el bloque a un lado para enfriar y luego la forma para dar cabida a la médula espinal de la médula oblonga.

3. disección y aislamiento de los Neuraxis

1. Realizar disección inicial y anestesia.
   Nota: animales utilizados en este estudio varían en tamaño desde embrionario día 18 (E18) a día postnatal 10-20 en ratones o ratas que van de E18 a día postnatal 5/6. Ratas o ratones de cepa, tratamiento o género pueden utilizarse, dependiendo del diseño experimental. Realizar anestesia y disección preliminar bajo una campana de humos ya que el isoflurano se utiliza (0,25 mL en una cámara de 25 mL).
   1. Pesar el cachorro y luego colocarlo en una cámara de anestesia que contenga 0.25 mL de isoflurano a un 2 x 2 pulgadas² trozo de Gasa. Después de que el animal alcance un plano quirúrgico de anestesia (verificado por el pellizco del dedo del pie con ningún reflejo de retirada), pin el animal en una caja Petri lleno de parafina o silicona elastómero.
      Nota: Roedores neonatales también pueden anestesiar por crioanestesia^13,14, isoflurano vaporización¹⁵, o inyección¹⁶ equilibrado con oxígeno.
   2. Coloque el lado ventral del animal hacia abajo y hacer una incisión de línea media por detrás de los ojos a la región lumbar media de la columna vertebral con una hoja de bisturí número 10 o 11 o tijeras quirúrgicas. Reflejar la piel y el animal a nivel de la sutura parietal/occipital de descerebración (ver figura 1) y quite la piel transecting el animal debajo del diafragma. Luego quite los brazos por el corte en la articulación del hombro con unas tijeras o un bisturí.
   3. Una vez que se quita la piel, traslado del animal a una cámara de perfusión con silicona elastomerin la parte inferior para mayor disección y preparación de la médula espinal de la médula oblonga.
   4. Un depósito de la aCSF (botella de 500 mL puerto lateral) de la burbuja continuamente refrigerada (4 ° c, pH 7,40 ± 0.02) aCSF y oxigeno con una mezcla de 95% O₂ y 5% CO₂ (también llamado "carbogen"). Durante la disección, utilice aCSF refrigerado para limpiar periódicamente la cámara, proporcionando aCSF oxigenada fresca en todo aislamiento de la médula espinal de la médula oblonga.
      Nota: Células de sangre rojas puede verse en las restantes arterias y venas y, cuando suficientemente oxigenada, estas son de color rojo brillante.
   5. Utilizar perfusión de flujo por gravedad vía tubería y una llave de paso, que intermitentemente o continuamente inundar el tejido con la aCSF oxigenada (bolo volumen o a través de lento goteo usando una llave de paso, aproximadamente 0.5 - 1.0 mL/min). Esto oxigena el tejido y mantiene un campo quirúrgico claro.
   6. Eliminar exceso de líquidos según sea necesario por el sistema de filtración de aspiración vacío.
   7. Realizar la disección utilizando un microscopio de disección. Es preferible un modelo de zoom continuo permite ajuste fino de aumento y permitir una visualización óptima de la región de interés durante cada paso de la disección.
      Nota: Herramientas de microcirugía recomendadas incluyen una gama de dientes tejido pinzas, fórceps romos, #5 pinzas, pinzas de ángulo del tejido, una gama de tijeras micro disección (tijeras del resorte) y regular insectos y micro disección de alfileres.
   8. Exponer la sección del cerebro a través de línea media del cráneo a lo largo de la sutura sagital, pasador aletas reflejada con micro disección de alfileres y la columna vertebral del perno en el extremo caudal en la parte inferior cubierta de silicona de la sala de disección utilizando 27 G aguja.
      Nota: El resto de la disección requiere un microscopio de disección para proporcionar la visión más clara de los tejidos y lugares utilizados para asegurar la máxima probabilidad de obtener salida fictive rítmico en las raicillas craneales del tronco encefálico y espinales raicillas. Realice estos pasos de la disección con tijeras resorte mediano o iris tijeras y pinzas finas.
2. Inmediatamente transferir el tronco aislado del animal a una sala de disección aireado. Coloque el lado dorsal de tejido hacia arriba con el extremo rostral (cerebro) hacia la parte delantera de la cámara. Pin el tejido en los hombros y el extremo más caudal de la médula espinal.
   1. Haga una incisión sagital a través del cráneo tras la sutura parietal para evitar dañar la corteza y tronco cerebral subyacente del cráneo.
      Nota: Tejido óseo neonatal no está completamente calcificada y es muy frágil. Tejido óseo será flexible a un grado, pero más dura que el conectivo circundante y el tejido muscular.
   2. Utilice tijeras resorte o diafragma medio cortar las suturas occipitales del cráneo, comenzando por la sutura sagital y lateral. Esto creará las "aletas" del cráneo que puede ser reflejado y cubrió para anclar la parte rostral del cráneo y dar cierta estabilidad al tejido (véase la figura 2A).
   3. Después de reflexionar las aletas del cráneo, cortadas el resto de la corteza cerebral, dejando la porción caudal del cerebelo (vermis) relativamente intacto (figura 2B).
3. Realizar laminectomía dorsal.
   1. Quitar la musculatura que rodea el cráneo y la columna vertebral utilizando pinzas y tijeras resorte micro. Remover el tejido a lo largo del lado dorsal de la caja torácica, dejando la caja torácica intacta, como esto se cubrió más adelante para anclar el tejido durante la laminectomía ventral, minimizando las posibilidades de daños a la médula espinal.
   2. Recorte cuidadosamente a los procesos laterales de las láminas vertebrales utilizando tijeras resorte mediano o fino iris tijeras. Corte cualquier tejido que cubre el puente de Varolio y la médula. El vermis cerebelo, puente de Varolio y comienzo de la médula espinal ahora será claramente visible (figura 2C).
4. Realizar laminectomía ventral.
   1. Baje el lado dorsal de tejido y la clavija en la caja torácica y el extremo más caudal de la espina dorsal. Precisar la parte rostral del tejido con las solapas de cráneo (figura 3A).
   2. Quite la mitad ventral de las costillas, el esternón como todos los órganos abdominales con la misma tijera y pinzas. Disecar tejidos blandos lejos a la caja torácica exponiendo las costillas y la médula espinal (figura 3B).
   3. Sacar la lengua, esófago, tráquea, laringe y todos otros tejidos blandos y la musculatura que cubre la base del cráneo y la columna vertebral (como se ve en la figura 3C).
   4. Disecar el tejido que cubre la plataforma duro-a. Identificar el paladar duro ubicando una placa rectangular de hueso en la base del cráneo con una muesca en forma de V en él (figura 3C). Corte a lo largo de la línea media del paladar, cuidadosamente levante hacia arriba y realizar un corte para quitarla (figura 4A) transversal.
   5. Comenzar una laminectomía ventral retirando láminas exponiendo la superficie ventral del tronco encefálico y la médula espinal de la primera vértebra cervical a aproximadamente vértebra torácica 7 (T7) como se ve en la figura 4B.
   6. En esta etapa, las raicillas ventrales será visibles. Usando pequeños micro-disección o tijeras primavera, tenga cuidado de hacer cortes a las láminas y lo más lejos del origen de las raíces en la médula espinal como sea posible; evitar estiramiento de las raíces.
   7. SNIP 5-10 mm a ambos lados de la columna vertebral en las láminas. No corte demasiado cerca a la médula espinal o en las vértebras. Este paso permite la eliminación de las vértebras cervicales para exponer la médula espinal. Evite cortar las raicillas.
   8. SNIP raicillas aproximadamente 20-25 mm (bilateral) a lo largo de la columna vertebral (aproximadamente T7). A través de este procedimiento evitar el corte en la médula espinal y manipular los bordes de las vértebras como se ve en la figura 4C.
   9. Eliminar C1, C2 y C3 levantando el borde rostral de cada una de las vértebras con cuidado y cortar con tijeras muy por debajo del hueso. Cuanto más cerca del hueso que se efectúa el corte, cuanto más tiempo la raicilla. Enganchado o dobladas pinzas para lograr un agarre firme sobre cada vértebra cervical haciendo cortes (figura 4C).
   10. Una vez la longitud deseada de la médula espinal aislada y disección de la columna vertebral, hacer un corte transversal para quitar la médula espinal (figura 5A yBde la figura 5).
5. Retire el mater del dura.
   Nota: el cordón espinal tronco encefálico aislado puede ser utilizado para grabación en bloque en vitro como ha sido descrito previamente^3,7. Con la médula oblonga-medular de la columna vertebral, debe eliminarse la duramadre para proporcionar un acceso óptimo para los electrodos de succión realizar grabaciones del corte craneal y espinal rootles. Además, eliminación de la duramadre hace posible limpio cortar el tronco del encéfalo y obtener lonchas finas rítmicamente activas para la grabación de in vitro.
   1. Cuidadosamente el pasador de la aislada del médula oblonga-en la médula espinal lateral dorsal de tejido hacia arriba para permitir el acceso a la duramadre que rodea el cráneo rootles (figura 5B). Pernos se deben aplicar por el margen lateral del médula oblonga, rostral a las raicillas XII.
   2. Retire la duramadre de la superficie dorsal de la médula oblonga dura con pinzas finas (#5) en el margen dorsal de la duramadre y corte de lateral a medial a través de la longitud del tronco encefálico con una tijera fina primavera. Tenga cuidado para evitar cortar dentro del médula oblonga sí mismo. Los vasos sanguíneos de la superficie del médula oblonga de Levante suavemente y corte para evitar el impedimento de la hoja vibratome al seccionar el tronco del encéfalo.
   3. Disecar cuidadosamente dura desde los aspectos mediales y laterales del tronco encefálico, como las raicillas del nervio craneal pasan a través de la dura y son fácilmente rasgadas lejos cuando se levanta la duramadre. Minimizar la probabilidad de que las raicillas se quitó cortando suavemente a su alrededor con una tijera pequeña primavera.
   4. Tirón de la médula espinal tronco encefálico para que la superficie ventral se enfrenta y las raicillas craneales son claramente visibles. Disecar la duramadre de la parte dorsal del tronco encefálico levantando suavemente la dura directamente sobre el área postrema, corte de rostral a caudal. El área postrema aparecerá ligeramente rosado debido a la gran cantidad de microcapilares inunda la región.
   5. Usar un fino alfiler insectos para fastidiar a cualquier dura restante y eliminar vasos restantes en proximidad cercana a raicillas craneales y cervicales.

4. rodaja de protocolo

1. Después de retirar la duramadre, colocar el tronco encefálico en el centro de la plataforma de parafina en el bloque de plástico (en lo sucesivo, el "bloque de corte"). Prender con alfileres el extremo caudal del tronco encefálico a través de la médula espinal distal con finos alfileres insectos que han sido recortados a no más de 1 cm de longitud como se muestra en la figura 5C.
2. Alinee el bloque de corte cubierta de parafina con el médula oblonga fijado en el soporte del bloque vibratome que la cuchilla corte perpendicular a la cara rostral del tronco encefálico.
3. Hacer un corte inicial para extirpar el tejido desigual, extraño en el extremo más rostral. Este corte inicial puede ser de 200-300 μm típicamente pero cuidadosamente evitar eliminación de raicillas craneales IX, X y XII. Este paso normalmente revelará la parte caudal del núcleo facial (VII) y las raicillas del glosofaríngeo y permite alinear el tronco encefálico para que su cara es par es plana la hoja vibratome. Hacer pequeños ajustes cuando sea necesario para garantizar la par-planaridad y hacer pequeños cortes para remover el tejido que es desigual.
   Nota: Raicillas del glosofaríngeo (IX) será visibles en el borde lateral del médula oblonga y uno corta cada rebanada sucesiva, estos proporcionan un punto de referencia para la distancia rostro caudal a los circuitos neuronales de la médula oblonga es necesario para la generación de ritmo. En el lado ventral del tronco encefálico, las raicillas hipoglosos (XII) deben también verse ligeramente caudal a la cara de corte mostrando las raicillas IX. Un punto de referencia final será el obex (el punto en el cerebro humano en el que el cuarto ventrículo se estrecha para convertirse en el canal central de la médula espinal) en la cara dorsal del tronco encefálico. Con estos tres puntos de referencia visibles, que el plano de corte correcta es establecieron (véase la figura 6A) y se obtendrá confiablemente una rebanada rítmicamente activa.
4. Continuar corte caudal a rostral hasta las raicillas IX están cerca de la superficie de la cara cortada del tronco encefálico.
5. Consulte la figura 6 para puntos de referencia y orientación correcta. Ajuste la placa de parafina en la abrazadera de vibratome para que el siguiente ángulo de transección se crea una forma muy leve "cuña" a la rebanada cortada y cortar rodajas de aproximadamente 100-200 μm hasta los hitos descritos pueden ser visto claramente (figura 6A).
   Nota: Esta cuña ligera aumenta el número de las neuronas motoras de la XII en el segmento y maximiza la probabilidad de obtener actividad rítmica durante la grabación. Utilizando los hitos descritos (raicillas rostrales del paquete del nervio glosofaríngeo, raicillas del paquete del nervio hipogloso, el obex) se asegurará de que el segmento reproductivo contiene al menos una gran parte de la pBC (figura 6B).
6. Cortar una rebanada del μm 300-500 del médula oblonga de estos marcadores neuroanatomical rostrales para capturar el pBC y asociados circuitos de transmisión.
   Nota: Una rebanada "ideal" contendrá la raicilla más rostral del paquete raicilla hipogloso confiablemente obtener actividad inspiratoria sin recurrir a grabaciones superficiales utilizando un electrodo de succión sobre el ritmo-generación/transmisión de lugares geométricos en el médula oblonga.

5. grabación procedimientos

1. Coloque la rebanada en una cámara de grabación, perfusión continua con aCSF (0.5 - 1.0 mL/min) y utilizar electrodos de succión o extracelulares a la actividad de registro de población de las raicillas XII o de la pBC, XII PMNs o motoneurons XII. Grabación detallada de procedimientos, ver publicaciones anteriores sobre electrofisiología de la médula espinal de la médula oblonga y parche sujeción^10,11.

Resultados

El método presentado aquí permite un investigador interesado en la obtención de rodajas rítmicamente activas del médula oblonga reproducible y fiable cortar un sector viable y robusto que permite la grabación de salida del motor fictive de muchas horas. Todos los elementos de circuito neuronal mínimamente necesario para generar y transmitir el ritmo inspiratorio pueden ser capturados en una rebanada fina usando este método. Estos elementos incluyen: preBötzinger complejo premotor...

Discusión

Adaptando el protocolo presentado aquí en un en bloque o rebanada workflow es ventajosa para los laboratorios y estudios que le gustaría utilizar ya sea medular en bloque del tronco encefálico o delgada rebanada preparados para grabaciones de electrofisiología. El método de disección y corte presentado, combinado con métodos divulgados previamente por otros^17,18,19, permitirá la preparación reproducible de tejido viable...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
KCl	Sigma Aldrich	P5405-1KG
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1
NaH2PO4 •H2O	Sigma Aldrch	S9638-25G
CaCl2•2H2O	Sigma Aldrich	C7902-500G
MgSO4•7H2O	Sigma Aldrich	M7774-500G
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W	AmScope	H2L50-AY
Dissection Microscope	Leica	M-60
Vibratome 1000 Plus	Vibratome	W3 69-0353
Magnetic Base	Kanetic	MB-B-DG6C
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades	Wilkinson	97573
Histoclear	Sigma-Aldrich	H2779
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5/45 Forcep	Fine Science Tools	11251-35
Scalpel Blades #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handel #3	Fine Science Tools	10003-12
Spring Scissors Straight	Fine Science Tools	15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight	Fine Science Tools	11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight	Roboz	RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved	Roboz	RS-5621
Insect pins, 0	Fine Science Tools/8840604	26000-35
Insect pins, 0, SS	Fine Science Tools	26001-35
Insect pins, 00	Fine Science Tools	26000-30
Insect pins, 00, SS	Fine Science Tools	26001-30
Insect pins, 000	Fine Science Tools	26000-25
Insect pins, 000, SS	Fine Science Tools	26001-25
Minutien pins, 0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10
Minutien pins, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Minutien pins, 0.2 mm	Fine Science Tools	26002-20
Fisher Tissue prep Parafin	fisher	T56-5
Graphite	fisher	G67-500
Delrin Plastic	Grainger	3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle	BD	305195