בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

Summary

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

Abstract

תאי אנדותל של הנימים שרירי השלד (microvascular אנדותל תאי שריר, MMEC) לבנות את המכשול בין זרם הדם שרירי השלד ויסות חילופי נוזלים, חומרים מזינים, כמו גם את התגובה החיסונית נגד זיהומיות סוכנים על ידי שליטה נדידת תאים חיסוניים. עבור פונקציות אלה, MMEC יוצרים פונקציונלי "יחידה myovascular" (MVU), עם סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts, pericytes, תאי שריר השלד. כתוצאה מכך, תפקוד MMEC ולכן MVU את תורמת למגוון עצום של myopathies. אולם, מנגנוני הרגולציה של MMEC על בריאות ומחלה נותרו מספיק מובן, הבהרה שלהם מקדים טיפולים פרטניים יותר myopathies. בידוד של חקירה מעמיקה של פונקציות MMEC העיקרי בהקשר של MVU עשוי להקל על הבנה טובה יותר של תהליכים אלה.

מאמר זה מספק פרוטוקול כדי לבודד MMEC מאתר העיקרי של שריר השלד מאת דיסוציאציה מכני, אנזימטי כולל טיהור והשלבים תחזוקה תרבות.

Introduction

דרך מחזור הדם, תאים ואיברים, מסופקים עם חמצן, מצעים, מולקולות אחרות הדרושות. מחלף זה מתרחש בנימים, בכלי הדם הקטנים. נימים נוצרות על ידי שכבת תאי אנדותל הפנימי (EC) שלמות אשר נשאר תנאי לביצוע מוצלח ההסדרה של הומאוסטזיס שריר בין המרחב קרישה תוך-כלית, interstitial. כדי להבטיח מעבר סלקטיבי של גורמים מסיסים ותאים, EC מהוות של טפט מחוברים על ידי חזק צמתי adherens ¹. מלבד תפקידה כמחסום חומרים מזינים או מוצרים מטבולית, EC לווסת את גיוס לויקוציטים בתהליכים דלקתיים. נזק דלקת או רקמה מוביל למעלה-רגולציה של מולקולות אדהזיה על פני EC ו ייצור של נוגדנים הקלת ליקוציט המצורף, גלגול לתוך רקמת המטרה ². כתוצאה מכך, EC אנושות מעורבים בוויסות תהליכים דלקתיים כגון ההגנה נגד פתוגנים או רקמות תיקון.

תפקוד EC הוא ישירות הקשורים עם מחלות לב וכלי דם, אי ספיקת כליות כרונית, פקקת ורידים חמורה הפתוגן זיהומים. יתר על כן, EC כמעט תמיד מעורבים מחלת חיסון עצמי ייחודיים כגון סוכרת או טרשת נפוצה ³. הפונקציה מחסום בין זרם הדם ואיברים ולכן נשלטת על ידי המרצד מתואמת סוגי תאים שונים. בתאי שריר השלד microvascular אנדותל (MMEC) יחד עם תאי שריר, fibroblasts ו pericytes יוצרות יחידה פונקציונלית, יחידת"myovascular" (MVU). לכן, תפקוד MVU עשוי לשחק תפקיד קריטי הפתופיזיולוגיה של myopathies. אולם, הבנה עמוקה יותר של מנגנונים רגולטוריים אלה עדיין נעדר, כיום מונע זיהוי מטרות חדשות, בדחיפות, טיפולי myopathies.

כדי לחקור את המנגנונים הפיזיולוגיים ואת pathophysiological מורכבים, מודלים בעלי חיים משמשים. עם זאת, מודלים במבחנה מציעים היתרון להתמקד על נושא מעניין על ידי למעט מגוון גורמים מבלבלים. לחקור תהליכי הפריה זה הכרחי בידוד תאי יסוד טהור בר -קיימא. בניגוד שורות תאים, התאים הראשי שבודדו מבעלי הטרנסגניים מאפשרים לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים במבחנה.

. הנה, שיטה לבודד את ראשי MMEC מאתר מתואר באמצעות דיסוציאציה מכני, אנזימטי ואחריו מגנטי תא מופעל מיון טכניקות (MCS) לטיהור. למטרה זו, משמשים beads מגנטי נגד סמני פני שטח מסוים. טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM1, CD31), מתבטאת בעיקר על EC והוא יכול לשמש כדי להעשיר את סוג התא. כדי להצדיק טוהר גבוהה תא, תאים ממוצא hematopoietic יוצאו על ידי בחירה שלילי עבור סוג קולטן טירוזין phosphatase חלבון C (PTPRC, CD45). בהמשך, מוצגים פקדים איכות, טיפוח של MMEC מאתר ראשי, יישומים פוטנציאליים, מגבלות, כמו גם שיקולים מיוחדים.

Protocol

כל הניסויים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות, שנערכו על-פי חוק רווחת בעלי חיים גרמני (84-02.05.20.13.097).

1. כללי הערות על ניסויים בבעלי חיים

1. לבצע כל עכבר ניסויים בהתאם לקווים המנחים של טיפול בבעלי חיים מוסדיים המתאימים ולהשתמש הוועדה.
2. לשמור על עכברים בתנאים מתוקננים, בהתאם להנחיות בינלאומיות כגון הפדרציה עבור עמותות המדע חיות מעבדה (FELASA).
   הערה: באופן כללי ניתן להשתמש בטכניקה זו בידוד עבור עכברים עצמאית של גיל, מין או הרקע הגנטי. כדי לקבל מספר מספיק של התא, שבוע 4 – 10 זכרים הם המועדפת, כי תכונות ביולוגיות יכול להשתנות עם הגיל והמין.

2. אופן ההכנה של פתרונות, מדיה, ציפוי

1. להכין פתרון מערכת העיכול (DS) על ידי ערבוב 2.2 מ של Dulbecco´s ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 200 μL Collagenase-Dispase ו- 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
2. הכנת 500 מ"ל של תאי אנדותל בינוני (ECM) על ידי ערבוב 450 מ של DMEM עם 50 מל FCS (כ 10%), 0.25 mL בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה bFGF (20 μg/mL; כ- 0.05%) 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין (כ 1%). לבצע סינון סטרילי שפופרת זכוכית (קוטר של מסנן נקבוביות: 0.2 μm). לאחר מכן לאחסן את הפתרון ב 4 º C.
3. מעיל תא תרבות לוחות כמתואר להלן.
   1. לטיפוח של טרי מבודד לכסות MEC העיקרי מאתר כל המשטח עם 1 מ"ל לכל טוב של 6 טוב תא תרבות צלחת עם פתרון ציפוי הג'לטין המבוסס על מהירות (ראה טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן למשך 3-5 דקות בחדר טמפרטורה (RT).
   2. האחות ולמחוק את ציפוי פתרון. לשטוף כל טוב עם פוספט סטרילי buffered 2 מ ל תמיסת מלח (PBS), pH 7.1-7.5 בשני שלבים עוקבים כביסה.
   3. האחות וזורקים PBS. למלא וולס עם נפח 1 מ"ל של ECM.

3. בידוד של תאי אנדותל Microvascular שריר מאתר ראשי (MMEC)

1. המתת חסד מבוגר אחד 4 – 12 שבועות העכבר הישן, הזכר על ידי נקע בצוואר הרחם ללא כל הרדמה. המטרה היא להפריד במהירות את חוט השדרה של המוח כדי לספק את החיה עם מוות מהיר וללא כאבים.
2. לנתק את הגפיים.
   1. השתמש כירורגי חד/סיגריה (חוד החנית 42 מ"מ, ישר) וחד חד/מספריים (חוד החנית 23 מ מ, ישר), ישר (משונן, 2 מ מ x 1.25 מ מ x 12 ס מ), מעוקל (משונן, 1.3 מ מ x 1 מ מ x 13 ס מ) מלקחיים.
   2. לחטא את כל מכשירי ניתוח עם 70% אתנול.
   3. מקם את החיה על גבו, להרטיב את הרגליים עם 70% אתנול. לנתק את כל הרגל על ידי גזירה על מפרק הירך עם מספריים כירורגיים שארפ/בלאנט. מקם את קצות הגפיים לצלחת תרבות תאים סגורים (35 מ"מ x 10 מ"מ).
      הערה: מעכשיו לבצע בכל שלב תחת תא סטרילי למינארי ועבודה עם מכשירים מעוקר.
3. לבודד רקמת השריר (מעדיפים להשתמש את הירך הארבע ראשי musculus או musculus הסובך השלש ראשי של שתי הרגליים).
   1. לחתוך את העור מהמותן לקצה הבוהן באמצעות מספריים חדות/חד ומלקחיים מעוקל. להחזיק את הבוהן או לו טביעות רגל עם המלקחיים ישר. לקלף את העור עם המלקחיים מעוקל של הבוהן באיזור המותן.
   2. לבודד את הירך הארבע ראשי musculus על ידי חיתוך הגיד של הברך ולנתק את השריר לאורך עצם הירך באיזור המותן. לבודד את musculus הסובך השלש ראשי באמצעות ניתוק גיד אכילס. בעתיד, לחתוך לאורך עצם השוקה הפוסות popliteal ולהסיר את השריר.
      הערה: אם כלי גדול (femoralis א, ע' השוקתי הקדמי, א השוקתי האחורי, השריר השוקיתי א) גלויים שרירים מבודדות, להסיר כלי כדי למנוע זיהום על-ידי macrovascular אנדותל.
   3. כדי להסיר כלי גדול, להחזיק את החלק של השריר אשר אינו מכיל כלי גדול עם מלקחיים מעוקל ולנתק אותו ליד הספינה. עבור פרוטוקול זה, מומלץ 1 g או פחות רקמת שריר שווה הירך הארבע ראשי והן הסובך השלש ראשי .
   4. הוספת µL 2,445 DS (מתוך שלב 2.1) לצלחת תרבות תא (35 מ"מ x 10 מ"מ) וקובעים את המשקל.
   5. להעביר את כל החלקים שריר זה מאכל התרבות התא המכיל את µL 2445 DS ולקבוע את המשקל. ההפרש בין שני הערכים נמדד מספק את משקל יבש של רקמת השריר, אשר לא יעלה על 1 g.
   6. חתוך את רקמת שריר שלם לחתיכות קטנות (≤2 מ מ קוביות, בערך 100 חתיכות) באמצעות את המספריים חדים/חד.
4. לבטל את רקמת השריר.
   הערה: שלב זה לוקח בערך 120 דקות.
   1. חנות ההשעיה שריר/DS ב 37 מעלות צלזיוס (חממה עם 5% CO₂) עבור ה 1.5 מערבבים את המתלים בקפידה כל 20 דקות בערך 5 דקות באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל.
   2. להעביר את ההשעיה 70 μm ניילון תא מסננת על שפופרת 50 מ ל ולאסוף את הזרימה. לשטוף את מסננת תא עם 8 מ של DMEM ולאסוף את הזרימה.
   3. לבטל את ההשעיה מסננת, צנטריפוגה תא 10 דקות ב x 300 גרם ב 20 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
      התראה: צנפה קל לאבד.
   4. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של מאגר lysing אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) (ראה למכתב טבלה של חומרים) עבור פירוק של כדוריות דם אדומות דגירה 30 s-RT. להוסיף 9 מ ל DMEM + 10% FCS כדי לעצור את התגובה ואת העברת התליה תא ל t 15 מ"ל אובה.
5. לרוקן CD45⁺ תאים ההוראות של היצרן גרגרי CD45. עבור כל השלבים הבאים של CD45⁺ דלדול להשתמש מאגר תקליטנים (ראה למכתב טבלה של חומרים).
   הערה: שלב זה לוקח כ- 60 דקות.
   1. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית (מצפה בערך 5 x 10⁶ תאי רקמת שריר g).
   2. צנטריפוגה ההשעיה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. תורידי את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend צנפה תא µL 90 MCS מאגר (לכל 10⁷ תאים או פחות). להוסיף 10 μL של גרגרי CD45 (לכל 10⁷ תאים או פחות).
   3. לערבב תא ההשעיה, תקופת דגירה של 15 דקות במקרר ב 4 – 8 ° c
   4. להוסיף מאגר תקליטנים 1 מ"ל (לכל 10⁷ תאים או פחות). צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend תאים במאגר MCS 500 μL.
   5. תא מגנטי לפרידה להשתמש בעמודת מגנטי גדול (LMC) עם נפח אגירה של 8 mL, קיבולת של עד 2 x 10⁹ תאים הכולל. מקם את LMC בשדה המגנטי של ההפרדה.
   6. לשטוף עם 3 מ"ל של מאגר תקליטנים לתוך המאגר של LMC. לאחר השטיפה, הצב צינור חרוטי 15 מ"ל מתחת לעמודת כדי לאסוף את הזרימה. להחיל את המתלים התא כולו (500 µL) אל העמודה ולתת לו לחלוטין זרימה.
   7. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר תקליטנים לתוך המאגר והמתן עד המאגר column´s ריקה לפני ביצוע השלב הבא כביסה.
   8. לאסוף התאים ללא תווית עובר את העמודה לשימוש בהמשך ההפרדה צעדים (המייצג את CD45 שבר^– ). שכותרתו תאים (המייצג את CD45⁺ שבר) שהצטברו בתוך העמודה יכול להיות מושלך.
6. לצבור CD31⁺ תאים ההוראות הבאות CD31 גרגרי של היצרן. עבור כל השלבים הבאים של CD31⁺ הצטברות להשתמש מאגר תקליטנים.
   הערה: שלב זה לוקח כ- 60 דקות.
   1. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית (מצפה בערך 4 x 10⁶ תאי רקמת שריר g).
   2. צנטריפוגה המתקבל תא ללא תווית ההשעיה שלב 3.5 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס.
   3. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין. Resuspend בגדר במאגר MCS 90 μL ולהוסיף 10 μL של גרגרי CD31 (לכל 10⁷ הכולל תאים או פחות). לערבב את כל המתלים, תקופת דגירה של 15 דקות במקרר ב 4 – 8 ° c
   4. להוסיף 1 מ"ל MCS מאגר צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. . תוריד את תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 500 מאגר תקליטנים.
   5. לצורך הקמת מכשול ההפרדה תא מגנטי להשתמש בעמודת מגנטיים בינוני (MMC) עם נפח אגירה של 3.5 מ ל, בעל קיבולת של עד 2 x 10⁸ תאים הכולל.
   6. מקם את MMC בשדה המגנטי של ההפרדה. יש לשטוף את MMC עם 500 µL מאגר תקליטנים. לאחר השטיפה, הצב צינור חרוטי 15 מ"ל מתחת לעמודת כדי לאסוף את הזרימה.
   7. להחיל את המתלים התא כולו (500 µL) אל העמודה ולתת לו לחלוטין זרימה.
   8. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 500 מאגר תקליטנים והמתן עד המאגר של העמודה ריקה לפני ביצוע השלב הבא כביסה. תאים ללא תווית עובר את העמודה מייצגים את CD45^– CD31^– שבר. לאחסן אותם עבור פקדים איכות נוספים.
   9. הסר העמודה המפריד ומניחים אותו על צינור אוסף מתאימים (הצינור 15 מ"ל). פיפטה 2 מ"ל מאגר תקליטנים אל העמודה. מיד לשטוף החוצה את התאים דיסקות שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה. זה CD45^– CD31⁺ שבר מייצג את לכלכלת מאתר ראשי מועשר
   10. צנטריפוגה תא השעיה במשך 5 דקות ב x 350 גר' ב- 20 ° C. להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע, resuspend תאים (מצפה 0.6 x 10⁶ תאי רקמת שריר g) ב 1 מ"ל ECM (ראה שלב 2.2.). להעביר תאים (0.5-0.7 x 10⁶ תאים) טוב יחיד של צלחת תרבות 6-ובכן מצופה (מתוך שלב 2.3) המכיל 1 מ ל ECM.
7. לטיפוח-תרגול, דגירה תאים-37 ° C ו- 5% CO₂ ב חממה סטרילי. לרענן את ה-ECM כל יומיים שלושה.

4. ראשי MMEC מאתר טיהור

1. לבצע מחזור שני של CD31⁺ הצטברות, ההוראות של היצרן (גרגרי CD31 העכבר פרוטוקול; ראה שלב 3.6.).
   1. ניתוק תאים עם פתרון טריפסין/EDTA כאשר הם במצב זרימה 80-90% (בדרך כלל לאחר 7 ימים). בשביל זה, יש לשטוף כל טוב עם PBS סטרילי 2 מ"ל, בשני שלבים עוקבים כביסה. להשתמש בפתרון טריפסין/EDTA μL 800 לכל 6-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה סטרילי עבור 3-5 דקות להפסיק פעילות אנזימטי באמצעות 1200 μL DMEM מכיל מינימום של 10% FCS.
   2. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב x 350 גר' ב- 20 ° C.
   3. ביצוע השלב השני CD31-MCS להגדיל את הטוהר (לפי ההוראות manufacturer´s גרגרי CD31; ראה 3.6.).
   4. אם צוינו תא זרימה דרך שדה בהיר או שלב-ניגודיות סטנדרטי באמצעות מיקרוסקופ
      20 x הגדלה ו- 0.35 עדשה מפתח נומרי. ראה איור 1.
      הערה: ניתן להשתמש עבור ניסויים בהתאמה תאים או שמרה בתרבות passaging. השתמש תאים עבור ניסויים מיד מעברים נמוך יותר. לא מומלץ להשתמש תאים לאחר המעבר
      8-10.

5. בקרת איכות

1. לבצע cytometry זרימה של ראשי MMEC מאתר לאחר CD31-MCS-השלב השני.
   1. הכן צינור FACS על-ידי הוספת 1 מ"ל לזרום cytometry (FC) מאגר (ראה למכתב טבלה של חומרים).
   2. ניתוק תאים עם פתרון טריפסין/EDTA כאשר הם במצב 100% הנהרות (בדרך כלל לאחר 14 ימים). בשביל זה, יש לשטוף כל טוב עם PBS סטרילי 2 מ"ל, בשני שלבים עוקבים כביסה. להשתמש בפתרון טריפסין/EDTA μL 800 לכל 6-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה סטרילי עבור 3-5 דקות להפסיק פעילות אנזימטי באמצעות 1200 μL DMEM המכיל 10% FCS.
   3. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות נויבאואר ספירת תאים קאמרית ולהוסיף מינימום של עונה 1 פרק 10⁵ תאים אל הצינור FACS מוכן.
   4. צנטריפוגה תא השעיה במשך 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס. לבצע שני צעדים הכביסה על ידי הסרת את תגובת שיקוע, resuspending תאים במאגר 1 מ"ל FC צריך שתוציאו 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס.
   5. להכין תערובת צביעת על-ידי הוספת אנטי עכבר נוגדן CD31-FITC (1: 100) ועכבר נגד CD45-PE (1: 100) עם מאגר FC.
   6. Resuspend תאים μL 100 של צביעת לערבב את החצוצרות שלה FACS. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. להוסיף 1 מ"ל של מאגר FC. צנטריפוגה תא השעיה במשך 5 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאים μL 200 FC המאגר.
   7. למדוד בתאי קהל מעריצים cytometer זרימה שהאסטרטגיה המגביל מוצג באיור. 2A.
2. לחלופין, לבצע immunofluorescence מכתים של ראשי MMEC מאתר לאחר CD31-MCS-השלב השני.
   1. המעיל coverslips.
      1. העברה בקוטר 13 מ מ סטרילי עגול מזכוכית coverslip לבאר של צלחת טוב 24 שעות ביממה. מעיל coverslip על-ידי הוספת µL 300 של מהירות פתרון ציפוי לכל טוב. תקופת דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      2. האחות ולמחוק את ציפוי פתרון. לשטוף כל טוב עם 2 מ"ל PBS סטרילי בשני שלבים עוקבים כביסה. האחות וזורקים PBS.
      3. זרע עונה 1 פרק 10⁵ תאים ב- 1 מ"ל ECM-coverslip מצופה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממה סטרילי עד שהתאים הם 99% confluent.
   2. לבצע קיבוע immunofluorescence מכתים.
      1. הסר את המדיום ECM של תאים מעובדים 5.2.1.3.
      2. לתקן תאים בתרבית על-ידי הוספת µL 300 4% paraformaldehyde (PFA) עם ה-pH של 7.4 לכל טוב, 10 דקות ב 4 º C.
         התראה: כדורגלן הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
      3. לבצע 3 שלבים כביסה על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל היטב ולהסיר את תגובת שיקוע לאחר 5 דקות ב- RT.
      4. הכן של חסימה פתרון המכילה 5% BSA, 0.2% טריטון-X ו- 1% עז סרום ב- PBS.
      5. להוסיף 300 µL של פתרון החוסמת מכל קידוח, תקופת דגירה של h 1-RT.
      6. הסר את תגובת שיקוע להוסיף µL 200 לאדם טוב של נוגדן anti-PECAM-1 (CD31) (1:200) ב- BSA 5%, 1% סרום עז ב- PBS, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      7. לבצע שטיפה צעדים על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל טוב והסרה supernatant לאחר 5 דקות ב RT בכל שלב 3.
      8. להכין פתרון נוגדנים משניים המכיל Cy3 מצומדת נוגדנים IgG אנטי חולדה (שבערך) 1% BSA, PBS. הוסף µL 300 לאדם טוב של הפתרון נוגדנים משניים, תקופת דגירה של h 1 ב RT בחושך.
      9. לבצע שטיפה צעדים על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל טוב והסרה supernatant לאחר 5 דקות ב RT בכל שלב 3.
   3. להוציא את coverslips זכוכית עגול דקה בזהירות עם מלקחיים והעבר אותו לשקופית מיקרוסקופ. הוסף כמות מספקת של הרכבה בינונית דאפי המכיל ברובד תא ' בזהירות לשים זכוכית מכסה עליו (ראה סגור טבלה של חומרים).
   4. צופים תאים עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות המתאים מצויד עם מקור אור זריחה (120 W) ולסנן שני סטים: מסנן עירור/פליטה סט עם 550/25 ננומטר, אורכי גל nm 605/70 לזהות Cy3 540/562 ננומטר.
   5. השתמש במסנן השני יצא עם אורך גל עירור/פליטה של 365/50 ננומטר, 445/50 ננומטר לזהות דאפי 350/440 ננומטר. להשתמש הגדלה של 40 x ולהשתמש בעוצמת 80% 14.5 mW/cm² דאפי עם משך רכישות של גב' 30 גילוי של Cy3 80% של mW/cm 67.5² עם משך רכישות של 60 ms.
3. לבצע PCR כמותי.
   1. בידוד של mRNA.
      1. בצע את נהלי שימוש של ריאגנט thiocyanate-פנול (AGTP) guanidinium חומצה כדי לבודד mRNA. שימוש מינימלי של 0.5 x 10 תאים⁶ מ- CD45^– CD31^– (ראה שלב 3.6.8), CD45^– CD31⁺ (ראה צעד 3.6.9). שברים ומספרים MMEC מאתר ראשי מעובדים (4.1.3)
      2. צנטריפוגה תא השעיה במשך 10 דקות ב x 300 גרם ב 20 º C. . תוריד את תגובת שיקוע לחלוטין. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של השעיה תא ריאגנט והעברה AGTP לתוך צינור תגובה 2 מ"ל. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
      3. להוסיף 100 µL של כלורופורם ומנערים נמרצות במשך 15 ס' Incubate למשך 3 דקות ב- RT.
      4. צנטריפוגה השעיה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
      5. תוריד העליון מימית השלב (מכיל רנ א) בקפידה ולהעביר לתוך צינור התגובה 1.5 mL. להוסיף 250 µL של אלכוהול איזופרופיל ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      6. לבצע צעד צנטריפוגה ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
      7. . תוריד את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של 75% אתנול בקפידה. צנטריפוגה ב 7,500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
         הערה: צניפה קל לאבד.
      8. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין. תן בגדר להתייבש באוויר למשך 5 – 10 דקות.
         הערה: אתנול צריך להיות מוסר אבל לא יבשה מדי.
      9. להמיס גלולה µL המכיל מים diethylpyrocarbonate שטופלו ב 30, חום למשך 10 דקות-55 מעלות צלזיוס.
         הערה: ריכוז ה-RNA וטוהר נמדד על ידי ספקטרלי-photometer.
   2. לבצע סינתזה cDNA (טרנסקריפטאז PCR).
      1. להכין mastermix המכיל: 10 µL של מאגר ה-PCR (5 x), 2, 5 µL desoxyribonucleosid-טריפוספט (dNTP (10 מ מ)), 0.5 µL תערובת אקראי של פריימר חד גדילי (0.2 µg / µL), µL 1 של RNase מעכב (40 U / µL, 0.4 הפוך transcriptase (200 U µL) ו- 5.6 µL של diethylpyrocarbonat מים מטופלים (ראה למכתב טבלה של חומרים).
      2. לדלל RNA ng 500 במים diethylpyrocarbonate שטופלו µL 30 ב- 0.2 מ ל PCR צינורות ולהוסיף את כל mastermix 20 µL.
      3. השתמש הצנטרפוגה PCR של ביצוע בעקבות צעדים: 10 דקות 25 ° C, 30 דקות 50 ° C, 5 דקות 85 ° C ו להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
4. לבצע PCR כמותי (qPCR).
   הערה: ביצוע qPCR דוגמאות של כפילויות או triplicates.
5. השתמש תחל עם שני צבעי זריחה שונים. פריימר עם בליעת 495 ננומטר, של פליטה של 517 nm עבור הגן עניין.
6. עבור זיהוי סמן התא בלוויין גנים, השתמש תחל תיבת לזווג החלבונים 7 (Pax7) ו- M-קדהרין (Cdh15) (ראה למכתב טבלה של חומרים).
7. עבור זיהוי גנים סמן תא אנדותל, השתמש תחל claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ו- zonula occludens-1 (Tjp1 או ZO1) (ראה למכתב טבלה של חומרים).
8. כמו ג'ין הפניה עבור 18s rRNA, להשתמש פריימר לספיגת 538 nm ו של פליטה של גל nm 554.
9. להכין mastermix qPCR של גנים כל עניין עם מן המפתח בהתאמה. Mastermix מכיל: מאגר qPCR 10µl (2x), µL 1 של פריימר עבור ג'ין עניין (10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר עבור 18s rRNA ו- 4 µL של נוקלאז ללא מים.
10. להוסיף 16 µL של mastermix טוב יחיד של צלחת 96-ובכן התגובה. להוסיף 4 µL של cDNA (המתקבל שלב 5.3.2.) לכל טוב המכיל את mastermix.
11. השתמש הצנטרפוגה PCR בזמן אמת של ביצוע בעקבות צעדים: מחזיק במה עם 50 º C למשך 2 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות רכיבה על אופניים הבמה עם 40 מחזורי של 95 ° C 15 s ו- 60 ° C 1 דקות.

תוצאות

יום אחד לאחר בידוד, MMEC מאתר ראשי, ממסר תאים אחרים טופס וקונצרנים, לדבוק התחתון של תרבות מנות (איור 1A יום 1). יום 7 ואילך ניתן לצפות תאים שטוח וארוך. זיהום של אחרים, בעיקר ספרואיד תאים, עם זאת, עדיין גלויים (איור 1A יום 7). לכן, עוד מחזור של CD31 חיובי ?...

Discussion

Microvascular תאי אנדותל לספק פונקציות מכשול ברקמות כל התוצאות שלהם לקוי במחלה של האיברים הקשורים ³. יתר על כן, מחקרים ייחודיים של microvascular EC יכול לסלול את הדרך עבור אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, הבנה עמוקה יותר של microvascular EC תפקוד בתנאים פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological הוא עניין מדעי ר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00