JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة "ميوفاسكولار".

Abstract

خلايا بطانية للهيكل العظمى والعضلات الشعيرات الدموية (العضلات خلايا بطانية ميكروفاسكولار، مك) بناء الحاجز بين مجرى الدم وعضلات الهيكل العظمى التي تنظم تبادل السوائل والمواد الغذائية، فضلا عن الاستجابة المناعية ضد المعدية وكلاء بمراقبة الهجرة الخلية المناعية. لأداء هذه المهام، تشكل مك وظيفية "وحدة ميوفاسكولار" (مفو)، مع زيادة أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، وبيريسيتيس، وخلايا الهيكل العظمى والعضلات. ونتيجة لذلك، يسهم خلل وظيفي مك ومن ثم مفو مجموعة متنوعة واسعة من ميوباثيس. ومع ذلك، آليات تنظيمية من مك في الصحة والمرض تظل مفهومة غير كاف وعلى توضيح تسبق علاجات أكثر تحديداً ميوباثيس. عزلة والتحقيق المتعمق في وظائف مك الأولية في سياق مفو قد تيسر فهم أفضل لهذه العمليات.

توفر هذه المقالة بروتوكول لعزل مك مورين الأولية من الهيكل العظمى والعضلات بالتفكك الميكانيكية والانزيميه بما في ذلك تنقية وخطوات الحفاظ على الثقافة.

Introduction

عبر مجرى الدم والخلايا والأجهزة مزودة بالأكسجين وركائز والجزيئات الضرورية الأخرى. ويجري هذا التبادل في الشعيرات الدموية، سفن أصغر. الشعيرات الدموية تتشكل من طبقة خلايا بطانية داخلية (EC) سلامتها يظل شرطا أساسيا للتنظيم الناجح للعضلات التوازن بين المساحة داخل الأوعية والمتداخلة. لضمان انتقال انتقائية من العوامل القابلة للذوبان والخلايا، تشكل الجماعة الأوروبية أحادي الطبقة مترابطة بضيق و تقاطعات أدهيرينس 1. وإلى جانب دورها كحاجز للمواد الغذائية أو المنتجات الأيضية، تنظيم المفوضية الأوروبية تجنيد الكريات البيضاء في عمليات الالتهابات. أضرار التهاب أو الأنسجة يؤدي إلى أعلى لائحة جزيئات الالتصاق على السطح EC وإنتاج المستقطبات تيسير مرفق الكريات البيض والتهجير في الأنسجة المستهدفة 2. ونتيجة لذلك، تشارك المفوضية الأوروبية حاسمة في تنظيم عمليات تحريضية مثل الدفاع ضد العوامل الممرضة أو إصلاح الأنسجة.

خلل من المفوضية الأوروبية مباشرة المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية والفشل الكلوي المزمن وتجلط وريدي مسببات المرض شديد العدوى. وعلاوة على ذلك، تشارك المفوضية الأوروبية تقريبا دائماً في الخاصة بجهاز المناعة الذاتية مثل السكري أو التصلب المتعدد 3. وظيفة الحاجز بين مجرى الدم والأجهزة ولذلك تسيطر تفاعل متضافرة من أنواع مختلفة من الخلايا. في الهيكل العظمى والعضلات microvascular غشائي الخلايا (مك) جنبا إلى جنب مع خلايا العضلات، الليفية وبيريسيتيس تشكل وحدة وظيفية، ووحدة "ميوفاسكولار" (مفو). ولذلك، اختلال وظيفي مفو قد دور حاسم في الفسيولوجيا المرضية ميوباثيس. ومع ذلك، فهم أعمق لهذه الآليات التنظيمية لا يزال مفقوداً وحاليا يحول دون تحديد أهداف جديدة، وهناك حاجة ماسة إليها، والعلاجية في ميوباثيس.

للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية المعقدة، ويشيع استخدام نماذج حيوانية. ومع ذلك، ميزة نماذج في المختبر التركيز على هذا موضوع اهتمام باستثناء مجموعة متنوعة من العوامل المؤثرة الأخرى. للتحقيق في العمليات في المختبر من الضروري عزل الخلايا الابتدائية نقية وقابلة للحياة. وعلى النقيض من خطوط الخلايا، تمكين الخلايا الأولية المعزولة من الحيوانات المحورة وراثيا بالتحقيق في آثار التعديلات الوراثية في المختبر.

هنا، يتم وصف طريقة لعزل مك مورين الأولية باستخدام التفكك الميكانيكية والانزيميه متبوعاً بخلية تنشيط مغنطيسية الفرز تقنيات (MCS) لتنقية. وتستخدم لهذا الغرض، حبات مغناطيسية ضد علامات سطح معين. الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (PECAM1, CD31) هو أساسا عن المفوضية الأوروبية ويمكن استخدامها لإثراء هذا النوع الخلية. لتبرير خلية عالية النقاء، مستبعدة خلايا المنشأ المكونة للدم بتحديد سلبي لبروتين تيروزين الفوسفاتيز مستقبلات نوع ج (بتبرك، CD45). علاوة على ذلك، يتم عرض عمليات مراقبة الجودة، وزراعة مك مورين الأولية، والتطبيقات المحتملة والقيود، فضلا عن اعتبارات خاصة.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات كانت معتمدة من قبل السلطات المحلية وتجري وفقا للقانون الألماني الرفق بالحيوان (84-02.05.20.13.097).

الملاحظات العامة على التجارب على الحيوانات

  1. إجراء جميع التجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية الخاصة بكل منها واستخدام اللجنة.
  2. الحفاظ على الفئران في ظروف موحدة، ووفقا للمبادئ التوجيهية الدولية مثل الاتحاد للجمعيات الحيوان مختبر العلوم (فيلاسا).
    ملاحظة: بشكل عام يمكن استخدام هذا الأسلوب العزلة للفئران مستقلة عن السن أو نوع الجنس أو الخلفية الوراثية. للحصول على عدد كاف من خلايا، 4 – 10 الأسبوع القديمة الذكور المفضلة، نظراً لأن الخصائص البيولوجية يمكن أن تختلف مع العمر ونوع الجنس.

2-إعداد الحلول ووسائل الإعلام وطلاء

  1. إعداد الحل الهضم (DS) بخلط 2.2 مل من النسر Dulbecco´s المتوسطة تعديل (دميم) مع 200 ميكروليتر كولاجيناز-ديسباسي وميكروليتر 45 ديسوكسيريبونوكليسي (الدناز).
  2. إعداد 500 مل من الخلية البطانية المتوسطة (ECM) عن طريق خلط 450 مل دميم مع 50 مل FCS (حوالي 10%)، بفجف عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية 0.25 مل (20 ميكروغرام/مل؛ حوالي 0.05%) ومل 5 البنسلين-ستربتوميسين (حوالي 1%). إجراء الترشيح العقيمة في أنبوب زجاج (قطر المسام تصفية: 0.2 ميكرومتر). وبعد ذلك تخزين الحل عند 4 درجة مئوية.
  3. معطف خلية ثقافة لوحات كما هو موضح أدناه.
    1. لزراعة الغطاء MEC مورين الابتدائي معزول طازجة الخلية السطح كله مع 1 مل كل بئر 6 أيضا لوحة الثقافة بمحلول طلاء جيلاتين على أساس سرعة (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 3-5 دقيقة في الغرفة درجة الحرارة (RT).
    2. نضح وتجاهل الحل الطلاء. أشطف كل بئر مع 2 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.1 – 7.5 في خطوتين متتاليتين الغسيل.
    3. نضح وتجاهل برنامج تلفزيوني. تملأ الآبار بحجم 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة.

3-عزل العضلات مورين الابتدائي Microvascular خلايا بطانية (مك)

  1. Euthanize بالغ واحد 4-12 أسابيع ماوس القديمة، والذكور من التفكك عنق الرحم دون أي تخدير. ويهدف إلى فصل بسرعة الحبل الشوكي من الدماغ بغية تزويد الحيوان موت سريع وغير مؤلم.
  2. قطع الأطراف.
    1. استخدام العمليات جراحية حادة/بلانت (طليعة 42 مم، على التوالي)، وشارب/شارب مقص (قطع حافة 23 ملم، على التوالي)، على التوالي (مسنن، 2 مم × 1.25 مم × 12 سم) ومنحني (مسنن، 1.3 مم × 1 مم × 13 سم) الملقط.
    2. تطهير جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70%.
    3. ضع الحيوان على ظهرها، وترطيب الساقين مع الإيثانول 70%. قطع الساق كله بالقطع في الورك مع مقص جراحي حاد/بلانت. تضع الأطراف في طبق ثقافة خلية مغلقة (35 مم × 10 مم).
      ملاحظة: من الآن فصاعدا تنفيذ كل خطوة تحت غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة، والعمل مع أدوات معقمة.
  3. عزل الأنسجة العضلية (شكل تفضيلي استخدام موسكولوس الفخذ الفخذية أو موسكولوس الرؤوس سوري من ساقيه).
    1. قطع الجلد مفتوحة من الورك إلى أخمص القدمين-التلميح باستخدام مقص حاد/حاد والملقط منحنية. عقد إصبع القدم أو قاطع مع الملقط على التوالي. تقشر الجلد مع الملقط منحنى من أخمص قدميه إلى الورك.
    2. عزل موسكولوس الفخذ الفخذية بقطع الوتر من الركبة وقطع في العضلات على طول عظم الفخذ الورك. عزل موسكولوس الرؤوس سوري بقطع وتر أخيل. فيما يلي، قص على طول الساق إلى الحفرة المابضيه وإزالة العضلات.
      ملاحظة: إذا كانت السفن الكبيرة (فيموراليس ألف، ألف الظنبوبي الأمامي، الخلفي الظنبوبي أ، فيبولاريس أ) مرئية في العضلات معزولة، إزالة السفن لتجنب التلوث بالبطانة ماكروفاسكولار.
    3. لإزالة السفن الكبيرة، عقد الجزء من العضلات التي لا تحتوي على السفن الكبيرة مع ملقط منحنية وقطع جانب السفينة. لهذا البروتوكول، ينصح ز 1 أو أقل أنسجة العضلات يساوي الفخذ الفخذية و سوري ثلاثية الرؤوس .
    4. إضافة ميليلتر 2,445 س (من الخطوة 2، 1) لطبق ثقافة خلية (35 مم × 10 مم) وتحديد الوزن.
    5. نقل جميع العضلات القطع لهذا الطبق ثقافة الخلية التي تحتوي على ميليلتر 2445 DS وتحديد الوزن. الفرق بين كلا القيم المقاسة يوفر الوزن الجاف لانسجة العضلات التي يجب أن لا تتجاوز 1 غ.
    6. قطع أنسجة العضلات كلها إلى قطع صغيرة (مكعبات مم دي تو، وحوالي 100 قطعة) باستخدام مقص حاد/حاد.
  4. ننأى بأنسجة العضلات.
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 120 دقيقة.
    1. تعليق العضلات/DS مخزن في 37 درجة مئوية (حاضنة مع 5% CO2) ل 1.5 h. مزيج تعليق بعناية كل 20 دقيقة لمدة حوالي 5 دقائق باستخدام حقنه الأنسولين 1 مل.
    2. نقل تعليق إلى 70 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة توضع في أنبوب 50 مل والتدفق من خلال جمع. أغسل مصفاة الخلية مع 8 مل دميم والتدفق من خلال جمع.
    3. تجاهل تعليق خلية مصفاة والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 20 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية.
      تنبيه: بيليه من السهل أن تفقد.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من وجود مخزن ليسينج الأمونيوم-كلوريد البوتاسيوم (ACK) (انظر الجدول للموادالمغلقة) لتحلل لخلايا الدم الحمراء واحتضان 30 ثانية في الرايت إضافة 9 مل دميم + 10% FCS لوقف تعليق خلية رد فعل ونقل إلى تي 15 مل التعليم الأساسي للجميع.
  5. تستنفد CD45+ الخلايا اتباع إرشادات الشركة المصنعة ميكروبيدس CD45. لجميع الخطوات التالية من CD45+ استنفاد استخدام المخزن المؤقت MCS (انظر "الجدول للمواد" المغلقة).
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 60 دقيقة.
    1. تحديد أرقام الخلية باستخدام خلية نويباور عد الدائرة (نتوقع حوالي 5 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز).
    2. تعليق الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. خلع المادة طافية تماما وريسوسبيند بيليه الخلية في 90 المخزن المؤقت من MCS ميليلتر (107 خلايا أو أقل). إضافة 10 ميكروليتر من ميكروبيدس CD45 (107 خلايا أو أقل).
    3. مزيج تعليق خلية واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة على 4 – 8 درجة مئوية.
    4. أضف 1 مل MCS المخزن المؤقت (107 خلايا أو أقل). أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية تماما وريسوسبيند الخلايا في 500 ميكروليتر MCS العازلة.
    5. لفصل المغناطيسية الخلية استخدام عمود مغناطيسية كبيرة (LMC) مع حجم خزان 8 مل وقدرة تصل إلى 2 × 109 مجموع الخلايا. ضع سابع في المجال المغناطيسي للفاصل.
    6. شطف مع 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف في خزان سابع. بعد الشطف، ضع أنبوب مخروطي 15 مل أسفل عمود للتدفق من خلال جمع. تطبيق تعليق خلية كاملة (500 ميليلتر) على العمود والسماح لها تماما تدفق من خلال.
    7. أغسل العمود ثلاث مرات بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف إلى الخزان وانتظر حتى فارغ خزان column´s قبل إجراء الخطوة التالية الغسيل.
    8. جمع الخلايا غير مسمى يمر العمود تستخدم لاتخاذ مزيد من الخطوات الفاصلة (تمثل CD45 كسر– ). تسمية الخلايا (تمثل في CD45+ الكسر) المتراكمة في العمود يمكن التخلص.
  6. تراكم CD31+ الخلايا التالية CD31 ميكروبيدس لإرشادات الشركة المصنعة. لجميع الخطوات التالية من CD31+ تراكم استخدام المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 60 دقيقة.
    1. تحديد عدد الخلايا باستخدام خلية نويباور عد الدائرة (حوالي 4 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز تتوقع).
    2. أجهزة الطرد المركزي الحصول على تعليق خلية غير مسمى من الخطوة 3.5 لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية.
    3. إزالة المادة طافية تماما. ريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 90 MCS المخزن المؤقت وإضافة 10 ميكروليتر من ميكروبيدس CD31 (107 مجموع الخلايا أو أقل). مزيج تعليق كامل واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة على 4 – 8 درجة مئوية.
    4. أضف 1 مل MCS المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. خلع المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
    5. لفصل المغناطيسية الخلية استخدام عمود مغناطيسي متوسطة (MMC) مع حجم خزان 3.5 مل وقدرة تصل إلى 2 × 108 مجموع الخلايا.
    6. ضع MMC في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف MMC مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة. بعد الشطف، ضع أنبوب مخروطي 15 مل أسفل عمود للتدفق من خلال جمع.
    7. تطبيق تعليق خلية كاملة (500 ميليلتر) على العمود والسماح لها تماما تدفق من خلال.
    8. أغسل العمود ثلاث مرات بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة والانتظار حتى خزان للعمود فارغاً قبل تنفيذ الخطوة التالية الغسيل. تمثل الخلايا غير مسمى يمر العمود CD45– CD31– الكسر. تخزينها لضوابط الجودة كذلك.
    9. إزالة عمود من الفاصل ووضعه في أنبوب جمع مناسبة (أنبوب 15 مل). ماصة 2 مل MCS المخزن المؤقت على العمود. فورا طرد الخلايا المسماة مغناطيسيا بدفع المكبس بقوة إلى العمود. هذا CD45– CD31+ الكسر يمثل الجماعة الأوروبية مورين الابتدائي العالي التخصيب.
    10. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ز في 20 درجة مئوية. إزالة المادة طافية تماما وريسوسبيند الخلايا (نتوقع حوالي 0.6 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز) في 1 مل ECM (راجع الخطوة 2.2.). نقل الخلايا (0.5 – 0.7 × 106 خلايا) إلى بئر واحدة من صفيحة المغلفة 6-بئر الثقافة (من الخطوة 2، 3) الذي يحتوي على 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة.
  7. للزراعة، واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة. تحديث المحتوى كل يومين أو ثلاثة أيام.

4-الابتدائي مك مورين تنقية

  1. إجراء دورة ثانية من CD31+ تراكم، اتباع إرشادات الشركة المصنعة (ميكروبيدس CD31 الماوس البروتوكول؛ وراجع الخطوة 3.6.).
    1. فصل الخلايا مع التربسين/يدتا الحل عندما يكونون في التقاء 80 – 90% (عادة بعد 7 أيام). ولهذا الغرض، شطف كل بئر مع PBS العقيمة 2 مل، في خطوتين متتاليتين الغسيل. استخدام 800 ميكروليتر التربسين/يدتا الحل الواحد 6-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة ل 3 – 5 دقيقة وقف النشاط الأنزيمي باستخدام 1200 ميكروليتر دميم تحتوي على حد أدنى من 10% FCS.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 350 x ز في 20 درجة مئوية.
    3. نفذ الخطوة CD31 MCS الثانية زيادة النقاء (وفقا للتعليمات manufacturer´s ميكروبيدس CD31؛ انظر 3.6).
    4. نلاحظ التقاء الخلية عن طريق حقل مشرق أو استخدام الفحص المجهري المرحلة القياسية--على النقيض
      20 x التكبير وفتحه العدسة 0.35 العددية. انظر الشكل 1.
      ملاحظة: يمكن استخدامها لإجراء التجارب على كل الخلايا أو أبقى في الثقافة التي باساجينج. استخدام الخلايا لإجراء التجارب على الفور في الممرات السفلي. لا ينصح باستخدام الخلايا بعد مرور
      8 – 10.

5-مراقبة الجودة

  1. أداء التدفق الخلوي مميك موريني الأولية بعد CD31-الإشراف-الخطوة الثانية.
    1. إعداد أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية عن طريق إضافة 1 مل التدفق الخلوي (FC) المخزن المؤقت (انظر الجدول للموادالمغلقة).
    2. فصل الخلايا مع التربسين/يدتا الحل عندما يكونون في التقاء 100 ٪ (عادة بعد 14 يوما). ولهذا الغرض، شطف كل بئر مع PBS العقيمة 2 مل، في خطوتين متتاليتين الغسيل. استخدام 800 ميكروليتر التربسين/يدتا الحل الواحد 6-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة ل 3 – 5 دقيقة وقف النشاط الأنزيمي باستخدام 1200 ميكروليتر دميم تحتوي على السفح 10%.
    3. تحديد عدد الخلايا استخدام نويباور عد الخلايا للدائرة وإضافة الحد ني خلايا 1 × 105 إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية المعدة.
    4. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية. إجراء خطوتين الغسيل بإزالة المادة طافية والخلايا الموجودة في المخزن المؤقت 1 مل FC ريسوسبيندينج وسينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية.
    5. إعداد مزيج المصبوغة بإضافة جسم CD31-فيتك (1: 100) المضادة الماوس والماوس المضادة CD45-PE (1: 100) مع المخزن المؤقت لنادي.
    6. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من تلطيخ المزيج في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنادي. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ز في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية والخلايا في 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنادي ريسوسبيند.
    7. قياس الخلايا في تدفق cytometer عقب الاستراتيجية النابضة التي تظهر في الشكل. 2A.
  2. وبدلاً من ذلك إجراء الفلورة تلطيخ من مك مورين الأولية بعد CD31-الإشراف-الخطوة الثانية.
    1. معطف كوفيرسليبس.
      1. نقل قطره معقمة 13 مم جولة ساترة زجاجية في بئر صفيحة جيدا 24. معطف ساترة بإضافة 300 ميليلتر لسرعة حل طلاء كل بئر. احتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. نضح وتجاهل الحل الطلاء. أشطف كل بئر مع 2 مل PBS العقيمة في خطوتين متتاليتين الغسيل. نضح وتجاهل برنامج تلفزيوني.
      3. البذور 1 × 105 خلايا في 1 مل ECM على ساترة المغلفة، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة حتى يتم روافد 99% من الخلايا.
    2. إجراء التثبيت وتلطيخ الفلورة.
      1. إزالة المتوسطة ECM للخلايا المزروعة من 5.2.1.3.
      2. إصلاح الخلايا المستزرعة بإضافة 300 ميليلتر 4% بارافورمالدهيد (PFA) مع درجة حموضة 7.4 الواحد جيدا، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
        تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ويجب التعامل معها بحذر.
      3. الخطوات الغسيل 3 بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة المادة طافية بعد 5 دقائق في الرايت
      4. تعد بالحل الذي يتضمن حظر 5% جيش صرب البوسنة، 0.2% تريتون-X و 1% مصل الماعز في برنامج تلفزيوني.
      5. إضافة 300 ميليلتر من عرقلة الحل لكل بئر واحتضانها ح 1 في الرايت
      6. إزالة المادة طافية وإضافة 200 ميليلتر كل بئر جسم المضادة-بيكم-1 (CD31) (1: 200) في جيش صرب البوسنة 5%، 1% مصل الماعز في برنامج تلفزيوني واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      7. تنفيذ 3 الغسيل الخطوات بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة طافية بعد 5 دقائق في RT في كل خطوة.
      8. تحضير محلول جسم ثانوي يحتوي على مترافق Cy3 الفئران المضادة الأجسام المضادة مفتش (1: 500) في جيش صرب البوسنة 1% وبرنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميليلتر كل من حل جسم الثانوية جيدا واحتضانها ح 1 في RT في الظلام.
      9. تنفيذ 3 الغسيل الخطوات بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة طافية بعد 5 دقائق في RT في كل خطوة.
    3. إخراج كوفيرسليبس الزجاج جولة بعناية مع الملقط وتحويلها إلى شريحة مجهرية. إضافة مبلغ مناسب لتصاعد DAPI تحتوي على المتوسط على طبقة الخلايا ووضعت بعناية كوب غطاء على ذلك (انظر المرفق الجدول للمواد).
    4. مراقبة الخلايا مع مجهر الأسفار مناسبة مزودة بمصدر ضوء فلورية (120 واط) واثنان بتصفية مجموعات: تعيين عامل تصفية إثارة/انبعاثات مع 550/25 نانومتر وأطوال موجية nm 605/70 للكشف عن Cy3 540/562 شمال البحر الأبيض المتوسط.
    5. استخدام عامل تصفية ثاني مع الطول موجي إثارة/انبعاثات من 365/50 نانومتر و 445/50 نانومتر للكشف عن DAPI 350/440 نانومتر. استخدام تكبير من 40 س وكثافة 80% من 14.5 ميغاواط/سم2 ل DAPI بفترة اقتناء 30 السيدة للكشف عن Cy3 استخدام 80% من 67.5 ميغاواط/سم2 مع مدة اقتناء 60 مللي ثانية.
  3. إجراء PCR الكمي.
    1. عزل مرناً.
      1. اتبع الإجراءات القياسية باستخدام كاشف ثيوسيانات-فينول (أجتب) حمض جوانيدينيوم عزل مرناً. استخدام الحد ني 0.5 × 106 خلايا من CD45– CD31– (راجع الخطوة 3.6.8)، CD45– CD31+ (راجع الخطوة 3.6.9.) الكسور ويزرع مك مورين الابتدائي (4.1.3)
      2. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 20 درجة مئوية. تقلع من المادة طافية تماما. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من أجتب كاشف ونقل تعليق خلية في أنبوب رد فعل 2 مل. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
      3. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم واهتز بشدة إينكوباتي س. 15 لمدة 3 دقائق في الرايت
      4. تعليق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
      5. الإقلاع العلوي مائي المرحلة (التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) بعناية ونقل إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. إضافة 250 ميليلتر من الايزوبروبانول واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
      6. إجراء خطوة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      7. خلع المادة طافية وإضافة 1 مل من 75 ٪ الإيثانول بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: بيليه من السهل أن تفقد.
      8. إزالة المادة طافية تماما. واسمحوا بيليه الجافة على الهواء لمدة 5 – 10 دقائق.
        ملاحظة: الإيثانول يحتاج إلى إزالة لكن لم تجف كثيرا.
      9. حل بيليه في 30 ميليلتر ديثيلبيروكاربوناتي معاملة المياه التي تحتوي والحرارة لمدة 10 دقائق في 55 درجة مئوية.
        ملاحظة: يمكن قياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء شحني-طيفية.
    2. إجراء توليف كدنا (المنتسخة العكسية PCR).
      1. إعداد mastermix التي تحتوي على: 10 ميليلتر PCR المخزن المؤقت (س 5)، 2، 5 ميليلتر ديسوكسيريبونوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (دنتب (10 مم))، ومزيج عشوائي 0.5 ميليلتر من التمهيدي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (0.2 ميكروغرام/ميليلتر)، 1 ميليلتر من مثبط رناسي (40 ش/ميليلتر، 0.4 عكس المنتسخة (200 يو/ميليلتر) و 5.6 ميليلتر من ديثيلبيروكاربونات المياه المعالجة (انظر مرفق الجدول للمواد).
      2. تمييع 500 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر ديثيلبيروكاربوناتي معاملة المياه في 0.2 مل PCR أنابيب وإضافة mastermix 20 ميليلتر الكامل.
      3. استخدام cycler بكر تنفيذ الخطوات التالية: 10 دقيقة 25 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، 5 دقيقة 85 درجة مئوية و 30 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
  4. إجراء PCR الكمي (قبكر).
    ملاحظة: تنفيذ qPCR للعينات في التكرارات أو تريبليكاتيس.
  5. استخدام التمهيدي مع اثنين من الأصباغ الفلورية مختلفة. التمهيدي امتصاص 495 نانومتر وانبعاث من 517 نانومتر للجينات للفائدة.
  6. للكشف عن التعبير الجيني علامة الخلية الأقمار الصناعية، استخدام كبسولة تفجير للبروتين إقران مربع 7 (Pax7) و M-كادهيرين (Cdh15) (انظر الجدول للموادالمغلقة).
  7. للكشف عن التعبير الجيني علامة الخلية البطانية، استخدم الإشعال كلودين-5 (Cld5)، أوككلودين (أوكلن) وزونولا أوككلودينس-1 (Tjp1 أو ZO1) (انظر المرفق الجدول للمواد).
  8. كمرجع الجينات ل 18s الرنا الريباسي، استخدم التمهيدي مع استيعاب 538 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاثات من الطول الموجي نانومتر 554.
  9. إعداد mastermix qPCR لكل الجينات من الاهتمام مع التمهيدي كل منهما. يتضمن Mastermix: 10µl قبكر المخزن المؤقت (2x)، 1 ميليلتر من التمهيدي للجينات للفائدة (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من التمهيدي ل 18s الرنا الريباسي و 4 ميليلتر من نوكلاس مجانية الماء.
  10. إضافة 16 ميليلتر من mastermix إلى بئر واحدة للوحة الرد 96-جيدا. إضافة 4 ميليلتر من كدنا (التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.3.2.) الواحدة وكذلك المحتوية على mastermix.
  11. استخدام cycler PCR الوقت الحقيقي أداء الخطوات التالية: عقد المرحلة مع 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 المرحلة ركوب مع دورات 40 من s 95 درجة مئوية 15 و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

النتائج

يوم واحد بعد عزلة، مك مورين الأولية وبقايا الخلايا الأخرى تشكيل التكتلات والتقيد بالجزء السفلي من ثقافة الأطباق (اليوم 1 منالشكل 1A ). من يوم 7، يمكن ملاحظة خلايا مسطحة وممدود. ومع ذلك، لا تزال واضحة تلوث أخرى، معظمها خلايا كروي، (الشكل 1A يوم ...

Discussion

خلايا بطانية microvascular توفر وظائف الحاجز في جميع الأنسجة ونتائجها اختلال وظيفي في المرض من الأجهزة المرتبطة بها 3. وعلاوة على ذلك، الدراسات الخاصة بالجهاز للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار قد يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، فهم أعمق للدالة EC ميكروفاسكولار تحت الظ?...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل "آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ" (2018_A03 إلى TR)، "مبتكرة Medizinische Forschung (صندوق النقد الدولي) مونستر" (I-RU211811 إلى TR) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG أنست 2105/27-1، لي 3283/5-1 ولي 3283/6-1 إلى SGM). الصور مصورة قدمتها هايك بلوم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher25200-056ready to use
ACK buffer150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)Biolegend102506Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)Biolegend103106Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGFPeprotech100-18BBasic fibroblast growth factor
BSASigma AldrichA4503
CD31 MicroBeads mouseMiltenyi Biotec130-097-418
CD45 MicroBeads mouseMiltenyi Biotec130-052-301
Collagenase-DispaseRoche10269638001Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well PlatesCorning3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibodydianova712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)Thermo FisherP36935
DesoxyribonucleaseSigma AldrichD4513Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated waterThermo FisherAM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvateThermo Fisher31966-021warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)Thermo FisherR01921 mL
EDTASigma AldrichE5134
FACS tubesSarstedt551,579
Falcon 70 μm Cell StrainerCorning352350
FC buffer0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serumSigma AldrichF6178Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)Fine Science Tools11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)Fine Science Tools11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)Braun9161708V
large magnetiv columns (LS columns)Miltenyi Biotec130-042-401for CD45-MACS-step
MCS buffer0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)Miltenyi Biotec130-042-201for CD31-MACS-step
Nuclease free waterThermo FisherR0581
PBSSigma AldrichPhosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)Thermo FisherEP0742in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouseSantaCruzSc-52713100 µg/mL
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichP4333
primary murine muscle cellscelprogen66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)Thermo FisherMm00483191_m1FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)Thermo FisherMm00727012_s1FAM labeled
Primer Ocln (occludin)Thermo FisherMm00500912_m1FAM labeled
Primer Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)Thermo FisherMm00493699_m1FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)Thermo Fisher4310893EVIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primerThermo FisherSO142Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)Thermo FisherEP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)Thermo FisherEO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)Fine Science Tools14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)Fine Science Tools14001-13
Speed Coating solutionPeloBiotechPB-LU-000-0002-00

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 microvascular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved