Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Zusammenfassung

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Zusammenfassung

Die Endothelzellen der Skelettmuskulatur Kapillaren (Muskel mikrovaskuläre Endothelzellen, MMEC) aufbauen, die Barriere zwischen Blutkreislauf und Skelettmuskulatur regelt den Austausch von Flüssigkeiten und Nährstoffen sowie die Immunantwort gegen Infektionskrankheiten Agenten durch Steuerung der Migration von Immunzellen. Für diese Funktionen MMEC bilden eine funktionelle "Myovascular Gerät" (MVU), mit weiteren Zelltypen, wie Fibroblasten, Perizyten und Skelettmuskelzellen. Infolgedessen trägt eine Dysfunktion der MMEC und damit die MVU zu einer Vielzahl von Myopathien. Jedoch regulatorische Mechanismen der MMEC in Gesundheit und Krankheit bleiben nur unzureichend verstanden und ihre Aufklärung vor spezifische Behandlungen für Myopathien. Die Isolation und die eingehende Untersuchung der primären MMEC Funktionen im Zusammenhang mit dem MVU könnte ein besseres Verständnis dieser Prozesse erleichtern.

Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur primären murinen MMEC des skelettartigen Muskels durch mechanische und enzymatische Dissoziation einschließlich Reinigung und Kultur Wartungsschritte isolieren.

Einleitung

Über Blut, Zellen und Organe werden mit Sauerstoff, Substrate und anderen notwendigen Molekülen geliefert. Dieser Austausch findet in Kapillaren, die kleinsten Gefäße. Kapillaren sind durch eine innere Endothelzellen (EG) Schicht gebildet deren Integrität eine Voraussetzung für die erfolgreiche Regulierung von Muskel-Homöostase zwischen intravaskulären und interstitiellen Raum bleibt. Um einen selektiven Übergang von lösliche Faktoren und Zellen eine Monolage durch eng miteinander verbunden und Adherens Kreuzungen ¹EG dar. Neben seiner Rolle als Barriere für Nährstoffe und Stoffwechselprodukte EG regulieren die Rekrutierung von Leukozyten bei entzündlichen Prozessen. Entzündung oder Gewebe Schaden führt zu einer Up-Regulierung des Adhäsionsmoleküle auf der EG-Oberfläche und die Produktion von Chemokinen Leukozyten Anlage und Transmigration in der Target-Gewebe- ²zu erleichtern. Infolgedessen sind EG kritisch bei der Regulierung der entzündlichen Prozesse wie die Abwehr von Krankheitserregern oder Reparatur von Gewebe beteiligt.

Eine Dysfunktion der EG ist direkt verbunden mit Kreislauf-Erkrankungen, chronischem Nierenversagen, Venenthrombose Erreger schwere Infektionen. Darüber hinaus werden EG praktisch immer bei organspezifischen Autoimmunität z. B. Diabetes Mellitus oder Multiple Sklerose ³beteiligt. Die Barrierefunktion zwischen Blut und Organe erfolgt daher durch ein abgestimmtes Zusammenspiel verschiedener Zelltypen. In der Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen (MMEC) zusammen mit Muskelzellen, Fibroblasten und Perizyten bilden eine funktionelle Einheit, das "Myovascular Gerät" (MVU). Daher könnte eine Dysfunktion der MVU eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Myopathien spielen. Allerdings fehlt noch ein tieferes Verständnis für diese Regulationsmechanismen und derzeit schließt die Identifikation neuer, dringend benötigte, therapeutische Targets in Myopathien.

Um die komplexen physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen, sind Tiermodelle gebräuchlich. In-vitro- Modelle bieten jedoch den Vorteil, auf das Thema von Interesse zu konzentrieren, indem Sie eine Vielzahl von Störfaktoren ausschließen. Um Prozesse zu untersuchen in-vitro-ist es notwendig, reine und tragfähige Primärzellen zu isolieren. Im Gegensatz zur Zell-Linien ermöglichen Primärzellen von transgenen Tieren isoliert, die Konsequenzen von in-vitro-genetische Modifikationen untersuchen.

Hier wird eine Methode zur primären murinen MMEC isolieren beschrieben durch mechanische und enzymatische Dissoziation, gefolgt von magnetisch aktivierte Zelle sortieren Techniken (MCS) für die Reinigung verwenden. Zu diesem Zweck werden magnetische Beads gegen bestimmte Oberflächenmarker verwendet. Thrombozyten Endothelzellen Adhäsion Molekül-1 (PECAM1, CD31) drückt sich vor allem auf EG und kann verwendet werden, um diesen Zelltyp zu bereichern. Um hohen Reinheit zu gewährleisten, sind Zellen des hämatopoetischen Ursprungs durch eine negative Auslese für Protein-Tyrosin-Phosphatase-Rezeptor-Typ C (PTPRC, CD45) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden Qualitätskontrollen, Anbau von primären murinen MMEC, Anwendungsmöglichkeiten sowie Einschränkungen und Besonderheiten vorgestellt.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von den lokalen Behörden genehmigt und nach dem deutschen Tierschutzgesetz (84-02.05.20.13.097) durchgeführt.

1. Allgemeine Bemerkungen über Tierversuche

1. Gemäß den Richtlinien des jeweiligen institutionellen Tierpflege alle Maus-Experimente durchführen und Ausschuss zu verwenden.
2. Halten Sie Mäuse unter standardisierten Bedingungen und nach internationalen Richtlinien wie der Föderation für Laboratory Animal Science Verbände (FELASA).
   Hinweis: Im Allgemeinen kann diese Isolation Technik für Mäuse unabhängig von Alter, Geschlecht oder genetischen Hintergrund verwendet werden. Um einer ausreichenden Anzahl von Zellen zu erhalten, sind 4 – 10 Wochen alte Männer bevorzugt, da biologische Eigenschaften mit Alter und Geschlecht variieren können.

2. Vorbereitung der Lösungen, Medien und Beschichtung

1. Bereiten Sie Aufschlusslösung (DS) durch Mischen von 2,2 mL des Dulbecco´s verändert Eagle Medium (DMEM) mit 200 μL Kollagenase-Dispase und 45 μl Desoxyribonuclease (DNase).
2. Bereiten Sie 500 mL Endothelzellen Medium (ECM) durch Mischen von 450 mL DMEM mit 50 mL FCS (ca. 10 %), 0,25 mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor bFGF (20 μg/mL; etwa 0,05 %) und 5 mL Penicillin-Streptomycin (ca. 1 %). Sterilfiltration in einer Glasröhre durchführen (Durchmesser des Filters Poren: 0,2 μm). Danach speichern Sie die Lösung bei 4 ° C.
3. Beschichten Sie Zellplatten Kultur, wie unten beschrieben.
   1. Für den Anbau von frisch isolierte primären murinen MEC Deckel vollflächig mit 1 mL pro Bohrloch einer 6 Zelle gut Kultur Platte mit einer Gelatine-basierte Geschwindigkeit Beschichtungslösung (siehe Tabelle der Materialien) nach Herstellerangaben für 3 – 5 min am Zimmer Temperatur (RT).
   2. Aspirieren Sie und entsorgen Sie Beschichtungslösung. Spülen Sie jedes gut mit 2 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,1 – 7,5 in zwei aufeinander folgenden Waschschritte.
   3. Aspirieren und PBS zu verwerfen. Brunnen mit 1 mL Volumen von ECM füllen.

3. Isolation der primären murinen Muskel mikrovaskuläre Endothelzellen (MMEC)

1. Einschläfern einen Erwachsenen 4 – 12 Wochen alt, Männlich Maus durch zervikale Dislokation ohne jede Betäubung. Ziel ist es, schnell das Rückenmark aus dem Gehirn um das Tier bieten einen schnellen und schmerzlosen Tod zu trennen.
2. Trennen Sie die Extremitäten.
   1. Verwenden Sie eine chirurgische scharf/stumpf (Schneide 42 mm, gerade) und scharf/scharf (Schneide 23 mm, geraden) Schere, ein Straight (gezackten, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) und ein gebogenes (gezahnt, 1,3 mm x 1 mm x 13 cm) Zange.
   2. Alle chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
   3. Positionieren Sie das Tier auf den Rücken, befeuchten Sie die Beine mit 70 % Ethanol zu. Trennen Sie das ganze Bein am Hüftgelenk mit scharf/stumpf chirurgische Schere schneiden. Legen Sie die Extremitäten in der Kulturschale geschlossenzelligen (35 mm x 10 mm).
      Hinweis: Ab sofort führen Sie jeden Schritt unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube und arbeiten mit sterilisierte Instrumente.
3. Muskelgewebe zu isolieren (bevorzugt den Musculus Quadriceps Femoris oder Musculus Triceps Surae aus beiden Beinen verwenden).
   1. Schneiden Sie die Haut mit einem scharfen/scharfe Schere und gebogenen Pinzette von der Hüfte bis die Fußspitze geöffnet. Halten Sie die Zehe oder Straßenräuber mit der geraden Zange. Abziehen der Haut mit der gebogenen Pinzette von den Zehen bis zur Hüfte.
   2. Isolieren Sie der Musculus Quadriceps Femoris durch Schneiden der Sehne vom Knie zu und trennen Sie den Muskel entlang der Oberschenkel bis zur Hüfte. Isolieren Sie den Musculus Triceps Surae , durch Durchtrennung der Achillessehne. Im folgenden entlang der Tibia, die popliteal Fossa schneiden Sie und entfernen Sie den Muskel.
      Hinweis: Wenn große Schiffe (A. Femoralis, A. Tibialis anterior, A. Tibialis Posterior, A. Fibularis) in die isolierte Muskeln sichtbar sind, entfernen Sie Schiffe zur Vermeidung von Kontamination durch vaskuläre Endothel.
   3. Um große Schiffe zu entfernen, halten Sie den Teil des Muskels nicht mit großen Schiffen mit einer gebogenen Pinzette und neben dem Schiff abgeschnitten. Für dieses Protokoll ist 1 g oder weniger Muskelgewebe gleich Quadriceps Femoris und Trizeps Surae empfohlen.
   4. Fügen Sie 2.445 µL DS (aus Schritt 2.1) zu einer Zelle Kulturschale (35 mm x 10 mm) und bestimmen Sie das Gewicht zu.
   5. Alle Muskel-Stücke auf diese Zelle Kulturschale mit 2445 µL DS übertragen und das Gewicht zu bestimmen. Die Differenz der beiden Messwerte liefert das Trockengewicht von Muskelgewebe die 1 g nicht überschreiten darf.
   6. Schneiden Sie das ganze Muskelgewebe in kleine Stücke (≤2 mm Würfel, ca. 100 Stück) mithilfe der scharf/scharfe Schere.
4. Das Muskelgewebe zu distanzieren.
   Hinweis: dieser Schritt dauert ca. 120 Minuten.
   1. Shop Muskelaufbau/DS Aussetzung bei 37 ° C (Inkubator mit 5 % CO₂) für 1,5 h mischen die Aussetzung sorgfältig alle 20 min für ca. 5 min mit einer Spritze 1 mL Insulin.
   2. Federung auf ein 70 μm Nylon Zelle Sieb gelegt auf eine 50 mL Tube übertragen und die Durchströmung zu sammeln. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 8 mL DMEM und sammeln Sie die Durchströmung.
   3. Entsorgen Sie Sieb und Zentrifuge Zellsuspension für 10 min bei 300 X g bei 20 ° C. Entfernen Sie vorsichtig überstand.
      Vorsicht: Pellet ist leicht zu verlieren.
   4. Aufschwemmen Zelle Pellet in 1 mL eines Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysiereinrichtung Puffers (siehe beiliegende Tabelle of Materials) für die lyse der roten Blutkörperchen und inkubieren Sie für 30 s bei RT hinzufügen 9 mL DMEM + 10 % FCS, die Reaktion und Transfer Zellsuspension auf eine 15 mL t zu stoppen UBE.
5. Zum Abbau CD45⁺ nach Anweisungen des Herstellers CD45 Microbeads Zellen. Für alle folgenden Schritte von CD45⁺ Erschöpfung MCS Puffer verwenden (siehe beiliegende Tabelle of Materials).
   Hinweis: dieser Schritt dauert ca. 60 Minuten.
   1. Zellzahlen unter Verwendung einer Neubauer Zelle zählen Kammer zu bestimmen (erwarten Sie etwa 5 x 10⁶ Zellen pro g Muskelgewebe).
   2. Zentrifuge Aussetzung bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Überstand nehmen Sie vollständig ab und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 90 µL MCS Puffer (pro 10⁷ Zellen oder weniger). Fügen Sie 10 μL von CD45 Microbeads (pro 10⁷ Zellen oder weniger).
   3. Zellsuspension mischen und 15 min. in den Kühlschrank bei 4 – 8 ° c inkubieren
   4. Fügen Sie 1mL MCS Puffer (pro 10⁷ Zellen oder weniger). Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand vollständig entfernen und erneut Zellen in 500 μl MCS Puffer.
   5. Verwenden Sie für magnetische Zellseparation eine große magnetische Spalte (LMC) mit einem Reservoir Volumen von 8 mL und einer Kapazität von bis zu 2 x 10⁹ insgesamt Zellen. Positionieren Sie die LMC im Magnetfeld des Separators.
   6. Mit 3 mL MCS Puffer in das Reservoir der LMC abspülen. Nach dem Spülen, legen Sie eine 15 mL konische Rohr unter der Spalte Durchströmung zu sammeln. Gelten Sie die ganze Zellsuspension (500 µL) auf die Säule und lassen Sie ihn vollständig Fluss durch.
   7. Waschen Sie die Spalte durch Zugabe von 3 mL MCS Puffer in das Reservoir dreimal und warten Sie, bis der Column´s Behälter leer ist, vor der Durchführung der nächsten Waschschritt.
   8. Sammeln die unbeschrifteten Zellen der Spalte vorbei für weitere Trennung Schritte verwenden (Vertretung der CD45 Bruchteil^– ). Markiert Zellen (Vertretung der CD45⁺ Bruchteil) angesammelten in die Spalte kann verworfen werden.
6. Akkumulieren CD31⁺ Zellen folgende CD31 Microbeads des Herstellers. Für alle folgenden Schritte der CD31⁺ Ansammlung MCS Puffer verwenden.
   Hinweis: dieser Schritt dauert ca. 60 Minuten.
   1. Anzahl von Zellen mit einer Neubauer Zelle zählen Kammer zu bestimmen (ca. 4 x 10⁶ Zellen pro g Muskelgewebe erwarten).
   2. Zentrifuge unbeschriftete Zellsuspension entnommen Schritt 3.5 für 10 min bei 300 X g bei 4 ° C.
   3. Den Überstand vollständig zu entfernen. Aufschwemmen Sie das Pellet in 90 μL MCS Puffer und fügen Sie 10 μL der CD31 Microbeads (pro 10⁷ total Zellen oder weniger). Die gesamte Aufhängung mischen und 15 min. in den Kühlschrank bei 4 – 8 ° c inkubieren
   4. Fügen Sie 1mL MCS Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Der Überstand nehmen Sie ab und Aufschwemmen Sie Zellen in 500 µL Puffer MCS.
   5. Verwenden Sie für die magnetische Zellseparation eine mittlere magnetische Spalte (MMC) mit einem Reservoir Volumen von 3,5 mL und einer Kapazität von bis zu 2 x 10⁸ total Zellen.
   6. Positionieren Sie die MMC in das Magnetfeld des Separators. Spülen Sie die MMC mit 500 µL Puffer MCS. Nach dem Spülen, legen Sie eine 15 mL konische Rohr unter der Spalte Durchströmung zu sammeln.
   7. Gelten Sie die ganze Zellsuspension (500 µL) auf die Säule und lassen Sie ihn vollständig Fluss durch.
   8. Waschen Sie die Spalte durch Zugabe von 500 µL Puffer MCS dreimal und warten Sie, bis die Spalte Reservoir leer ist, bevor Sie den nächsten Waschschritt durchführen. Unbeschriftete Zellen der Spalte vorbei repräsentieren die CD45^– CD31^– Bruchteil. Bewahren Sie sie für weitere Qualitätskontrollen.
   9. Entfernen Sie Spalte aus dem Abscheider und legen Sie sie auf eine geeignete Sammelrohr (15 mL-Tube). Pipette 2 mL MCS Puffer auf die Säule. Sofort die magnetisch markierten Zellen fest drücken Sie den Kolben in die Spalte auszuwaschen. Diese CD45^– CD31⁺ Bruchteil stellt der angereicherten primären murinen EG.
   10. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 350 X g bei 20 ° C. Überstand vollständig entfernen und erneut Zellen (erwarten rund 0,6 x 10⁶ Zellen pro g Muskelgewebe) in 1 mL ECM (siehe Punkt 2.2.). Übertragen (0,5 – 0,7 x 10⁶ Zellen) zu einem einzigen Brunnen einer beschichteten 6-Well-Kultur-Platte (aus Schritt 2.3), enthält 1 mL von ECM.
7. Inkubieren Sie für Anbau und Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einen sterilen Brutkasten. Aktualisieren Sie die ECM alle zwei bis drei Tage.

(4) primären murinen MMEC Reinigung

1. Führen Sie einen zweiten Zyklus von CD31⁺ Akkumulation, nach Angaben des Herstellers (CD31 Microbeads Maus Protokoll; siehe Punkt 3.6.).
   1. Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen, wenn sie am Zusammenfluss von 80 – 90 % (in der Regel nach 7 Tagen) sind. Spülen Sie hierzu jedes gut mit 2 mL sterile PBS, in zwei aufeinander folgenden Waschschritte. Mit 800 μl Trypsin/EDTA Lösung pro 6-Well und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einer sterilen Brutkasten für 3 – 5 min. Stop enzymatische Aktivität mit 1200 μl DMEM mit mindestens 10 % FCS.
   2. Zentrifugieren der Zellsuspension für 5 min bei 350 X g bei 20 ° C.
   3. Führen Sie den zweiten CD31-MCS-Schritt zur Erhöhung der Reinheit (CD31 Microbeads unterliefen Anweisungen entsprechend, siehe 3.6.).
   4. Beobachten, Zusammenfluss über Hellfeld Zelle oder standard Phasenkontrast-Mikroskopie mit einem
      20 x Vergrößerung und 0,35 Objektiv numerische Apertur. Siehe Abbildung 1.
      Hinweis: Zellen können für die jeweiligen Experimente verwendet oder durch Passagierung in Kultur gehalten. Verwenden Sie Zellen für Experimente umgehend im unteren Passagen. Es wird nicht empfohlen, die Zellen nach Durchgang benutzen
      8 – 10.

5. Qualitätskontrolle

1. Durchführen Sie Durchflusszytometrie der primären murinen MMEC nach der zweiten CD31-MCS-Schritt.
   1. Bereiten Sie eine FACS-Röhre durch Zugabe von 1 mL Flow Cytometry (FC) Puffer (siehe beiliegende Tabelle of Materials).
   2. Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung zu lösen, wenn sie am Zusammenfluss von 100 % (in der Regel nach 14 Tagen) sind. Spülen Sie hierzu jedes gut mit 2 mL sterile PBS, in zwei aufeinander folgenden Waschschritte. Mit 800 μl Trypsin/EDTA Lösung pro 6-Well und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einer sterilen Brutkasten für 3 – 5 min. Stop enzymatische Aktivität mit 1200 μl DMEM mit 10 % FCS.
   3. Anzahl von Zellen mit einer Neubauer Zellzählung Kammer und fügen Sie ein Minimum von 1 x 10⁵ Zellen mit dem vorbereiteten FACS-Rohr zu bestimmen.
   4. Zentrifuge Zellsuspension für 10 min bei 300 X g bei 4 ° C. Führen Sie zwei Waschschritte durch Entfernen des Überstands, resuspending Zellen in 1 mL FC Puffer und Zentrifugation für 10 min bei 300 X g bei 4 ° C.
   5. Bereiten Sie eine Färbung Mischung, indem Anti-Maus CD31-FITC Antikörper (1: 100) und Anti-Maus CD45-PE (1: 100) mit FC-Puffer.
   6. Aufschwemmen Sie Zellen in 100 μL der Färbung-Mix in der FACS-Röhren. 30 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie 1 mL FC Puffer. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 300 X g bei 4 ° C. Sorgfältig entfernen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Zellen in 200 μl des FC-Puffers.
   7. Maßnahme-Zellen in einem Durchflusszytometer gating Strategie ist in Abbildung gezeigt. 2A.
2. Alternativ führen Sie durch Immunfluoreszenz-Färbung des primären murinen MMEC nach dem zweiten CD31-MCS-Schritt.
   1. Mantel der Deckgläsern.
      1. Einen sterile 13 mm Durchmesser Runde Glas-Deckglas in einen Brunnen von einer 24-well-Platte zu übertragen. Mantel Deckglas durch Zugabe von 300 µL Geschwindigkeit Beschichtungslösung pro Bohrloch. 3 – 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      2. Aspirieren Sie und entsorgen Sie Beschichtungslösung. Spülen Sie jedes gut mit 2 mL sterile PBS in zwei aufeinander folgenden Waschschritte. Aspirieren und PBS zu verwerfen.
      3. Samen 1 x 10⁵ Zellen in 1 mL ECM auf der beschichteten Deckglas und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einen sterilen Brutkasten bis Zellen sind 99 % Zusammenfluss.
   2. Durchführen Sie Fixierung und Färbung Immunfluoreszenz.
      1. 5.2.1.3 entfernen Sie der ECM-Medium der kultivierten Zellen.
      2. Beheben von kultivierten Zellen durch Zugabe von 300 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit pH-Wert von 7,4 pro Bohrloch für 10 min bei 4° C.
         Vorsicht: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
      3. Führen Sie 3 Waschschritte durch Zugabe von 1 mL PBS pro Bohrloch und entfernen Sie überstand nach 5 min bei RT
      4. Bereiten Sie eine blockierende Lösung mit 5 % BSA, 0,2 % Triton-X und 1 % Ziegenserum in PBS.
      5. Jedes gut 300 µL blocking-Lösung hinzu und 1 h bei RT inkubieren
      6. Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 200 µL pro Bohrloch des Antikörpers Anti-PECAM-1 (CD31) (1: 200) in 5 % BSA, 1 % Ziegenserum in PBS und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
      7. Führen Sie 3 Waschschritten mit 1 mL PBS pro Bohrloch hinzufügen und Entfernen von überstand nach 5 min bei RT in jedem Schritt.
      8. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörper-Lösung, Cy3-konjugierten Anti-Ratte IgG Antikörper (1: 500) in 1 % BSA und PBS. 300 µL pro Bohrloch der Sekundärantikörper Lösung hinzufügen und 1 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
      9. Führen Sie 3 Waschschritten mit 1 mL PBS pro Bohrloch hinzufügen und Entfernen von überstand nach 5 min bei RT in jedem Schritt.
   3. Die Runde Glasdeckgläser sorgfältig mit der Pinzette herausnehmen und in eine Mikroskopie-Folie übertragen werden. Hinzufügen einer entsprechenden Menge an Montage mittlerer mit DAPI auf der Zellschicht und sorgfältig ein Deckglas drauf (siehe beigefügte Tabelle of Materials).
   4. Beobachten Sie Zellen mit einer entsprechenden Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit einer Fluoreszenz-Lichtquelle (120 W) und zwei Filtersätze: ein Anregung/Emission Filter set mit 550/25 nm und 605/70 nm Wellenlänge, Cy3 540/562 nm zu erkennen.
   5. Verwenden Sie einen zweiten Filter set mit einer Anregung/Emissionswellenlänge von 365/50 nm und 445/50 nm, DAPI 350/440 nm zu erkennen. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 40 X und 80 % Intensität von 14,5 mW/cm² für DAPI mit einer Übernahme-Dauer von 30 ms für die Erkennung von Cy3 nutzen 80 % der 67,5 mW/cm² mit einer Übernahme-Dauer von 60 ms.
3. Durchführen Sie quantitative PCR.
   1. Isolierung von mRNA.
      1. Folgen Sie Standardverfahren mit einer sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol (AGTP)-Reagenz, um mRNA zu isolieren. Verwenden Sie ein Minimum von 0,5 x 10⁶ Zellen von CD45^– CD31^– (siehe Schritt 3.6.8), CD45^– CD31⁺ (siehe Schritt 3.6.9.) Brüche und kultivierten primären murinen MMEC (4.1.3)
      2. Zentrifuge Zellsuspension für 10 min bei 300 X g bei 20 ° C. Der Überstand vollständig abnehmen. Die Zelle Pellet in 500 µL AGTP Reagenz und Transfer Zellsuspension in ein 2 mL Reaktionsgefäß Aufschwemmen. 5 min bei RT inkubieren
      3. 100 µL Chloroform hinzufügen und kräftig schütteln für 15 S. Inkubation für 3 min bei RT
      4. Zentrifuge Aufhängung für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
      5. Ausziehen der oberen wässrigen Phase (mit RNA) sorgfältig und in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß übertragen. Fügen Sie 250 µL Isopropanol und 10 min bei RT inkubieren
      6. Führen Sie ein Zentrifugationsschritt bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
      7. Der Überstand nehmen Sie ab und 1 mL von 75 % Ethanol sorgfältig. Zentrifuge bei 7.500 X g für 5 min bei 4 ° C.
         Hinweis: Pellet ist leicht zu verlieren.
      8. Den Überstand vollständig zu entfernen. Lassen Sie das Pellet auf Luft für 5 – 10 min trocknen.
         Hinweis: Ethanol muss entfernt werden, aber nicht zu viel zu trocken.
      9. Auflösen von Pellet in 30 µL Diethylpyrocarbonate behandelt Wasser enthält und Wärme für 10 min bei 55 ° C.
         Hinweis: RNA-Konzentration und Reinheit können durch ein Spektralfotometer gemessen werden.
   2. CDNA Synthese (Reverse Transkriptase PCR) durchführen.
      1. Bereiten Sie ein Mastermix mit: 10 µL des PCR-Puffer (5 X), 2,5 µL Desoxyribonucleosid-Triphosphat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL zufällige Mischung aus einsträngiger Grundierung (0,2 µg / µL), 1 µL RNase-Inhibitor (40 U / µL, 0,4 reverse Transkriptase (200 U/µL) und 5,6 µL Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser (siehe beiliegenden Table of Materials).
      2. Verdünnen Sie 500 ng RNA 30 µL Diethylpyrocarbonate behandelt in 0,2 mL PCR-Röhren und fügen Sie die ganze 20 µL Mastermix Wasser.
      3. Verwenden Sie eine PCR Cycler folgende Schritte durchführen: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C und halten bei 4 ° C.
4. Quantitative PCR (qPCR) durchführen.
   Hinweis: QPCR Proben in Duplikate oder Triplicates ausführen.
5. Verwenden Sie Grundierung mit zwei verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen. Grundierung mit einer Absorption von 495 nm und einer Emission von 517 nm für das gen des Interesses.
6. Für die Erkennung der Satelliten-Zell-Marker-gen-Expression verwenden, Primer für gekoppelte Box Protein 7 (Pax7) und M-Cadherin (Cdh15) (siehe beiliegende Tabelle of Materials).
7. Für die Erkennung von Endothelzellen-Marker-gen-Expression, Primer für Claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) und Zonula Occludens-1 (Tjp1 oder ZO1) verwenden (siehe beiliegenden Table of Materials).
8. Als Referenz-gen für 18 s rRNA, verwenden Sie eine Grundierung mit Absorption von 538 nm und einer Emission von 554 nm Wellenlänge.
9. Bereiten Sie eine qPCR Mastermix für jedes Gen des Interesses mit der jeweiligen Primer. Mastermix enthält: 10µl qPCR Puffer (2 X), 1 µL Grundierung für gen von Interesse (10 µM) 1 µL Grundierung für 18 s rRNA und 4 µL Nuklease Wasser frei.
10. Fügen Sie 16 µL der Mastermix zu einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Reaktion-Platte. Fügen Sie 4 µL cDNA (gewonnen aus Schritt 5.3.2.) pro auch mit den Mastermix.
11. Verwenden Sie ein Real-Time PCR Cycler folgende Schritte durchführen: Bühne mit 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 10 Minuten Radfahren Bühne mit 40 Zyklen von 95 ° C 15 s und 60 ° C für 1 min halten.

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Ergebnisse

Einen Tag nach der Isolation, primären murinen MMEC und Rest andere Zellen bilden Konglomerate und halten an der Unterseite des Kultur-Gerichte (Abbildung 1A Tag 1). Ab Tag 7 können flache und längliche Zellen beobachtet werden. Kontamination von anderen, meist Sphäroid Zellen, ist jedoch nach wie vor sichtbar (Abb. 1A Tag 7). Somit einen weiteren Zyklus CD31 positive Selektion über MCS erforderlich ist. Im folgende...

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Diskussion

Mikrovaskuläre Endothelzellen bieten Barriere Funktionen in allen Geweben und deren Dysfunktion Ergebnisse bei der Krankheit der zugeordneten Organe ³. Organspezifische Untersuchungen der mikrovaskuläre EG könnte darüber hinaus den Weg für neue therapeutische Strategien ebnen. Daher ist ein tieferes Verständnis der mikrovaskuläre EG-Funktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen von großem wissenschaftlichen Interesse. Modulation der Leukozyten/Endothel Interaktion wir...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00