Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Özet

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Özet

İskelet kas kılcal damarlar (kas mikrovasküler endotel hücreleri, MMEC) endotel hücrelerinin kan akışı ve iskelet kasları bulaşıcı karşı immün yanıt yanı sıra sıvı ve besin alışverişini düzenleyen arasındaki bariyeri oluşturmak ajanlar bağışıklık hücre geçiş kontrol ederek. Bu işlevler için MMEC şeklinde bir işlevsel "myovascular birimi" (MVU), fibroblastlar, perisitlerden ve iskelet kas hücreleri gibi daha fazla hücre tipleri ile. Sonuç olarak, bir işlev bozukluğu MMEC ve bu nedenle MVU myopathies geniş bir çeşitlilik katkıda bulunur. Ancak, MMEC düzenleyici mekanizmaları sağlık ve hastalığında yeterince anlaşılır kalır ve onların aydınlatma daha spesifik tedaviler myopathies için önce. Yalıtım ve MVU bağlamında birincil MMEC fonksiyonların derinlemesine soruşturma bu süreçlerin daha iyi bir anlayış dahakolaylaştırabilirdi.

Bu makalede birincil fare MMEC iskelet kas arıtma ve kültür bakım adımlar da dahil olmak üzere mekanik ve enzimatik ayrılma tarafından yalıtmak için bir protokol sağlar.

Giriş

Kan yolu ile hücre ve organların oksijen, yüzeyler ve gerekli diğer molekülleri ile sağlanır. Bu değişim kılcal damarlar, en küçük gemiler yer alır. Kılcal damarlar kas homeostazı intravasküler ve interstisyel alanı arasında başarılı düzenlenmesi için bir ön koşul olan bütünlüğü kalır bir iç endotel hücre (EC) tabaka meydana gelir. EC çözünür faktörler ve hücrelerin seçici bir geçiş sağlamak için bir tarafından sıkıca birbirine monolayer ve adherens kavşaklar ¹oluşturmaktadır. Besin veya metabolik ürünler için engel olarak rolünü yanı sıra, EC düzenleyen lökosit inflamatuar süreçlerde alımı. İltihap veya doku hasarı için adezyon moleküllerinin bir up-yönetmelik EC yüzey ve lökosit eki ve Hicret hedef doku ²içine kolaylaştıran kemokinler üretimine yol açar. Sonuç olarak, EC eleştirel söz konusu olursa patojenleri ya da doku tamiri karşı savunma gibi iltihabi süreçleri düzenlenmesi.

EC disfonksiyon doğrudan olduğunu vasküler hastalıklar, kronik böbrek yetmezliği, Venöz tromboz ağır patojen enfeksiyonları ile ilişkili. Ayrıca, EC hemen hemen her zaman söz konusu olursa organ özgü otoimmünite diabetes mellitus veya multipl skleroz ³gibi. Kan akışı ve organları arasında bariyer fonksiyonu bu nedenle farklı hücre türleri uyumlu bir etkileşim tarafından kontrol edilir. İskelet kas mikrovasküler endotel hücrelerinde (MMEC) ile birlikte kas hücreleri, fibroblastlar ve perisitlerden fonksiyonel ünitesi, "myovascular ünitesi" formu (MVU). Bu nedenle, işlev bozukluğu MVU myopathies Patofizyoloji kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, düzenleyici mekanizmaların daha derin bir anlayış hâlâ kayıp ve şu anda myopathies yeni, acilen gerekli, tedavi hedefleri tanımlaması engellemektedir.

Karmaşık fizyolojik ve patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri yaygın olarak kullanılır. Ancak, vitro modelleri faiz konusunda çeşitli karıştırıcı etkenlere hariç tutarak odaklanmak için avantaj sunuyor. Süreçleri araştırmak için tüp bebek bu saf ve uygun Primer hücre izole etmek gereklidir. Aksine hücre hatları, Primer hücre Transjenik hayvanlar izole genetik değişiklikler tüp bebek sonuçlarını araştırmak için etkinleştirin.

Burada, birincil fare MMEC izole etmek için bir yöntem mekanik ve enzimatik ayrışma teknikleri (MCS) arıtma için sıralama manyetik aktif hücre ardından kod sayfası kullanılmıştır. Bu amaçla, manyetik boncuklar belirli yüzey işaretleyicileri karşı kullanılır. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1, CD31) EC sayılı esas olarak ifade edilir ve bu hücre tipi zenginleştirmek için kullanılabilir. Yüksek hücre saflık emri için hücreleri hematopoetik kökenli bir negatif seçim tarafından için protein tirozin fosfataz reseptör tip C (PTPRC, CD45) hariç tutulur. Ayrıca, kalite denetimleri, birincil fare MMEC, potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar yanı sıra özel hususlar ekimi sunulmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri yerel makamlar tarafından onaylanmış ve Alman hayvan hakları yasası (84-02.05.20.13.097) göre yapılmıştır.

1. genel açıklamalar üzerinde hayvan deneyleri

1. Tüm fare deneyleri ilgili Kurumsal hayvan bakımı yönergelere uygun olarak gerçekleştirmek ve komite kullanın.
2. Fareler standart koşullar altında ve Federasyon laboratuvar hayvan bilim dernekler (FELASA) gibi uluslararası kurallara göre tutmak.
   Not: Genel olarak bu yalıtım teknik fareler yaş, cinsiyet ya da genetik geçmişi bağımsız için kullanılabilir. Biyolojik özellikleri yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü yeterli bir cep numarası almak için 4 – 10 hafta eski tercih edilen, erkeklerdir.

2. çözüm, medya ve kaplama hazırlanması

1. Sindirim çözüm (DS) 2,2 mL, Dulbecco´s modifiye kartal orta (DMEM) ile 200 μL karıştırılarak hazırlamak Collagenase-Dispase ve 45 μL Desoxyribonuclease (Dnaz).
2. Endotel hücre orta (ECM) 500 mL 50 mL FCS ile DMEM (yaklaşık %10), 0.25 mL temel fibroblast büyüme faktörü bFGF (20 μg/mL; yaklaşık % 0.05) 450 mL karıştırarak hazırlayın ve 5 mL penisilin-streptomisin (yaklaşık % 1). Steril filtrasyonu bir cam tüp içinde gerçekleştirmek (filtre gözenek çapı: 0,2 mikron). Daha sonra çözüm 4 ° C'de depolayın
3. Hücre kültür plakaları aşağıda açıklandığı gibi kat.
   1. Taze izole birincil fare MEC kapak ekimi için 1 mL 6 kuyu başı ile tüm yüzeyi de hücre kültür plaka göre jelatin hız kaplama solüsyonu ( Tablo malzemelerigörmek) Oda, 3-5 min için üreticinin yönergelerine uygun Sıcaklık (RT).
   2. Aspire edin ve kaplama çözüm atın. Her şey 2 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.1-7,5 iki ardışık çamaşır adımda ile yıkayın.
   3. Aspire edin ve PBS atın. Wells ECM hacmi 1 mL ile doldurmak.

3. yalıtım birincil fare kas mikrovasküler endotel hücre (MMEC)

1. Bir yetişkin ötenazi 4-12 hafta yaşlı, erkek fare ile herhangi bir anestezi olmadan servikal çıkığı. Hızlı bir şekilde--dan böylece hayvan ile hızlı ve acısız bir ölüm sağlamak için beyin omurilik ayırmak için amaçtır.
2. Ekstremitelerde sever.
   1. Cerrahi keskin/künt (kesme kenarı 42 mm, düz) kullanın ve keskin/keskin (kesme kenarı 23 mm, düz) Çalışma platformları, kent (tırtıklı, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) ve bir eğri (tırtıklı, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) forseps.
   2. % 70 etanol ile tüm cerrahi aletler dezenfekte.
   3. Hayvan sırtında konumlandırın, bacaklar % 70 etanol ile nemlendirin. Tüm bacak, Kalça eklemi keskin/blunt Cerrahi makas ile keserek sever. Ekstremitelerde bir kapalı hücre kültür tabak (35 mm x 10 mm) yerleştirin.
      Not: Şu andan itibaren her adımda bir steril laminar akış başlık altında gerçekleştirmek ve sterilize edilmiş aletlerde iş.
3. Kas dokusu izole (tercihen musculus kuadriseps kemiği veya musculus triceps surae her iki bacakta üzerinden kullanın).
   1. Deriyi kalça ayak ucunu açık bir keskin/keskin makas ve eğri forseps kullanarak kesme. Ayak veya footpad düz Forseps ile tutun. Kalça için ayak üzerinden forseps eğri ile derisini soyma.
   2. Musculus kuadriseps kemiği diz tendon keserek ayırmak ve kas kalça için uyluk boyunca sever. Musculus triceps surae Aşil tendonu kesilmesinin tarafından izole et. Bundan sonra popliteal fossa tibia kesmek ve kas kaldırın.
      Not: Büyük gemilerin (A. femoralis, A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis) kasları izole görünür, damarları tekrarlamışlar endotel tarafından kirlenmesini önlemek için kaldırın.
   3. Büyük gemilerin kaldırmak için büyük gemilerin kavisli bir Forseps ile içermeyen kas bölümünü tutan ve geminin yanında kesmek. Bu iletişim kuralı için 1 g veya daha az kas dokusu kuadriseps kemiği ve triceps surae eşit önerilir.
   4. Bir hücre kültür çanak (35 mm x 10 mm) (Kimden adım 2.1) 2,445 µL DS ekleyin ve ağırlığı belirlemek.
   5. 2445 µL DS içeren bu hücre kültür yemek için kas taşlarını aktarmak ve ağırlığı belirlemek. Her iki ölçüm değerleri fark kuru ağırlığı 1 g'ü kas dokusunun sağlar.
   6. Tüm kas dokusu keskin/keskin makas kullanarak (≤2 mm küpleri, yaklaşık 100 adet) küçük parçalar halinde kes.
4. Kas dokusu ayırmak.
   Not: bu adım yaklaşık 120 dakika sürer.
   1. 37 ° C'de % 5 CO₂(kuluçka) 1,5 h. için mağaza kas/DS süspansiyon süspansiyon dikkatle her 20 dk 1 mL insülin kullanarak yaklaşık 5 min için karıştırın.
   2. Aracılığıyla akış toplamak ve süspansiyon 70 mikron naylon hücre süzgeç bir 50 mL tüp yerleştirilir transfer. Hücre süzgeç DMEM 8 mL ile yıkama ve aracılığıyla akış toplamak.
   3. Hücre süzgeç ve santrifüj süspansiyon 300 x g 20 ° C'de 10 dakika için atmak Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
      Dikkat: Pelet kaybetmek kolay.
   4. Hücre Pelet amonyum klorür potasyum (ACK) lysing arabelleği 1 mL resuspend (içine Malzeme tablobkz:) kırmızı kan hücre lizis için ve kuluçkaya 30 RT. eklemek 9 mL DMEM s + % 10 FCS 15 mL t tepki ve transfer hücre süspansiyon durdurmak için UBE.
5. CD45 tüketmek⁺ hücreleri CD45 lastikteki üreticisinin yönergeleri izleyin. CD45 tüm aşağıdaki adımları için⁺ tükenmesi MCS arabellek kullanın (bkz. içine malzeme tablo).
   Not: bu adım yaklaşık 60 dakika sürer.
   1. Odası sayma Neubauer hücre kullanarak cep numaraları belirlemek (g kas dokusu başına yaklaşık 5 x 10⁶ hücre beklemek).
   2. Santrifüj süspansiyon 300 x g 4 ° C'de 10 dk de Tamamen süpernatant geçirmek ve hücre Pelet 90 µL MCS arabellek (10⁷ hücreleri veya daha az) içinde resuspend. CD45 lastikteki (10⁷ hücreleri veya daha az) 10 μL ekleyin.
   3. Hücre süspansiyon mix ve buzdolabında 4-8 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
   4. 1 mL MCS arabellek (10⁷ hücreleri veya daha az) ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj Süpernatant tamamen kaldırmak ve 500 μL MCS arabellek hücrelerde resuspend.
   5. Manyetik hücre ayrılması için 8 mL rezervuar hacmi ve 2 x 10⁹ toplam hücre kapasitesi ile büyük bir manyetik sütun (IMC) kullanın. LMC ayırıcı manyetik alanına getirin.
   6. MCS arabellek ile 3 mL LMC göle durulayın. Sonra durulama, 15 mL konik tüp ile akış toplamak için sütununun altında yerleştirin. Bütün hücre süspansiyon (500 µL) sütuna uygulamak ve tamamen akış izin verin.
   7. Göle 3 mL MCS arabelleği ekleyerek sütun üç kez yıkama ve column´s rezervuar sonraki çamaşır adım gerçekleştirmeden önce boş olana kadar bekleyin.
   8. Toplamak sütunu geçen etiketlenmemiş hücreleri daha fazla ayırma adımları için kullanın (CD45 temsil eden^- kesir). Hücreleri etiketli (CD45 temsil eden⁺ kesir) içinde birikmiş sütunu atılır.
6. CD31 birikir⁺ hücreleri aşağıdaki CD31 lastikteki prosedürü yerine getirin. CD31 tüm aşağıdaki adımları için⁺ birikimi MCS arabellek kullanın.
   Not: bu adım yaklaşık 60 dakika sürer.
   1. Odası sayma Neubauer hücre kullanarak cep numarasını belirlemek (g kas dokusu başına yaklaşık 4 x 10⁶ hücre beklemek).
   2. Santrifüj etiketlenmemiş hücre süspansiyon adım 3.5 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için elde edilen
   3. Süpernatant tamamen kaldırın. Pelet 90 μL MCS arabellekte resuspend ve 10 μL CD31 lastikteki (10⁷ toplam hücreleri veya daha az) ekleyin. Bütün süspansiyon mix ve buzdolabında 4-8 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
   4. 1 mL MCS tampon ve santrifüj 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin Süpernatant almak ve MCS arabelleği 500 µL hücrelerde resuspend.
   5. Manyetik hücre ayrılması için 3,5 mL rezervuar hacmi ve 2 x 10⁸ toplam hücre kapasitesi ile orta manyetik sütun (MMC) kullanın.
   6. MMC ayırıcı manyetik alanına getirin. MMC 500 µL MCS arabelleği ile yıkayın. Sonra durulama, 15 mL konik tüp ile akış toplamak için sütununun altında yerleştirin.
   7. Bütün hücre süspansiyon (500 µL) sütuna uygulamak ve tamamen akış izin verin.
   8. Sütun 500 µL MCS arabelleği ekleyerek üç kez yıkama ve sonraki çamaşır adım gerçekleştirmeden önce sütunun rezervuar boşalana kadar bekleyin. Sütun geçen etiketlenmemiş hücreleri gösteren CD45^- CD31^- kesir. Onları daha fazla kalite kontrolleri için saklayın.
   9. Sütun ayırıcı kaldırmak ve bir uygun toplama tüp (15 mL tüp) yerleştirin. Bir pipet 2 mL MCS arabellek sütuna. Hemen manyetik olarak etiketli hücreleri sıkıca sütuna pistonu iterek sifonu çek. Bu CD45^- CD31⁺ kesir temsil eden zenginleştirilmiş birincil fare EC
   10. Santrifüj hücre süspansiyon 350 x g 20 ° C'de, 5 min için Süpernatant tamamen kaldırmak ve 1 mL ECM (0,6 x 10 g kas dokusu başına⁶ hücre bekliyoruz) hücrelerde resuspend (bkz. Adım 2.2.). Hücreler (0.5-0.7 x 10⁶ hücreleri) kaplamalı 6-şey kültür plaka tek bir şey için (Adım 2.3) Aktarım ECM 1 mL içeren.
7. Tarım için hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ steril bir kuluçka kuluçkaya. ECM her iki üç günde yenileyin.

4. birincil fare MMEC arıtma

1. CD31 ikinci bir döngü gerçekleştirmek⁺ birikimi, üreticinin yönergeleri izleyin (CD31 lastikteki fare Protokolü; Bkz. Adım 3.6.).
   1. (Genellikle 7 gün sonra) 80-%90 izdiham olduklarında hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile bağlantısını kesin. Bunun için her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. 6-şey başına 800 μL tripsin/EDTA çözüm kullanın ve 37 ° C ve % 5 CO₂ 3-5 dk. Stop enzimatik aktivite için steril bir kuluçka kuluçkaya 1200 μL en az % 10 FCS içeren DMEM kullanarak.
   2. Hücre süspansiyon vasıl 350 x g 20 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
   3. Saflık (CD31 lastikteki manufacturer´s yönergeleri için according; 3,6 bakın.) artırmak için ikinci CD31 MCS adımı gerçekleştirin.
   4. Hücre izdiham yolu ile parlak alan veya çift faz kontrast mikroskobu kullanarak gözlemlemek bir
      20 x büyütme ve sayısal 0,35 lens diyaframı. Bkz: şekil 1.
      Not: Hücreleri ilgili deneyler için kullanılan ya da kültür passaging tarafından tutulur. Hücreleri hemen alt geçit olarak deneyler için kullanın. Sonra geçiş hücreleri kullanmak için tavsiye edilmez
      8 – 10.

5. kalite kontrol

1. Akış Sitometresi birincil fare MMEC, ikinci CD31-MCS-adım sonra gerçekleştirin.
   1. 1 mL Akış Sitometresi (FC) arabellek ekleyerek bir FACS tüp hazırlayın (içine Malzeme tablobakınız).
   2. Ne zaman onlar are %100 izdiham (genellikle 14 gün sonra) hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile bağlantısını kesin. Bunun için her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. 6-şey başına 800 μL tripsin/EDTA çözüm kullanın ve 37 ° C ve % 5 CO₂ 3-5 dk. Stop enzimatik aktivite için steril bir kuluçka 1200 μL kullanarak kuluçkaya % 10 FCS içeren DMEM.
   3. Hücre sayımı odası ve en az 1 x 10⁵ hücre için hazırlanan FACS tüp eklemek bir Neubauer kullanarak cep numarasını belirleyin.
   4. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika Süpernatant kaldırarak, 1 mL FC arabelleğe hücrelerde resuspending ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için centrifuging iki çamaşır adımı gerçekleştirin
   5. Anti-fare CD31-FITC antikor (1: 100) ve anti-fare CD45-PE (1: 100) FC Arabellek ile ekleyerek boyama bir karışım hazırlayın.
   6. FACS tüpler karışımda boyama 100 μL hücrelerde resuspend. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya FC arabelleğe 1 mL ekleyin. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 5 min için Dikkatle süpernatant kaldırmak ve FC arabelleği 200 μL hücrelerde resuspend.
   7. Perdeleme strateji şekilde gösterildiği bir Akış Sitometresi aşağıdaki hücrelerde ölçmek. 2A.
2. Alternatif olarak ayirt birincil fare MMEC ikinci CD31-MCS-adım sonra boyama gerçekleştirmek.
   1. Kat coverslips.
      1. Steril 13 mm çapında yuvarlak cam coverslip 24 iyi plaka bir kuyunun içine aktarın. Coverslip hız kaplama çözüm iyi başına 300 µL ekleyerek kat. 3-5 dk, oda sıcaklığında (RT) için kuluçkaya.
      2. Aspire edin ve kaplama çözüm atın. Her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. Aspire edin ve PBS atın.
      3. Tohum 1 x 10⁵ 1 ml ECM kaplı coverslip üzerinde hücreleri ve hücre % 99 birleşmesi kadar 37 ° C ve % 5 CO₂ steril bir kuluçka kuluçkaya.
   2. Fiksasyon ve ayirt boyama gerçekleştirmek.
      1. ECM orta ekili hücre 5.2.1.3 kaldırın.
      2. Kültürlü hücreleri ile pH 7.4 şey, 4 ° C'de 10 dakika başına 300 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyerek düzeltmek
         Uyarı: İngiltere'de yılın toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.
      3. 1 mL PBS iyi başına ekleyerek 3 çamaşır adımlarını gerçekleştirin ve RT., 5 dk sonra süpernatant kaldırmak
      4. Hazırlamak bir engelleme çözüm içeren % 5 BSA, PBS % 0,2 Triton-X ve % 1 keçi serum.
      5. Her şey için 300 µL engelleme çözüm ekleyin ve RT. 1 h için kuluçkaya
      6. Süpernatant kaldırmak ve bir anti-PECAM-1 (CD31) antikor (1: 200) kuyu başına 200 µL % 5 BSA, % 1 keçi serum PBS içinde ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
      7. 3 adımları iyi başına 1 mL PBS ekleyerek veya kaldırarak her adımda RT, 5 dk sonra süpernatant yıkama gerçekleştirin.
      8. % 1 BSA ve PBS Cy3 Birleşik Anti-sıçan IgG antikor (1:500) içeren bir ikincil antikor çözüm hazırlamak. İkincil antikor çözüm kuyu başına 300 µL ekleyin ve karanlıkta RT, 1 h için kuluçkaya.
      9. 3 adımları iyi başına 1 mL PBS ekleyerek veya kaldırarak her adımda RT, 5 dk sonra süpernatant yıkama gerçekleştirin.
   3. Yuvarlak cam coverslips dikkatle Forseps ile almak ve mikroskopi slayt aktarın. Orta içeren DAPI hücre katmanı üzerinde montaj uygun bir miktar eklemek ve dikkatli bir cam üzerinde (kapalı Tablo reçetesigörmek) koymak.
   4. Hücreleri Floresan ışık kaynağı (120 W) ile donatılmış bir uygun Floresans mikroskobu ile gözlemlemek ve iki kümeleri filtre: bir uyarma/emisyon filtresi ayarla 550/25 ile nm ve 605/70 nm dalga boyu Cy3 540/562 nm algılamak için.
   5. 365/50 bir uyarma/emisyon dalga boyu ile ayarla ikinci filtre kullanmak nm ve 445/50 nm DAPI 350/440 nm algılamak için. 40 x büyütme ve % 80 şiddette, DAPI için 14,5 mW/cm² 30 Bayan Cy3 algılanması için bir satın alma süresi 60 ms bir satın alma süresi ile 67,5 mW/cm^%2 80'i kullanır.
3. Kantitatif PCR gerçekleştirin.
   1. MRNA izolasyonu.
      1. Standart prosedürler mRNA yalıtmak için bir asit guanidinium thiocyanate-fenol (AGTP) Reaktif kullanarak izleyin. X 10⁶ CD45 hücrelerden en az 0,5 kullanmak^- CD31^- (bkz. Adım 3.6.8) CD45^- CD31⁺ (bkz. Adım 3.6.9.) kesirler ve ekili birincil fare MMEC (4.1.3)
      2. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 20 ° C'de 10 dakika Tamamen süpernatant geçirmek. Hücre Pelet AGTP reaktif ve transfer hücre süspansiyon 500 µL içinde 2 mL tepki tüp içine resuspend. Dik, 5 min için kuluçkaya
      3. Kloroform 100 µL ekleyin ve shake şiddetle RT. adlı 3 dk 15 s. Incubate için
      4. Santrifüj süspansiyon, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika
      5. (RNA içeren) üst sulu faz dikkatlice ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarın. İsopropanol 250 µL ekleyin ve 10 dk RT. az için kuluçkaya
      6. 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g Santrifüjü adımda gerçekleştirmek
      7. Süpernatant almak ve 1 mL % 75 etanol dikkatle ekleyin. 4 ° C'de 5 min için 7.500 x g , santrifüj
         Not: Pelet kaybetmek kolaydır.
      8. Süpernatant tamamen kaldırın. 5 – 10 dakika yayında kuru Pelet izin.
         Not: etanol ihtiyacı var ama kaldırılacak çok fazla kuru değil.
      9. Pelet 30 µL tedavi diethylpyrocarbonate içeren su ve ısı 55 ° C'de 10 dakika içinde erimesi
         Not: RNA konsantrasyon ve saflık bir tayf-Foto ölçüler tarafından ölçülebilir.
   2. CDNA sentezi (ters transkriptaz PCR) gerçekleştirin.
      1. İçeren bir mastermix hazırlamak: 10 µL PCR arabellek (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL rasgele karışım tek iplikçikli astar (0.2 µg / µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U / µL, 0,4 ters transkriptaz (200 U/µL) ve 5.6 µL diethylpyrocarbonat tedavi su (bkz: kapalı malzemeler tablo).
      2. 500 ng RNA suda 30 µL tedavi diethylpyrocarbonate 0.2 mL PCR tüpleri ve tüm 20 µL mastermix ekleyin sulandırmak.
      3. PCR cycler adımları kullanın: 10 dk 25 ° C, 30 dk 50 ° C, 5 dk 85 ° C ve 4 ° C'de tutun
4. Kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştirin.
   Not: QPCR örneklerin çoğaltmaları veya triplicates yerine getirmek.
5. Astar iki farklı floresan boyalar ile kullanın. Astar ile 495 bir emilimini nm ve Salma 517 nm gen ilgi için.
6. Eşli kutu protein 7 için astar (Pax7) ve M-cadherin (Cdh15) uydu hücre marker gen ekspresyonu tespiti için kullanın (bkz. içine Malzeme tablo).
7. Astar claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ve zonula occludens-1 (Tjp1 veya ZO1) endotel hücre marker gen ekspresyonu algılaması için kullanabilir (bkz: kapalı malzemeler tablo).
8. 18s için referans gen olarak rRNA, kullanım astar 538 emilimini ile a nm ve Salma 554 nm dalga boyu.
9. Her gen ilgili astar ile ilgi için bir qPCR mastermix hazırlayın. Mastermix içerir: 10µl qPCR arabellek (2 x), gen ilgi (10 µM), astar 1 µL 18s için astar 1 µL rRNA ve su Ücretsiz 4 µL nükleaz.
10. Mastermix 16 µL 96-iyi tepki plaka tek bir şey için ekleyin. 4 µL de mastermix içeren başına cDNA (5.3.2 adımından sağlanır.) ekleyin.
11. Bir gerçek zamanlı PCR cycler adımları kullanın: 1 min için 10 dk. Bisiklete binme sahne 40 çevrimleri ile 95 ° C 15 s ve 60 ° C ile 50 ° C için 2 dk ve 95 ° C sahne tutarak.

Sonuçlar

Bir gün sonra yalıtım, birincil fare MMEC ve kalan diğer hücreleri ikinci büyük şirketler oluşturmak ve kültür yemekleri (şekil 1A gün 1) altına uygun. Günden sonra 7, düz ve uzun hücreleri görülebilir. Ancak, diğer, çoğunlukla küresel hücreleri, kirlenme hala görülür (şekil 1A gün 7). Böylece, başka bir döngüsü CD31 pozitif seçim yoluyla MCS gereklidir. Bundan sonra birincil fare MMEC ...

Tartışmalar

Mikrovasküler endotel hücreleri bariyer işlevleri tüm dokularda ve ilişkili organları ³hastalığında disfonksiyon sonuçları sağlar. Ayrıca, organ özel çalışmalar mikrovasküler EC yeni tedavi stratejileri için önünü açabilir. Bu nedenle, mikrovasküler EC işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında daha derin bir anlayış büyük bilimsel ilgi. Modülasyon lökosit/endotel etkileşim başarıyla natalizumab, lenfosit yapışma önleyen bir antikor multipl skleroz ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00