Ritmik aktif hazırlanması Vitro yenidoğan kemirgen beyin-omurilik ve ince dilim

Özet

Bu iletişim kuralı hem görsel olarak beyin-omurilik hazırlık iletişim kurar ve beyin sapı enine dilimleri hazırlanması kapsamlı adım adım bir şekilde açıklar. Bu tekrarlanabilirlik artırmak ve beyin solunum bölgelerinden sinir çıkış kayıt için uygun, uzun ömürlü, ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için tasarlanmıştır.

Özet

Memeli inspiratory ritim inspiratory kasların ritmik kasılma sürüş bir sinyal üreten preBötzinger karmaşık denilen medulla (pBC), bir bölgede nöronal ağ üzerinden oluşturulur. Ritmik sinirsel aktivite pBC içinde oluşturulan ve nöronal havuzlarını solunum kas en bloc sinir kayıtları ve enine dilim kayıtları da dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak okudu sürücü için yapılır. Ancak, daha önce yayımlanmış yöntemleri yaygın beyin-omurilik diseksiyon işlem gelecekteki çalışmaları için şeffaf ve tekrarlanabilir bir şekilde tarif var değil. Burada, kapsamlı bir genel bakış tekrarlanarak ritmik aktif beyin sapı dilimleri oluşturma ve gönderme inspiratory sürücü için gerekli ve yeterli nöronal devreler içeren kesmek için kullanılan bir yöntem mevcut. Bu eser üzerine güvenilir pBC, hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), nöronal çıktısı kayıt için uygun ve ritmik aktif dilimleri elde etme olasılığını artırmak için önceki beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolleri kurar ve hypoglossal motor nöronlar (XII MN). Sunulan iş önceki Yayınlanan yöntemleri XII rootlets içeren tüp bebek dilim tüm fare yavru, diseksiyon, ayrıntılı, adım adım çizimleri sağlayarak genişletir.

Giriş

Beyin solunum neural ağ ritmik sinir ağları genel özelliklerini anlamak için verimli bir alan sağlar. Özellikle, nefes ve nefes ritim nasıl gelişir anlama yenidoğan kemirgen gelişiminde meselesi. Bu-ebilmek var olmak içinde vivo bütün hayvan pletismografisi, tüp bebek en bloc de dahil olmak üzere sinir kayıtları, çok düzeyli bir yaklaşım kullanarak yapılır ve tüp bebek dilim solunum ritmi jeneratör içeren kayıtları. İndirgemeci vitro tr blok ve dilim kayıtları için solunum rhythmogenesis ve kemirgenler geliştirme beyin-omurilik bölgedeki nöro çevrim arkasında mekanizmaları sorguya kullanılacak avantajlı bir yöntemi vardır. Gelişmekte olan solunum sistemi desen merkezi solunum^1,2de dahil olmak üzere, ateş tarafından karakterize yaklaşık 40 hücre tipleri, içerir. Merkezi solunum ağ ritmik aktif nöron ventrolateral rostral medulla^1,3' te yer alan bir grup içerir. Memeli solunum rhythmogenesis oluşturulan bir autorhythmic üzerinden olmuştur karmaşık preBötzinger lakaplı interneuron ağ (pBC), deneysel olarak lokalize yenidoğan memeli dilim ve en bloc hazırlıkları beyin-omurilik^3,4,5,6,7,8kordonlar. Bu bölge merkezinde Sinoatriyal düğüm (SA) benzer bir işleve hizmet eder ve bir inspiratory zamanlama sistemi sürücü solunum için oluşturur. PBC inspiratory ritim (hypoglossal motor çekirdeğini de dahil olmak üzere) beyin sapı ve omurilik motor havuzları (örneğin diyafram sürücü frenik motor nöronlar)⁹diğer bölgelerinde yapılmaktadır.

Ritmik etkinlik elde edilebilir beyin omurilik tr bloku hazırlıklar veya hücre popülasyonlarının, C3-C5 sinir rootlets, XII sinir rootlets, dahil olmak üzere çeşitli dilimleri kullanarak hypoglossal motor çekirdeğini (XII MN), hypoglossal premotor nöronlar (XII pMN), ve pBC^3,10,11,12. Bu yöntemler, veri toplama laboratuvarlar bir avuç arasında başarılı olmuş olsa da, birçok iletişim kurallarının tam olarak alan girerek yeni araştırmacılar için tekrarlanabilir bir şekilde sunulmaktadır değil. Uygun ve ritmik aktif tr blok ve dilim hazırlıklar alma diseksiyon ve dilim kesme protokol tüm adımlarda detaylara akut bir dikkat gerektirir. Önceki iletişim kuralları kapsamlı çeşitli kayıt yordamları ve Elektrofizyoloji tarif henüz eksikliği ayrıntılı olarak uygun doku hazırlık almak en önemli bölümüdür: beyin-omurilik diseksiyon ve dilim işlemi yapmadan.

Verimli bir ritmik-aktif ve uygulanabilir tr blok veya dilim hazırlık beyin-omurilik Elektrofizyoloji kayıtları alma gerektirir tüm adımların doğru dikkatli bir şekilde ve hızla gerçekleştirilmesi (genellikle, tüm prosedürü burada-ebilmek var olmak ilgili «««yapılır) yaklaşık 30 dk içinde. Kritik noktaları beyin-omurilik Elektrofizyoloji protokolünün değil daha önce de tarif edilmistir sinir rootlets ve vibratome Dilimleme ameliyat diseksiyon içerir. Kademeli ilk görsel olarak beyin-omurilik diseksiyon yeni araştırmacılar ve alanında uzman için iletişim kuralıdır. Bu iletişim kuralı da iyice cerrahi teknikleri, simge ve gelecekteki araştırmacılar dilimleri ve en bloc hazırlıkları her deneyde istenen tam devre içerecek şekilde standartlaştırılması yardımcı olmak için diğer yordamları açıklar. Burada sunulan yordamları fare ve fare yenidoğan pups içinde kullanılabilir.

Protokol

Aşağıdaki iletişim kuralı kabul ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Loma Linda Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. NIH yönergeleri için belgili tanımlık ahlaki muamele-in hayvan laboratuvarda yapılan tüm hayvan deneyleri takip edilmektedir. Bütün etik standartları bu protokolü gerçekleştiren kişiler tarafından onayladı.

1. çözümler

1. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın.
   1. Taze aCSF akşam önce aşağıdakileri kullanarak 1 L gruplar halinde bir deneme hazırlamak tarifi: 7.250 g NaCl (124 mM), 0,224 g KCl (3 mM), 2,100 g NaHCO₃ (25 mM), 0,069 g NaH₂PO₄ • H₂O (0.5 mM), 0.247 g MgSO₄ • 7 H₂ O (1.0 mM) ve 5.410 g D-glukoz (30 mM), 0,221 g CaCl₂ • 2 H₂O (1.5 mM). Her zaman CaCl₂ • 2 H₂O son ekleyin.
   2. Bileşenleri deiyonize su 1 L geçiyoruz. 20-30 dk için karıştırın.
   3. ACSF pH ölçümü ve ayarlamak 7,40 ± 0,02 küçük birimleri kullanma (genellikle < 0.5 mL) seyreltik NaOH, KOH veya HCl.
      Not: Hazır aCSF (4 ° C, pH 7,40 ± 0,02) buzdolabında üç gün önce Bakteriyel büyüme canlılık dokusunun bir deney sırasında etkiler için saklanabilecek olan. Deneyler en fazla 36 saat sürebilir bu yana kirlenme mantar veya bakteri laboratuvarda mevcut azaltmak için 0.2 µm filtreleri kullanın. Verimlilik için açıklanan aCSF tarifi 4 L toplu işlemleri aynı protokol sonrası ölçekli ve bu birimin deneyler için en fazla üç gün sürecek.

2. diseksiyon ve Vibratome teçhizat hazırlanması

1. Bıçak kadar ayarla.
   1. Bir vibratome üzerinde kesme doku için taze bir iki ucu keskin jilet kullanın. % 100 etanol bıçakla yıkama ve kesme veya bıçak ikiye yapışma ve bıçağın montaj içine ekleme vibratome üzerinde kelepçe önce deiyonize suyla durulayın.
   2. Bıçağın her zaman yeni bir doku hazırlık Dilimleme için vibratome üzerine monte veya parafin levha Dilimleme süre keser değiştirin. Herhangi bir parafin kalıntı da temiz bir şekilde yenidoğan sinir doku ile kesmek neredeyse imkansız hale getirecek.
2. Parafin blok ayarlayın.
   1. Herhangi bir gömme tarzı parafin kullanın. Medya ısı dayanıklı cam kabı içinde katıştırma 10 g ve düşük ısı için Sıvı parafin boncuk eritmek için kullanın.
   2. Yaklaşık 0,5 g grafit tozu ve çözüm Sıvı parafin iyice ve düzgün karıştırın.
   3. Küçük bir plastik levha substrat parafin için kullanın. Plastik bir küçük (0.5 - 1 cm kalınlığında ve yaklaşık 2 x 2 cm² geniş) parça kesip (polikarbonat veya alüminyum da kullanılabilir). Asthis parafin plastik bağlı kalır sağlayacaktır plastik içine bir makinistin dosyasını sıfırdan oluklar için kullanın.
      Not: Alternatif olarak, ısıtmalı 18 G Hipodermik İğne parafin-grafit karışımı plastik bağlıdır sağlamak için sayfa içine açılı delik eklemenizi sağlar.
   4. Bir pamuk uç aplikatör arka plastik parafin-grafit karışımı tekrar tekrar aplikatör erimiş parafin-grafit karışım içine daldırma, bulamaç plastik blok üzerine damlama ve parafin-grafit bina damla kullanın yaklaşık 1.5 cm kalınlığında plastik üzerine.
   5. Parafin-grafit mix yeterince kalın bir tabaka blok ödeme yapıldıktan sonra blok bir kenara serin ve beyin-omurilik sığması için şekli ayarlayın.

3. diseksiyon ve Neuraxis izolasyonu

1. İlk diseksiyon ve anesthetization gerçekleştirmek.
   Not: bu çalışmada kullanılan hayvanlar aralığı boyutu embriyonik gün 18 (E18) Doğum sonrası günde 10-20 fare ya da sıçan E18 postnatal gün arasında değişen 5/6. Fareler veya herhangi bir zorlanma, tedavi veya cinsiyet fareler, deneysel tasarımına bağlı olarak kullanılabilir. İsoflurane (25 mL odasında 0.25 mL) kullanıldığı için anestezi ve duman başlık altında ön diseksiyon gerçekleştirin.
   1. Yavru fok tartmak ve 2 x 2 inç² gazlı bez parçası yerleştirilir isoflurane 0.25 mL içeren bir anestezi odası yer. Hayvan (ayak çimdik yok para çekme refleks ile tarafından doğrulanmadı) anestezi cerrahi bir uçak ulaştıktan sonra PIN petri kabına hayvan parafin veya silikon elastomer ile dolu.
      Not: Yenidoğan kemirgen-da var anestezi cryoanesthesia^13,14via, isoflurane buharlaşma¹⁵, veya enjeksiyon¹⁶ dengeli ile oksijen.
   2. Hayvan ventral haricinde yerleştirin ve bir ensizyon üzerinden hemen arkasında gözleri orta lomber bölgeye omurga, 10 ya da 11 numara neşter neşter ya da cerrahi makas ile yapmak. Cilt yansıtmak ve hayvan Paryetal/oksipital dikiş düzeyinde decerebrate (bkz. şekil 1) ve diyafram altında hayvan transecting deri kaldırmak. Sonra silah omuz eklemi de keserek makas veya bir neşter ile kaldırın.
   3. Bir kez cilt çıkarmak, hayvan bir perfüzyon odası silikon elastomerin daha fazla diseksiyon ve beyin-omurilik hazırlanması için alt ile aktarın.
   4. Bir aCSF rezervuar (500 mL yan-port şişe) sürekli olarak soğutulmuş (4 ° C ile pH 7,40 ± 0,02) kabarcık aCSF ve % 95'i O₂ ve %5 CO₂ ("carbogen" olarak da adlandırılır) karışımı ile oksijen. Diseksiyon sırasında soğutulmuş aCSF yalıtım beyin omurilik boyunca taze oksijenli aCSF sağlayan odası, düzenli olarak temizlemek için kullanın.
      Not: Kırmızı kan hücreleri kalan atar ve toplar damarlardaki görülebilir ve yeterince oksijenli, parlak kırmızı şunlardır.
   5. Sürekli oksijenli aCSF (bir stopcock, yaklaşık 0.5 - 1.0 mL/dk kullanarak bolus birim veya üzerinden yavaş damla) ile doku sıvı veya yerçekimi akış perfüzyon ile boru ve bir stopcock zaman zaman için kullanın. Bu doku havasını ve açık cerrahi bir alanı içerir.
   6. Aşırı sıvı vakum emme filtrasyon sistemi tarafından gerektiği şekilde kaldırın.
   7. Diseksiyon mikroskop kullanarak diseksiyon gerçekleştirin. Sürekli yakınlaştırma manken büyütme iyi ayarlanmasına izin ve faiz bölgenin en iyi görselleştirme her adımında diseksiyon sırasında izin vermek için tercih edilir.
      Not: Önerilen mikrocerrahi araçları dahil bir dizi dişli doku forseps, künt forseps, #5 forseps, açılı doku forseps, çeşitli mikro diseksiyon makası (Bahar makas) ve normal böcek ve mikro-anatomi pimleri.
   8. Beyin ile orta hat bölümünde kafatası sagittal dikiş boyunca maruz sonra mikro-anatomi pimleri ile yansıyan kanatları pin ve omurga 27 G kullanarak diseksiyon odası silikon kaplı altına Kaudal sonunda pin iğne.
      Not: Diseksiyon diğer doku ve kraniyal rootlets, beyin ve omurilik rootlets ritmik kurgusal çıktı alma maksimum izlenebilmesi için kullanılan Simgesel en net görünümünü sağlamak için diseksiyon mikroskop gerektirir. Diseksiyon orta bahar makas veya Iris makas ve iyi forseps kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
2. Derhal hayvan izole bagajında bir gazlı diseksiyon odasına aktar. Doku dorsal yan odasının ön bakan rostral sonunda ile (beyin) yerleştirin. PIN omuz ve omurilik en Kaudal sonunda doku.
   1. Parietal dikiş korteks ve kafatası temel beyin sapı zarar görmesini önlemek için aşağıdaki kafatası ile orta-sagittal bir kesi yapmak.
      Not: Yenidoğan kemik dokusu değil tamamen kireçlenme ve çok kırılgan. Kemik/doku bir dereceye kadar esnek ama çevreleyen bağ ve kas dokusu daha zor olacak.
   2. Oksipital dikiş sagittal dikiş başlayan ve yanal çalışma kafatası makasla kesme için orta bahar ya da Iris makas kullanın. Bu "flep" yansıyan ve kafatası rostral parçası çapa ve doku bazı istikrar sağlamak için pinned kafatası oluşturur ( Şekil 2Abakınız).
   3. Serebral korteksin diğerlerini kesmek kafatası flep yansıtan sonra beyincik (vermis) nispeten sağlam (Şekil 2B) Kaudal kısmını bırakarak.
3. Dorsal laminektomi gerçekleştirin.
   1. Kafatası ve vertebral mikro bahar makas ve forseps kullanarak sütun çevreleyen kas kaldırın. Bu daha sonra omurilik hasarı olasılığını en aza indirgemek ventral laminektomi sırasında doku tutturmak tutturulmuş gibi göğüs kafesi dokunmadan göğüs kafesi sırt tarafındaki dokuyu.
   2. Dikkatli bir şekilde uzağa orta bahar makas veya iyi Iris makas kullanılarak vertebra lamina yanal süreçlerinin makasla kesme. Pons ve medulla örten doku Kes gitsin. Şimdi açıkça görülebilir (Şekil 2C) vermis, beyincik, pons ve spinal kord başlangıcı olacak.
4. Ventral laminektomi gerçekleştirin.
   1. Doku dorsal tarafta sesini kısar ve göğüs kafesi ve en Kaudal omurga sonunda pin. Doku rostral tarafında kafatası kapakları (şekil 3A) kullanarak pin.
   2. Göğüs kafesi, göğüs kemiği ve aynı makas ve forseps kullanarak tüm karın organları gibi ventral yarısı kaldırın. Kaburga ve spinal kord (şekil 3B) teşhir kafesi bağlı uzak yumuşak doku incelemek.
   3. Dil, yemek borusu, nefes borusu, gırtlak ve tüm diğer yumuşak doku ve kas kafatası ve omurga ( şekil 3' teCgörüldüğü gibi) örten kaldırın.
   4. Zor palet örten doku incelemek. Sert yüzey (şekil 3C) üzerinde bir şekil V girinti ile kafatasının, kemik bir dikdörtgen tabak bularak tanımlayın. Damak orta çizgi kesmek, dikkatli bir şekilde yukarı doğru kaldırın ve (şekil 4A) kaldırmak için kesilmiş bir enine gerçekleştirmek.
   5. Ventral laminektomi ventral yüzeyinden beyin sapı ve omurilik ilk servikal omur yaklaşık torasik vertebra 7 (T7) için şekil 4' teBgörüldüğü gibi açığa lamina kaldırarak başlayın.
   6. Bu aşamada, ventral rootlets görünür hale gelir. Küçük mikro-diseksiyon veya bahar makas kullanılarak, kesim lamina gibi yakın ve uzak kökleri köken olarak mümkün olduğunca spinal kord, yapmak dikkat çekmek; kökleri germe kaçının.
   7. Her iki omurga boyunca 5-10 mm lamina makasla kesme. Çok yakın omurilik veya vertebra kesmeyin. Bu adımı servikal vertebra omurilik ortaya çıkarmak için izin verir. Rootlets kesme önlemek.
   8. Rootlets yaklaşık 20-25 mm (bilateral) omurga (yaklaşık T7) makasla kesme. Bu yordam boyunca omurilik içine kesme önlemek ve şekil 4' teCgörüldüğü gibi omurga kenarlarını işlemek.
   9. C1, C2 ve C3 dikkatle rostral kenarına her vertebra kaldırma ve yakından altında kemik kırpma çıkarın. Kemik kesme yapılır ki, ne kadar uzun rootlet yakın. Kullanım çengel veya forseps kesim (şekil 4C) yaparken her servikal vertebra sağlam bir tutuş elde yardımcı olmak için eğildi.
   10. Spinal kord istenilen uzunluğa izole ve vertebral sütundan disseke sonra spinal kord (şekil 5A ve şekil 5B) kaldırmak için bir çapraz kesim yapmak.
5. Dura mater kaldırın.
   Not: daha önce açıklanan^3,7olduğu gibi izole beyin-omurilik-ebilmek var olmak kullanılmış en bloc tüp bebek kayıt için. Vertebral sütundan kaldırıldı beyin-omurilik ile dura kesim kafatası ve omurga kayıtları gerçekleştirmek emme elektrotlar için optimal erişim rootles sağlamak için kaldırılması gerekir. Ayrıca, beyin zarı çıkarılması temiz bir şekilde beyin dilim ve tüp bebek kayıt için ritmik etkin ince dilimler elde etmek olanak sağlar.
   1. Dikkatli bir şekilde izole beyin-omurilik altında doku dorsal tarafta kadar beyin çevreleyen dura erişmesine izin vermek için kordon PIN (şekil 5B) rootles. İğne, beyin sapı, XII rootlets rostral yanal marjı ile uygulanmalıdır.
   2. Beyin zarı beyin dorsal yüzeyinden ince forseps (#5) ile dura kaldýrarak çýkarýn dura dorsal kenar boşluğunda ve lateral medial beyin uzunluğu boyunca güzel bahar makasla kesme. Beyin sapı kendisi içine kesme önlemek için dikkatli olun. Yavaşça damarlar beyin sapı yüzey kaldırın ve beyin sapı kesit vibratome bıçak engel önlemek için kesti.
   3. Kranial sinir rootlets dura geçmek ve beyin zarı kaldırdı kolayca uzağa yırtılmış gibi dikkatle dura beyin sapı, medial ve lateral açıdan incelemek. Yavaşça onları küçük bahar makasla keserek çıkardı rootlets olasılığını en aza indirmek.
   4. Beyin-omurilik fiske vurmak böylece yukarı dönük menfez yüzey ve kraniyal rootlets açıkça izlenebiliyor. Beyin dorsal tarafta dura doğrudan alan postrema rostral Kaudal için kesme, üzerine hafifçe dura kaldırarak incelemek. Alan postrema bu bölge Ventriküler microcapillaries çok sayıda nedeniyle biraz pembe görünür.
   5. İyi bir böcek PIN uzak kalan herhangi bir dura alay ve kafatası ve servikal rootlets yakın kalan kan damarları kaldırmak için kullanın.

4. dilim Protokolü

1. Beyin zarı kaldırdıktan sonra beyin sapı (bundan sonra "kesme taşı" olarak anılacaktır) plastik blok parafin platformda ortasına yerleştirin. Beyin sapı ile en fazla 1 cm uzunluğunda şekil 5' teCgösterildiği gibi kesilmiş iyi böcek iğne kullanarak distal spinal kord Kaudal sonu pin.
2. Şekilde bıçak dik beyin rostral yüzünü keser parafin kaplı kesme blok vibratome blok tutucu sabitlenmiş beyin sapı ile hizalayın.
3. Düzensiz, yabancı dokuyu rostral en ucunda bir ilk dilim olun. Bu ilk kesik 200-300 µm genellikle ama dikkatle önlemek IX, X ve XII kraniyal rootlets kaldırılması olabilir. Bu adım genellikle yüz çekirdeği (VII) ve glossopharyngeal rootlets Kaudal ölçüde ortaya çıkaracaktır ve yüzünü par-vibratome bıçak düzlemsel böylece beyin hizalamak olanak sağlar. Par-planarity sağlamak ve düzensiz doku kaldırmak için küçük kesim yapmak için gerekli küçük ayarlamalar yapmak.
   Not: Glossopharyngeal (IX) rootlets bir birbirini izleyen her dilim keser ve bu ritim-üretimi için gerekli beyin sapı nöro çevrim rostro Kaudal uzaklık için bir dönüm noktası sağlamak gibi beyin yan kenarında görünür. Beyin ventral tarafta hypoglossal rootlets (XII) da görünür olması gereken biraz Kaudal IX rootlets gösterilen kesilmiş yüz. Son bir dönüm noktası obex (hangi dördüncü ventrikül omurilik Merkezi kanal olmak için basit bir şey insan beyni noktasında) beyin dorsal yüzünde olacak. Bu üç referans noktaları ile görünür, doğru kesme uçak (bkz. şekil 6A) kurulmuş ve ritmik aktif dilim güvenilir bir şekilde elde edilir.
4. IX rootlets beyin sapı kesilmiş yüz yüzey olana kesme rostral-için-Kaudal devam.
5. Şekil 6 simge ve doğru yönlendirme için bakınız. Transeksiyon sonraki açısını kesme dilim için çok hafif "kama" şekil oluşturma ve açıklanan yerlerinden olana kadar yaklaşık 100-200 µm dilimler kesip vibratome kelepçe içinde parafin levha ayarlayın (şekil 6A) açıkça görüldü.
   Not: Bu hafif takoz kesme XII motor nöronlar dilimi yakalanan sayısını artırır ve ritmik aktivite kayıt sırasında elde etme olasılığını en üst düzeye çıkarır. İşaretlerini kullanarak açıklanan (glossopharyngeal sinir demeti, rootlets üzerinden hypoglossal sinir demeti, obex rostral rootlets) dilimi tekrarlanarak pBC (şekil 6B) en az bir büyük bölümünü içeren sağlayacaktır.
6. PBC yakalamak için bu rostral nöroanatomik işaretleri beyin sapı 300-500 µm dilim kes ve iletim devresi ilişkili.
   Not: "İdeal" bir dilim en rostral rootlet güvenilir bir şekilde ritim-oluşturma/vericisi loci içinde üzerinde emme bir elektrot kullanarak yüzey kayıtları için başvurmadan inspiratory etkinlik elde etmek için hypoglossal rootlet paket içerir Beyin sapı.

5. kayıt işlemleri

1. Dilimi bir kayıt odasında, sürekli olarak aCSF (0.5 - 1.0 mL/dk) ile sıvı ve emme veya hücre dışı elektrotlar kayıt nüfus etkinliği için XII rootlets veya pBC, XII PMNs veya XII motoneurons kullanın. Detaylı kayıt işlemleri, önceki yayınları bkz: beyin-omurilik Elektrofizyoloji ve sıkma^10,11yama.

Sonuçlar

Burada sunulan yöntemi bir araştırmacı baktılar tekrarlanarak ve güvenilir bir şekilde kurgusal motor çıkış kaydı saatlerce sağlayacak uygun, sağlam bir dilim kesmek için beyin sapı ritmik etkin dilim elde sağlar. Üreten ve inspiratory ritim gönderme için en az gerekli nöral devre öğeleri bu yöntemi kullanarak bir ince dilim yakalanabilir. Bu öğeleri şunları içerir: preBötzinger kompleksi, premotor nöronlar hypoglossal motor nöronlar (pXII MNs) projelendirm...

Tartışmalar

Protokol adapte burada sunulan bir tr blok veya dilim iş akışı laboratuarlar için avantajlıdır ve ya en bloc beyin-omurilik kullanmak ve/veya ince istiyorum çalışmalar Elektrofizyoloji kayıtları için hazırlıklar dilim. Diseksiyon ve dilim yöntem sundu, daha önce başkaları tarafından rapor yöntemleri ile birlikte^17,18,19, tekrarlanabilir hazırlanması için bir dizi yaygın olarak uyarlanabilir sağlam ve uy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
KCl	Sigma Aldrich	P5405-1KG
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-1
NaH2PO4 •H2O	Sigma Aldrch	S9638-25G
CaCl2•2H2O	Sigma Aldrich	C7902-500G
MgSO4•7H2O	Sigma Aldrich	M7774-500G
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270-1KG
Cold-Light source Halogen lamp 150 W	AmScope	H2L50-AY
Dissection Microscope	Leica	M-60
Vibratome 1000 Plus	Vibratome	W3 69-0353
Magnetic Base	Kanetic	MB-B-DG6C
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Sword Classic Double Edge Blades	Wilkinson	97573
Histoclear	Sigma-Aldrich	H2779
Dumont #5 Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5/45 Forcep	Fine Science Tools	11251-35
Scalpel Blades #10	Fine Science Tools	10010-00
Scalpel Handel #3	Fine Science Tools	10003-12
Spring Scissors Straight	Fine Science Tools	15024-10
Narrow Pattern Forcep Serrated/straight	Fine Science Tools	11002-12
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight	Roboz	RS-5650
Vannas Scissors 3" Curved	Roboz	RS-5621
Insect pins, 0	Fine Science Tools/8840604	26000-35
Insect pins, 0, SS	Fine Science Tools	26001-35
Insect pins, 00	Fine Science Tools	26000-30
Insect pins, 00, SS	Fine Science Tools	26001-30
Insect pins, 000	Fine Science Tools	26000-25
Insect pins, 000, SS	Fine Science Tools	26001-25
Minutien pins, 0.10 mm	Fine Science Tools	26002-10
Minutien pins, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Minutien pins, 0.2 mm	Fine Science Tools	26002-20
Fisher Tissue prep Parafin	fisher	T56-5
Graphite	fisher	G67-500
Delrin Plastic	Grainger	3HMT2
18 Gauge Hypodermic Needle	BD	305195