JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، يمكننا وصف استخدام موائع جزيئية أعلى إنتاجية مفاعل حيوي مقترنة مجهر فلوري لتحليل آثار إجهاد القص على الأغشية الحيوية الزائفة الزّنجاريّة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء، بما في ذلك الصك قم بإعداد، تحديد التغطية بيوفيلم ومعدل النمو والخصائص المورفولوجية.

Abstract

وقد استخدمت موائع جزيئية أعلى إنتاجية في المختبر مفاعل حيوي مقترنة بالأسفار الفحص المجهري لدراسة النمو البكتيري بيوفيلم ومورفولوجيا، بما فيها الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة). وهنا، نحن سوف تصف كيف يمكن استخدام هذا النظام لدراسة حركية النمو والخصائص المورفولوجية مثل خشونة السطح والتكوينية اعتلاج سلالة P. الزّنجاريّة PA01 أن تعرب عن تعزيز بروتين فلورية خضراء (PA01-اجفب ). بروتوكول مفصل سوف تصف كيفية النمو والبذور الثقافات PA01-اجفب، وكيفية تعيين مجهر والتشغيل التلقائي، وإجراء تحليل الصورة لتحديد معدل النمو والخصائص المورفولوجية باستخدام مجموعة متنوعة من قوي القص التي يسيطر عليها جهاز موائع جزيئية. هذه المادة سوف توفر وصفاً مفصلاً لتقنية لتحسين دراسة الأغشية الحيوية PA01-اجفب التي يمكن تطبيقها في نهاية المطاف نحو أخرى سلالات من البكتيريا أو الفطريات أو الطحالب من الأغشية الحيوية باستخدام منصة موائع جزيئية.

Introduction

هنا، وسوف ندلل على طريقة لقياس تأثير إجهاد القص على تشكيل الفلورسنت الأغشية الحيوية PA01 الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة) استخدام نظام الآلي موائع جزيئية أعلى من الناتج.

الأغشية الحيوية هي مجتمعات من الكائنات المجهرية، مثل البكتيريا، تنظمها مادة البوليمر خارج الخلية التي يتم إرفاقها دعم، وتوجد عادة في مجال التفاعل بين سائل و سطحية صلبة1. يمكن أن تكون هذه المجتمعات بيوفيلم مفيدة للبيئة، مثل تحسين نوعية المياه في خطوط الإمداد بالمياه والمعالجة البيولوجية لوعورة المركبات2،3. لكن، يمكن أيضا أن الأغشية الحيوية جداً ضارة بصحة الإنسان بعواقب غير مرغوب فيها. على سبيل المثال، الأجهزة الطبية، مثل يزرع في الورك والركبة، هي نوع واحد من السطح حيث تراكم بيوفيلم تحديا ويتسبب في مضاعفات طبية خطيرة4،5. الأغشية الحيوية يمكن أيضا إدخال نظم المياه الطبيعية، مثل الأنهار والبحيرات، واختراق أنابيب الإمداد بالمياه مما يؤدي إلى تلوث البكتيريا في مياه الشرب أدى إلى إصابة6،،من78. تلتزم السفن وأخرى من صنع الإنسان ركائز الأغشية الحيوية التي شكلت في البيئات البحرية وتقديم مشكلة اقتصادية وبيئية كبيرة زيادة الاحتكاك يؤدي إلى زيادة استهلاك الوقود9،10. الطلاءات المضادة للميكروبات، مثل ثلاثي بوتيل القصدير، وقد وضعت لمنع هذه المشاكل ولكن سامة للحياة البحرية11.

P. الزّنجاريّة بكتيريا سلبية الغرام مع قدرات عالية مزدهرة في مجموعة متنوعة من الظروف البيئية ونوتريمينتال12. P. الزّنجاريّة هو سبب الشائع للعدوى المكتسبة من المجتمع، ومستشفى، ووجدت أن تكون وثيقة المرتبطة بالإصابات، مثل الحروق الشديدة، ويستضيف المناعة، كما هو الحال في التليف الكيسي (CF)5،12، 13، والإيدز، ومرضى السرطان5،13. تم ربط تشكيل P. الزّنجاريّة الأغشية الحيوية الأكثر جدية لقوات التحالف، حيث التهابات الرئة المزمن هي السبب الرئيسي لوفاة هذا المرض5.

سلالة مرجعية من P. الزّنجاريّة، PA01، ويستخدم في هذا التقرير وهو محوره وراثيا للتعبير عن تعزيز بروتين فلورية خضراء (السلطة الفلسطينية-اجفب). اجفب يمثل شكلاً متحولة للتجارة والنقل مع خصائص fluorescence أكبر مما يسمح بتحليل بيوفيلم في الموقع استخدام fluorescence مجهرية14،،من1516. هذا النوع من التحليل الأسفار مفيد لدراسة الأغشية الحيوية للتجارة والنقل لا تتداخل إلى حد كبير مع نمو الخلايا ووظيفة17. على سبيل المثال، نمت خلايا الإشريكيّة القولونية التي تم تمييزها بالتجارة والنقل جيد ومستمر دون عانى أي تأثيرات سامة بالمقارنة ب البكتريا التحكم17. تقارير أخرى تثبت هذا الادعاء18،،من1920. وعلاوة على ذلك، استخدام مراسل الفلورسنت مثل اجفب سريعة وبسيطة، ومع ذلك سيتم قياس الخلايا الحية فقط نظراً لتوقف الخلايا الميتة بسرعة فلوريس21.

الأغشية الحيوية يمكن أن تنمو تحت ظروف بيئية مختلفة بما في ذلك تلك التي لديها معدلات تدفق مختلفة. على سبيل المثال، يمكن أن تنمو الأفلام في إجهاد القص عالية، كما هو الحال في الأنهار، حيث تؤدي ظروف تدفق المياه العالية إلى تنوع الميكروبي أكبر22. على النقيض من ذلك، تجربة المياه الراكدة في البرك أو الأغشية الحيوية عن طريق الفم كثير أقل قص قوة23. بالإضافة إلى معدل التدفق، وهناك عوامل أخرى تؤثر على التصاق بيوفيلم، بما في ذلك خشونة السطح وهيدروفوبيسيتي، تركيب وسائل الإعلام، وحتى البكتريا الخلية السطحية1،،من47، 24-شروط يمكن أيضا أن يسبب الاختلاف في الهيكل المكاني أو مورفولوجية بيوفيلم. وهذا يشمل الظروف البيئية مثل إجهاد القص تمارسها سائل تتحرك أو التدرجات في توافر المغذيات والعوامل البيولوجية مثل الأنواع الموجودة في النظام وحركية من الخلايا والبروتينات المحددة الموجودة في الخلية مادة البوليمر25،،من2627. في ظل بعض الظروف، سيكون بيوفيلم الشبيهة بالحديقة (السلس وشقة)، في حين في ظل ظروف أخرى بيوفيلم سوف تكون خشنة، رقيق، أو حتى مثل فطر28. بينما الفرق النوعي بين المروج بيوفيلم والهياكل فطر يمكن رؤيتها بوضوح في الصور المجهرية، فهم العلاقة بين بنية الفيلم والعمليات البيولوجية داخل الفيلم يتطلب منهجية والكمية أساليب وصف مورفولوجية. تتضمن الخصائص المورفولوجية اقترحه الباحثون لدراسة المسامية، البعد كسورية، وطول ديفوسيونال، منطقة ميكروكولوني التحتية وحجم ميكروكولوني، ومعامل الخشونة، والتكوينية الانتروبيا29،30 .

وتستخدم المفاعلات الحيوية في دراسة الأغشية الحيوية لتحاكي ظروف الحياة الحقيقية31. بالتنقيط تدفق المفاعلات (الترميد) تمثل بيئة القص المنخفض حيث تدفق المواد المغذية في وسائل الإعلام ببطء عبر الخلايا التي يتم إرفاق إلى سطح على مر الزمن لتشكيل بيوفيلم مع خلية عالية كثافة32. مفاعلات مركز السيطرة على الأمراض بالمفاعلات الحيوية التي تخلق بيئة السوائل عالية القص إجهاد عن السيطرة على قضيب إثارة يدور باستمرار داخل وسائط الإعلام ملء خزان33. هذه الأنواع من المفاعلات الحيوية بسيطة لإعداد، ولكن محدودة في نطاقها بسبب حجم العينة منخفضا نسبيا، الاستهلاك المرتفع لوسائط الإعلام، وكميات كبيرة من النفايات اوتوكلاف المنتجة من وسائل الإعلام بالتنقيط التدفقات تتراوح بين 125 ميليلتر الدقيقة للمفاعلات تدفق بالتنقيط إلى أكثر من 1 مل/دقيقة لمفاعلات مركز السيطرة على الأمراض، والحاجة إلى اﻷوتوكﻻف كميات كبيرة من الأواني الزجاجية والنفايات الوسائط34. الأغشية الحيوية لا تنمو بشكل متساو عبر السطح في مفاعل تدفق بالتنقيط لأنه يسبب القص المنخفض لوسائل الإعلام زائدة على طول تكتلات أكبر من P. الزّنجاريّة البكتيريا ولذلك، نمو بيوفيلم ليس سلس جداً ولا يمكن أن تكون العينات غير متكافئ حلل بسهولة مع الأسفار مجهرية35،36 .

يتم التغلب على بعض القيود الشائعة في مفاعل حيوي باستخدام مفاعل حيوي موائع جزيئية الإنتاجية المتوسطة، حيث مطلوبة فقط ملليلتر من وسائل الإعلام، ولوحات رد فعل صغيرة ويسهل التخلص منها بعد التعقيم37. وعلاوة على ذلك، تبعاً لعدد الآبار، تكرار العديد من يمكن أن يؤديها في مفاعل واحد فقط تشغيل، مما يوفر كمية كافية من البيانات لإجراء التحليل الإحصائي ذات مغزى. ويرد في الشكل 1، المكونات المختلفة لنظام الفحص المجهري موائع جزيئية تسمح لظروف خاضعة للرقابة، بما في ذلك درجة الحرارة وتدفق معدل38،،من3940،. مفاعل حيوي يقترن بالأسفار الفحص المجهري لتصور الأسفار علامة اجفب في PA01 تحت تطبيق منخفضة من خلال شروط القص العالية التي سوف تحاكي سيناريوهات أكثر واقعية التي تتم مواجهتها في البيئة أو في مجال الطب الحيوي.

figure-introduction-7209
الشكل 1 : المكونات الفردية لنظام موائع جزيئية. يتم سرد المكونات الفردية من اليسار إلى اليمين: 1. كاميرا CCD، 2. "المجهر المقلوب القرار عالية" مع المرحلة الآلي والآلي وحدة الأسفار، وضبط تلقائي للصورة النمطية، 3. "لوحة المرحلة" 4: نظام واجهة، 5 التصوير: "دليل المجهر المرحلة" التحكم، 6: مصيدة بخار، 7: نظام تحكم (بما في ذلك درجة الحرارة)، 8 التصوير: "وحدات تحكم الأجهزة"، 9: Fluorescence تحكم، 10: "إمداد الطاقة غير المتقطعة"، 11: محرك قرص "ثابت خارجي" "تخزين الصور"، 12: كمبيوتر محطة عمل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويرد في الشكل 2مقتطفات من لوحة موائع جزيئية. لوحات الأكثر شيوعاً تتكون من 48 بئرا. تجربة واحدة يتطلب مدخل واحد والآبار منفذ واحد، ومجموعة من الآبار 2. وهذا يسمح ل 24 تجارب المتزامنة التي يمكن تنفيذها مع مختلف الظروف التجريبية، مثل السلالات البكتيرية، العلاجات المضادة للميكروبات، ووسائل الإعلام تختلف من قناة إلى قناة، والتحكم في تدفق القص لكل عمود من ست قنوات. تسيطر درجة الحرارة التجريبية أيضا مع إعداد واحد من درجة الحرارة في جميع أنحاء اللوحة. قنوات موائع جزيئية تبين أن كل قناة منطقة السربنتين توفير الضغط الخلفي كافية والقص التي تسيطر عليها.

figure-introduction-8636
الشكل 2: التصور قنوات موائع جزيئية ونافذة عرض. يتم تمييز بئرين مدخل ومخرج مع القنوات موائع جزيئية ربطها مع الأصباغ الحمراء والخضراء. الصبغ يجعل تظهر منطقة السربنتين في كل قناة مما يخلق ضغطاً كافياً على الظهر والقص الخاضعة للرقابة أثناء تدفق السائل. يمكن تصويرها كل قناة العرض (داخل الدائرة الحمراء) مع أطوال موجية المرجوة. يظهر هي ميدان مشرق (أعلى) ونيون (أسفل) صور مجهرية من قناة واحدة مع بيوفيلم PA01-اجفب استخدام هدفا X 20. شريط المقياس = 80 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويرد دليل خطوة بخطوة للسماح للمستخدمين من موائع جزيئية المفاعلات الحيوية التي تقترن بالأسفار الفحص المجهري لإجراء تجارب بيوفيلم رواية استخدام بيئات مختلفة القص. سيسمح هذا الأسلوب لتوسيع نطاق التجارب التي تشمل الكائنات الحية الدقيقة الأخرى إلى جانب البكتيريا، مثل الفطريات، والطحالب، والتي تحتوي على التطبيقات الطبية والبيئية41،،من4243. نهج مفصل يصف كيف لثقافة PA01-اجفب وتطعيم لوحة 48-جيدا وقم بإعداد الجهاز موائع جزيئية والبرمجيات وإعداد مجهر فلوري ويثبت تحليل البرامج للحصول على تغطية بيوفيلم، معدل النمو، و الخصائص المورفولوجية مثل خشونة السطح.

Protocol

1-إعداد وسائط الإعلام

  1. تحضير الوسائط الحد الأدنى (مم) مع 0.25% جلوكوز. لجعل ل 1 مم مع الجلوكوز 0.25%، إضافة 200 مل من محلول الملح M9 العقيمة، 2 مل معقمة 1 م MgSO4، 100 ميليلتر العقيمة كاكل م 12، ومل 12.5 العقيمة 20% (w/v) الجلوكوز إلى الماء (dH2س) في وحدة تخزين نهائي للأم 1
  2. نقل الوسائط المطلوبة باستخدام زجاجة معقمة باستخدام تقنيات عقيمة. إعداد المبلغ المطلوب اعتماداً على عدد القنوات المستخدمة. عادة، يتطلب كل قناة 200 ميليلتر فتيلة، 300 ميليلتر للبذر و 1300 ميليلتر للتجربة ح 24.
  3. ضع الزجاجة في حمام حاضنة أو الماء في درجة حرارة التجريبية. ينبغي أن تكون وسائل الإعلام عند درجة حرارة التجربة قبل استخدامها لتجنب فقاعات تشكيل في ميكروتشانيلس.

2-إعداد ثقافة بين عشية وضحاها والتجريبية من PA01-اجفب.

  1. ضع 15 مل وسائط التجريبية إلى قارورة sidearm عقيمة وتلقيح مع المستعمرات واحد أو اثنين من صفيحة أجار السنة اللهب أثناء مع PA01-اجفب. توسيع ثقافة ح 12-16 في جدول حاضنة/شاكر على 37 درجة مئوية و 180-220 لفة في الدقيقة.
  2. قياس القطر الخارجي600 الثقافة بين عشية وضحاها. عندما OD600 أكبر من 0.80، تضعف ثقافة بين عشية وضحاها إلى التطوير التنظيمي النهائي من 0.8 استخدام الطازجة مم. موضع ثقافة تجريبية في حاضنة أو حوض ماء في 37 درجة مئوية حتى اللازمة للبذر القنوات موائع جزيئية. تحقق OD600 مرة أخرى فورا قبل البذر للتأكد من أن أنها لم تتغير كثيرا عن الهدف OD600، 0.8 في هذه الحالة.

3-معدات بدء التشغيل

  1. قم بإعداد محطة النظام وفقا لدليل المستخدم، مشابهة للإعداد في الشكل 1. لتجنب خطأ في اتصال بهذه الوسيلة للبرنامج، قم بتشغيل الصك بالترتيب التالي:
    كمبيوتر محطة عمل
    الوحدة النمطية للأسفار. تأكد من مصراع الأسفار في (الضوء الأزرق بزر مصراع على)
    وحدات تحكم الأجهزة
    نظام تحكم التصوير (انظر الجدول للمواد)
    كاميرا CCD
    محطة التصوير (مجهر)
    ملاحظة: ينبغي تعديل درجة الحرارة لصفيحة ساخنة إلى درجة الحرارة المطلوبة التجريبية.
  2. بدء تشغيل التطبيق التحكم وأدخل لوحة الرقم الموجود على الملصق على جانب اللوحة.
    ملاحظة: بعد بدء تشغيل التطبيق التحكم سيكون هناك إطارين تطبيق منفصل وواحد للبرنامج الذي يتحكم بالمجهر/تصوير البرنامج وواحدة لوحدة التحكم الذي يتحكم بالمضخة وواجهة اللوحة جيدا. ويظهر ذلك في الشكل S1، حيث القائمة "متعدد الأبعاد اقتناء" مفتوح على الأعلى ويتم تعيين "وحدة التحكم" للتشغيل التلقائي أسفل.

4-فتيلة وبذر لوحة موائع جزيئية

ملاحظة: فتيلة والبذر ومرفق البكتيرية والنمو موضحة في الشكل 3.

  1. إزالة لوحة موائع جزيئية 48-جيدا من التعبئة والتغليف مع التأكد من عدم لمس سطح الزجاج في الجزء السفلي من اللوحة. تنظيف الشريحة الزجاجية في الجزء السفلي من اللوحة جيدا مع نسيج عدسة أو قطعة قماش خالية من الوبر، أو مسح لينت منخفضة.
  2. إلى رئيس الوزراء القنوات موائع جزيئية، "الماصة؛" 200 ميليلتر من 37 درجة مئوية ملم في الإخراج جيدا، مع الحرص على تجنب الفقاعات. ضع اللوحة في مرحلة لوحة والقضاء على الواجهة مع الإيثانول، السماح لتجف، قبل الختم عليه على خشبة المسرح لوحة.
  3. في الوضع اليدوي في "وحدة التحكم"، تعيين السائل رطل في 37 درجة مئوية و القص ماكس الساعة 5.00 داين/سم2. انقر فوق آبار الإنتاج لتنشيط تدفق من الإخراج للإدخال، فتيلة القنوات. بعد 5 دقائق فتيلة، توقف تدفق إعداد للبذر. بعناية إزالة اللوحة من المرحلة و "الماصة؛" وسائل الإعلام المتبقية من الإخراج ولكن ليس إزالة أي من وسائل الإعلام من الدائرة الداخلية التي تؤدي إلى قنوات موائع جزيئية.
  4. أن البذور القنوات التجريبية، أولاً "الماصة؛" ميليلتر 300 مم إلى الإدخال متبوعاً جيدا ميليلتر 300 بيبيتينج ثقافة البكتيرية في الإخراج إلى الإخراج جيدا. ضع اللوحة مرة أخرى إلى مرحلة لوحة مع التأكد من مسح الواجهة قبل وضعه على اللوحة.
  5. في "وحدة التحكم"، وتركز على قناة واحدة باستخدام الكاميرا يعيش آر بعد وضع المرحلة لوحة على خشبة المسرح المجهر. بينما الرصد بصريا بالبث المباشر واستئناف تدفق 1.00-2.00 داين/سم2 لحوالي 2-4 ق السماح بدخول قناة تجريبية الخلايا ولكن ليس في القنوات السربنتين. اترك اللوحة على المسرح درجة الحرارة التي تسيطر على ح 1 للسماح لمرفق خلية. أثناء الاحتضان ح 1، يمكن إعداد البرنامج وحدة التحكم والمونتاج للتشغيل التلقائي (الخطوة 5).
    ملاحظة: سوف تختلف مقدار الوقت اللازم للبذر مع وسائط الإعلام، والكائنات الحية، ولذلك فإنه ينبغي أن ترصد عن كثب البث المباشر حتى الأمثل ويستخدم كفترة زمنية عامة. قد تختلف البذور في جميع أنحاء اللوحة التي تتطلب المزيد من الوقت من تدفق التطبيقية لبعض الأعمدة من القنوات لبذر كاملة.
  6. بعد فترة الحجز، بلطف إزالة اللوحة من المرحلة و "الماصة؛" البكتيريا من إخراج أولاً تجنب الإخلال بالقناة. مع تلميح ماصة جديدة، قم بإزالة الوسائط من آبار الإدخال.

figure-protocol-4717
الشكل 3 : نظرة عامة تجريبية فتيلة، والبذر، والحجز PA01-اجفب في قنوات موائع جزيئية. ويرد فتيلة، والبذور، ومرفق. الخطوة الأولى من فتيلة يتطلب وسائط جديدة أدخلت إلى الإخراج. يستتبع البذر تساوي كميات من ثقافة الإعلام والبكتيريا في الإدخال والإخراج الآبار، على التوالي. ينبغي إلا تمر الثقافة الجزء مشاهدة القناة التجريبية (الخط الأحمر) لتجنب انسداد القنوات السربنتين. بعد انتهاء فترة الحضانة، تدفقات وسائط جديدة باستمرار من المدخلات، إلى قاعة العرض وإلى المنفذ. وهذا يبدأ بالمرفقات ونمو بيوفيلم الجرثومي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5-إعداد البرامج

  1. في البرنامج، قم بفتح "اقتناء متعددة الأبعاد" للتحكم في اكتساب صورة مجهر. ضمن القائمة "الرئيسي"، حدد "Timelapse" و "مواقف المرحلة متعددة" "أطوال موجية متعددة" (S1A الشكل).
    1. إعداد إعدادات الحفظ ، إنشاء بسيطة الاسم الأساسي، مع التأكد من أنه يتم التحقق من اسم العلاوة الأساسية إذا كان الملف موجوداً . انقر فوق تحديد دليل لتحديد المجلد الذي سيتم حفظ كافة الملفات. وتشمل التفاصيل الأساسية للتجربة في الوصف.
    2. ضمن علامة التبويب Timelapse ، ضبط المدة التجريبية الوقت 24 ساعة. للتحكم في كيفية غالباً ما يتم الحصول على الصور، وتعيين الفاصل الزمني حتى تكتسب الصور كل 5 دقيقة طوال التجربة. على عدد من النقاط الزمنية يضبط تلقائياً بتعيين معلمات.
    3. تعيين مواقع مرحلة استخدام الكاميرا يعيش آر في المجهر الحقل مشرق، مما يسمح للموضع الصحيح والتركيز. بدءاً بالهدف العاشر 10، والتركيز على وسط القناة، تقع أعلى أو أسفل أرقام الأقنية التي نقشت على اللوحة. قم بالتبديل إلى الهدف X 20، والعثور على مساحة العرض الأمثل والمستوى البؤري داخل القناة. إضافة الموقف إلى القائمة أو استبدال موقف القناة مسبقاً مع الإعدادات الجديدة.
    4. ضمن القائمة الأطوال الموجية ، تعيين عدد الأطوال الموجية إلى 3. بالنسبة لطول الموجه 1 (W1)، حدد كام فيتك 100% مع وقت تعرض 10 مللي ثانية. لتحديد الطول الموجي 2 (W2)، برايتفيلد 50% كام 50% مقارنة مع فترة الحد أدنى من تعرض للسيدة 3 للطول الموجي 3 (W3)، تعيين عامل التصفية أغلقت جميع ذلك أي ضوء يبقى على آخر قناة بين أوقات اكتساب.
  2. عند إعداد "وحدة التحكم"، تحقق للتأكد من أنه تم إيقاف تشغيل الدليل.
    1. في قائمة التشغيل التلقائي تحرير ضمن علامة التبويب إعداد البروتوكول ، تعيين بروتوكول جديد عن 24 ساعة وقت المدة، تتدفق في الاتجاه إلى الأمام بمعدل القص المطلوب. معدل القص متنوعة لدراسة أثر نمو بيوفيلم مع معدل القص. انقر فوق إضافة ، و حفظ باسم البروتوكول.
    2. ضمن علامة التبويب إعداد تسلسل إنشاء تسلسل جديد عن طريق تحديد LB@37degrees كسائل الافتراضي لكافة القنوات. تحت تكرار الخطوة 1، للقنوات 1-12، حدد البروتوكول مع معدل القص المطلوب و تمكين جميع القنوات. لقنوات 13-24، حدد البروتوكول مع معدل القص المطلوب الثاني و تمكين جميع القنوات. حدد تطبيق و حفظ التسلسل.
    3. في قائمة التشغيل التلقائي ، حدد تسلسل تم حفظها لاستخدامها للتشغيل التلقائي.

6-توقيت إعداد تجربة النمو بيوفيلم

  1. "الماصة؛" كحد أقصى ميليلتر 1,300 مم العقيمة إلى إدخال لوحة موائع جزيئية. ضع اللوحة مرة أخرى على خشبة المسرح لوحة والقضاء على الواجهة مع الإيثانول، مما يتيح الإيثانول تجف تماما، قبل إغلاق اللوحة.
  2. وضع اللوحة المرحلة على خشبة المسرح المجهر، وأن تتأكد من أن منشئه و sequence(s) تم إعدادها بشكل صحيح. حدد تاريخ بدء لبدء التشغيل التلقائي اتباعها بسرعة عن طريق النقر فوق الحصول البدء في جمع صورة مجهر.
  3. ضبط التركيز وإخضاع جميع المواقف المرحلة بين ●تجويد الصورة. حدد وقفه ، واستخدام وضع الصورة الحية في الطول الموجي مشرق الحقل، حدد الانتقال إلى لعرض مواقف كل مرحلة. تعيين إعدادات جديدة عن طريق تحديد تعيين الحالية. انقر فوق استئناف قبل اكتساب المجدولة في المرة القادمة.

7-استعراض وتحليل تسلسل الصور بعد التجربة النمو بيوفيلم موقوت

  1. لاستعراض كل قناة بعد 24 ساعة فتح التشغيل التلقائي، في البرنامج، مراجعة البيانات متعددة الأبعاد، الموجودة ضمن أدوات التحليل. انقر فوق حدد ملف قاعدة | حدد الدليل للانتقال إلى المجلد مع تسلسل الصور للتجربة للفائدة. في قائمة مجموعات البيانات في المجلد الذي يظهر، حدد اسم قاعدة البيانات الخاصة بالفائدة.
  2. حالما يتم تحديد البيانات الخاصة بالفائدة، انقر فوق طريقة العرض لمراجعة هذه البيانات. تحديد طول موجه لمراجعة تلك البيانات ضمن إطار الطول الموجي (S2 الشكل).
  3. استعراض تسلسل الصورة لكل قناة بتحديد رقم القناة تحت المرحلة الموقف واستخدام عناصر تحكم الفيديو لتحليل البيانات للوقت 289 نقطة (مع افتراض أن يتم الحصول على صور كل 5 دقائق على مدى زمني 24 ساعة). يحيط علما ببيانات النمو صالحة للاستعمال.
    ملاحظة: في كل قناة، ومراقبة وضع فقاعات الهواء وقباقيب التي سوف تخل بنمو بيوفيلم داخل القناة، التي تؤثر على البيانات. ومع ذلك، إذا كانت هذه تحدث في وقت لاحق في بيانات التشغيل، قبل هذه الظروف يمكن الاطلاع على مفيدة.
  4. وبعد استعراض وتحديد البيانات المطلوبة للتحليل، إنشاء أكوام من الصور لكل قناة. ضمن القائمة ملف ، حدد "المفتوحة الخاصة" | بناء مكدس | بلغ عدد أسماء. في إطار بناء مكدس ، حدد الزر حدد أول صورة ثم حدد الصورة الأولى للمكدس في مجلد الملف؛ حدد الزر حدد الصورة الأخيرة ، ثم حدد الملف المطابق إلى آخر صورة في المكدس. انقر فوق موافق لفتح المكدس مع جميع الصور من القناة في الترتيب الزمني. يمكن حفظ كدسات ضمن القائمة ملف ، حفظ كملفات tiff.
    ملاحظة: لا تقم بإنشاء المكدسات مع الصور الإبهام. هذه الملفات ليست مفيدة جداً، ويمكن حذفها لتوفير مساحة على القرص الثابت. أيضا، يتم حفظ ملفات الصور كما يلي:

    قاعدة NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.

    على سبيل المثال، 07062018_W1FITC 100_s12_t112 للقناة 12، وقت نقطة 112، والصورة في أول بيانات الكاميرا 100% الطول الموجي-فيتك باسم قاعدة "07062018".
  5. وأخيراً، حدد حفظ باسم من القائمة المنسدلة ملف لحفظ التسلسل مكدس tiff. يمكن أيضا مضافين المكدسات وحفظه كفيلم. وتتناول هذه الخطوة 9.
  6. قبل التحديد الكمي لتغطية سطح %، معايرة أبعاد الصورة. ضمن أدوات تحليل، انقر فوق معايرة مسافات. حدد قياس معايرة المناسبة وانقر فوق تطبيق على "كافة الصور المفتوحة".
  7. أن المكدس على الصورة الأولى في التسلسل، فانقر فوق الزر العتبة . استخدام عتبة التلقائي "الكائنات الخفيفة" إلى عتبة لإشارة الفلورسنت (الطول الموجي فيتك) و الحد الأدنى التلقائي "كائنات الظلام" إلى عتبة في الميدان مشرق. ضبط الحد الأدنى للتغطية الذي يمثل تغطية الصورة.
    1. لعتبات الفلورسنت، تستخدم قناة مع الخلايا غير الفلورية بإنشاء أي مجموعة الكشف عن قيمة العتبة الدنيا لاستبعاد الإشارات في القنوات التي تحتوي على هذه غير الفلورية الخلايا لضمان قياس الإشارات والإشارات الخلفية لا نبالغ فيما يتعلق بالأسفار. قد يكون هذا مختلفة من التشغيل لتشغيل حتى أنها فكرة جيدة لاستخدام واحد على الأقل، إذا كان لا أكثر من ذلك، قناة (ق) لعناصر غير الفلورية.
    2. لعتبات الحقل مشرق، إذا لم تشمل كافة الخلايا بتوقيع عتبة البرتقال، قم بضبط قيمة الحد الأقصى أما عن طريق شريط الانزلاق أو استخدام الصورة عتبة (موجود ضمن أدوات التحليل) حيث تكون كافة الخلايا تغطي لكنها استبعدت أي خلفية.
      ملاحظة: حين مثالي سوف تستخدم هذه القيم الحدية لكل الصور داخل كومة وجميع القنوات، قيم العتبة المحددة للصورة/قناة واحدة قد لا يكون مناسباً للقنوات، أو الصور الأخرى ولذلك قد يحتاج المستخدم لضبط نطاق عتبة بشكل دوري. لهذا السبب، أنها لفكرة جيدة لتسجيل الحد الأقصى دائماً وقيم الحد الأدنى المستخدمة ينبغي أن البيانات الحاجة إلى إعادة النظر في وقت لاحق.
  8. لتحديد حجم التغطية، وضمن أدوات التحليل، انقر فوق إظهار إحصائيات المنطقة. تأكد من أن يتم التحقق من استخدام العتبة ، يتم تحديد الصورة بأكملها ، وضمن البيانات التي تم الحصول عليها، تأكد من تحديد الإعدادات/القياسات المطلوبة (منطقة العتبة والمتوسط والانحراف المعياري، ودقيقة، ماكس وعتبة % المنطقة). انقر فوق سجل مفتوح ، وتأكد من تحديد ملف DDE قبل النقر فوق موافق. حدد Microsoft Excel ، ثم انقر فوق موافق. في جدول البيانات الذي سيتم فتح، انقر فوق سجل البيانات تلقائياً بتسجيل قياسات الصورة يتم تحليلها.
  9. ترك فتح جدول البيانات هذا، استخدم نفس الورقة لجمع بيانات تحليل الصورة كل كدسة واحدة. في المكدس، انتقل إلى الصورة الرابعة وعتبة على الإعدادات المثلى. انقر فوق سجل البيانات في الشاشة تظهر إحصاءات المنطقة ويتم تسجيل القيم الموجودة في جدول البيانات. كرر هذه العملية لتحليل الصور كل 15 دقيقة.

8-سائر البرامج النصية مورفولوجيا بما في ذلك تحليل وتغطية سطح قياس استخدام بايثون من "جناح مورفولوجيا بيوفيلم"

  1. تثبيت توزيع 3.6 بيثون يتضمن الوحدات النمطية القياسية العلمية باستخدام توزيع بيثون علمية قياسية مثل أناكوندا، متاح على https://www.anaconda.com/download.
  2. الحصول على "جناح مورفولوجيا بيوفيلم" من GitHub في مستعرض عن طريق الانتقال إلى https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git، ثم حدد استنساخ أو تحميل (الزر الأخضر) وحدد تحميل الرمز البريدي. فك ضغط الملف ونقل المجلدات رمز إلى دليل عمل.
  3. قياس نسبة التغطية ثريشولديد عن طريق نسخ مكدس الصورة إلى المجلد "تغطية". استخدام إطار المحطة طرفية للانتقال إلى هذا المجلد ومن ثم تنفيذ البرنامج النصي باستخدام الأمر

    بيثون bfCoverage.py tiffStackName.tif

    من واجهة سطر الأوامر، حيث tiffStackName.tif هو اسم الملف الذي يحتوي على المكدس tiff الصور. سيتم إنشاء ملف نصي يحتوي على القياسات التغطية في كل نقطة مرة ب اسم tiffStackName.txt وملف رسومات مع مؤامرة للتغطية كما سيتم إنشاء دالة للزمن بالاسم tiffStackName.png.
  4. استخدام نفس الإجراء المحدد في الخطوة 8.3 لقياس الخصائص المورفولوجية الأخرى: بيوفيلم تراكم ومعامل خشونة الانتروبيا التكوينية. استخدام البرنامج النصي bfAcc.py لقياس تراكم والبرنامج النصي roughCoef.py لقياس معامل خشونة والبرنامج النصي TEvsTime.py لقياس الانتروبيا التكوينية.

9-أخرى تطبيقات البرمجيات--جعل التراكبات والأفلام

  1. إذا كان يتم استخدام أطوال موجية متعددة، إنشاء المكدسات تراكب بما في ذلك هذه الأطوال الموجية. فتح كل الرصات للفائدة ومعايرة المسافة كما فعلت في الخطوة 7، 6.
    1. ضمن أدوات التحليل، حدد تراكب الصور. تعيين المصادر كرزمة الفائدة. في المكدس فيتك، انقر فوق دائرة قوس قزح وحدد عامل تصفية اللون الأخضر أن تضاف من أجل تسليط الضوء على هذا الطول الموجي.
    2. استخدام ال لضبط التراكب حيث يكون المكدس فيتك الظاهر في الصور. بعد إجراء كافة التعديلات، قم بتحديد جميع الطائرات لكلا كدسات وانقر فوق تطبيق. حفظ في التراكبات بنفس الطريقة كرزمة الموضحة في الخطوة 7.5 أو كفيلم هو موضح في الخطوة 9، 2.
  2. لحفظ كدسات أو تراكبات كفيلم timelapse، تحت معيار ملم و المكدس، انقر فوق جعل الفيلم. حدد المصدر مكدس أو تراكب المنشود. انقر فوق حفظ وحفظ باسم 1 الفيديو Microsoft مع نوعية بين 70-80.

النتائج

الشكل 4 يوضح منطقة ثريشولديد في المائة على مر الزمن من ح 24 تشغيل في تدفقات القص 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2. بيوفيلم التغطية أو المئة عتبة المساحة السطحية (ج [%]) كان مختلفاً بالنسبة لجميع القص ثلاثة إعدادات. وكانت تغطية بيوفيلم الأسرع في 1.0 داين/سم2 القص، حيث زادت منطقة العتبة من 2-5% إلى 100% بعد 200 دقيقة للنمو ووصلت إلى مرحلة ثابتة بعد دقيقة 400. في 0.5 داين/سم2، تأخر التغطية بيوفيلم وبدأت تزيد على 400 دقيقة التوصل إلى تغطية بنسبة 100% بعد 800 دقيقة. القص أدنى 0.2 داين/سم2 بوضوح زيادة أبطأ في تغطية بيوفيلم، حيث نسبة التغطية بدأت تزيد على 500 دقيقة لكن لم تصل ابدأ إلى خارج منطقة عتبة 65%. وأشارت هذه النتائج إلى القص كان لها تأثير مباشر في تغطية سطح بيوفيلم. ويبدو القص أعلى يكون شرطا أكثر أمثل للنمو بيوفيلم، وربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن وسائط الإعلام توفير البكتيريا مع المزيد من المواد الغذائية بحيث يمكن أن تتكاثر بيوفيلم أسرع.

figure-results-1060
الشكل 4: منطقة عتبة المئة وتراكم بيوفيلم مجموع ومعامل الخشونة، والتكوينية الانتروبيا. عتبة أ) نسبة المجال (ج [%]) على مر الزمن باستخدام 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2 على مدى 24 ساعة فترة زمنية. تم الحصول على البيانات من قناة واحدة لكل شرط الإمالة. ب) مجموع تراكم بيوفيلم (قياس نسبي) كدالة للوقت باستخدام 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2 على مدى 24 ساعة الفترة الزمنية. خطوط سوداء المربعات الصغرى لتناسب نموذج آسيه. تم الحصول على البيانات من قناة واحدة لكل شرط الإمالة. ج) معامل خشونة PA01-اجفب استخدام قيم إجهاد القص من 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2 رصد ما يزيد على 24 h. البيانات تم الحصول من قناة واحدة لكل شرط الإمالة. د) اعتلاج التكوينية PA01-اجفب باستخدام قيم إجهاد القص 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2. تم الحصول على البيانات من قناة واحدة لكل شرط القص (فالقوير-فلين، حاء، سوتليف، أ. ل.، وينتوورث، ماديرا، 2018). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 ب يتسق مع النتائج هو موضح في الشكل 4. وتم قياس تراكم بيوفيلم (N[rel]) استناداً إلى افتراض أن إشارة بروتينات فلورية خضراء في نقطة في صورة تتناسب مع كثافة الخلايا الحية في هذا الموضع. فإنه يوضح أن زيادة تراكم بيوفيلم مجموع القياس النسبي كدالة للوقت باستخدام 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2 على مدى 24 ساعة فترة زمنية، وانخفض معدل النمو من أعلى القص الإجهاد إلى أدنى إجهاد القص. وهناك فترة زمنية واضحة تعطي النمو الأسى التي يمكن من خلالها حساب معدل نمو كمي.

الشكل 4 ج يوضح أن معامل الخشونة (ص) في التدفقات القص 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2. خشونة السطح، كمياً بأن معامل الخشونة، يقيس الفرق في التشكيل الجانبي لسمك الفيلم. التعريف الرسمي

figure-results-3187

حيث Tأنا هو أنا-ال سمك القياس، T سمك متوسط، و N هو عدد قياس سمك30. الإجراء الموضح في هذا التحقيق يقيس سمك المرتبطة بالخلايا الحية. ترتيب شقة من الخلايا سوف تسفر عن معامل خشونة صفر بينما سوف تسفر عن اختلافات كبيرة من سمك من المتوسط معامل خشونة أكبر من واحد. مماثل لتأثير القص على معدل النمو وعتبة نسبة التغطية للفيلم، الأغشية الحيوية عرضت تصاميم مختلفة على مر الزمن. إجمالاً، ص انخفضت على مر الزمن لكل شروط القص مما يشير إلى أن جميع الأسطح وأصبحت أكثر سلاسة. لكن بالمقارنة مع القص أقل من 0.2 داين/سم، الإعدادات القص أعلى من 0.5 و 1.0 داين/سم2 أدى إلى سطح أكثر سلاسة مع مرور الوقت مشيراً إلى أن تدفق قص أسرع أسهم سطح أكثر سلاسة وأكثر توازناً، والقص أعلى من 1.0 داين/سم2 التوصل إلى أدناه 0.2 ص.

يمكن أيضا التعبير عن نعومة أو الانتظام، أو خشونة السطح في الانتروبيا التكوينية (TE). الشركة المصرية للاتصالات خاصية تستخدم في تحليل الصور لقياس درجة العشوائية في صورة ثنائية الأبعاد. يستند إلى الحساب المصفوفة التواجد المشترك مستوى رمادي، يحددها هاراليك et al.، الذي يبحث في ما إذا كانت ترتبط قيم بكسل في موقع واحد مع قيم بكسل في مكان آخر44. درجة عالية من الارتباط سيؤدي إلى الانتروبيا منخفضة. الشكل 4 ويصور د تي في تدفقات القص 0.2 و 0.5 و 1.0 داين/سم2. الشركة المصرية للاتصالات زيادة مع مرور الوقت لجميع شروط القص ولكن الإجهاد القص أعلى في 1.0 داين/سم بلغ أقصى TE (1.0) أقدم من القص وتشدد على انخفاض في 900 دقيقة. وكان القص أقل من 0.2 داين/سم2 TE أدنى (0.8) الوصول إلى الحد الأقصى بعد دقيقة 1,000. بيد إجهاد القص المتوسطة 0.5 داين/سم2 بلغ به الشركة المصرية للاتصالات الحد الأقصى (1.2) بعد ذلك بكثير من ظروف الإجهاد القص عالية أو منخفضة.

قياس معامل خشونة والشركة المصرية للاتصالات ميزات مختلفة. بينما سيكون فيلم شقة معامل خشونة منخفضة ومنخفضة الانتروبيا، فيلما مع تباين كبير في سمك معامل خشونة عالية لكن يمكن أن يكون لا يزال الانتروبيا منخفضة إذا كان الاختلاف جيبية بدلاً من العشوائية. وفي هذه الحالة، ص انخفضت مع زيادة إجهاد القص والوقت بينما اتجاهات الشركة المصرية للاتصالات لا ترتبط بالقص الإجهاد المطبقة على تشكيل بيوفيلم مع مرور الوقت.

figure-results-5681
الرقم S1 : صورة القبض على مراقبة البرامج windows. فتح نافذة البرنامج مع "اكتساب متعدد الأبعاد" القائمة (أعلى). تعيين وحدة التحكم التشغيل التلقائي (أسفل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6154
الرقم S2 صورة التقاط البرامج لاستعراض البيانات. إطار التطبيق بعد تحديد مجموعة البيانات المتعلقة بالاهتمام باستخدام أداة مراجعة بيانات متعددة الأبعاد من القائمة أدوات التحليل . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مناقشة إجراءات تحليل النظام وصورة موائع جزيئية هنا يركز على تنفيذ تجارب بيوفيلم موائع جزيئية لتحديد الخصائص المورفولوجية التي لا تتطلب المعلومات كاملة ثلاثية الأبعاد التي توجد عادة من [كنفوكل] دراسات المجهر. وشملت هذه ميكروكولوني التحتية التغطية (نسبة التغطية)، يقاس بمعامل خشونة، والتكوينية الانتروبيا خشونة السطح. تقدم طريقة لتقدير تراكم الخلية بيوفيلم النسبية الإجمالية أيضا يمكن أن تحسب من معدلات النمو الذي سجل في المرحلة.

وهناك عدة خطوات صغيرة ولكنها هامة ينبغي إبرازها في هذا الأسلوب. مسح الواجهة مع الكحول يساعد على تجنب تلوث بكتيريا الأخرى في الانتقال من التجربة للتجربة ولكن أيضا من بئر في تجربة واحدة. فتيلة والبذر أيضا جداً مهم لأنه يسمح للمستخدم بتحديد القنوات التي يتم السماح لوسائل الإعلام لتدفق من خلال القنوات دون أي اضطرابات من فتيلة أو انسداد. كما ينبغي أن تكون قنوات لا يقلقها (أي أنها ينبغي الدوام الكامل لوسائل الإعلام) بعد فتيلة لزيادة فرص تجربة ناجحة مع لا فقاعات الهواء أو انسداد. يمكن أن تختلف وفقا لنوع البكتيريا خطوة البذر وهكذا ينبغي أن يكون الأمثل لمرفق خلية. على سبيل المثال، إذا الخلايا لا يبدو أن نعلق، التعديلات السطحية وقد تحدث على لوحة موائع جزيئية قبل البذر أو أوقات أطول في إينكوباتيونس قد تكون مطلوبة. من المهم أيضا أن نتأكد من أن المجهر تم إعداده بشكل صحيح للحصول على صورة في التركيز، وينبغي أن ترصد بشكل دوري في جميع أنحاء هذه التجربة لضمان الحصول على صور عالية الجودة. إذا كان التركيز، المجهر يمكن وينبغي تعديلها حسب ما زالت التجربة. خلال فترة اقتناء الصورة، يجب تعيين الطول الموجي الماضي إلى إغلاق جميع تجنبا لتعرض المرشحات والإضاءة لقناة واحدة فقط خلال فترة الانتظار التي تحدث بين امتلاك الصورة. أيضا، تحليل الصور التي تحدد تغطية سطح % صمم في البيت لأنه دليل البرامج المونتاج لم تصف صراحة الإجراء. وعلاوة على ذلك، بغية توسيع نطاق تحليل الصور وتحديد الخصائص الأخرى مثل خشونة السطح، إلخ.، وفتح مصدر التعليمات البرمجية على أساس بيثون45 وضعت في منزل والمشتركة في المستودع gitHub. وهناك أيضا قيود على كمية البيانات التي يمكن تخزين وإدارتها على محرك الأقراص الثابت المحلي، حيث هناك حاجة إلى محرك القرص الثابت الخارجي أو تبادل البيانات على شبكة الإنترنت مثل سيفيرسي46.

المفاعلات الحيوية التقليدية، مثل المفاعل مركز السيطرة على الأمراض، و مفاعل بالتنقيط تدفق34، تتطلب الكثير من وسائل الإعلام، وتوفير عدد أقل من حجم العينة، والطلب على كمية عالية من التعقيم للمعدات. وفي المقابل، مزايا هذا المنهاج إنتاجية أعلى وتشمل القدرة على مراقبة القص، معدلات التدفق، ويشابه الافتراض بأن التجارب في المختبر عن كثب الأوضاع في فيفو . عيوب النظام تتضمن الملحقات متعددة، والبرمجيات التي تتطلب الإعداد الدقيق أنه يجب أن يتم بالترتيب الصحيح للأحداث. وعلاوة على ذلك، الدليل التي يتم توفيرها للمعدات لا يفسر تماما كل خطوة من هذه التجارب، وأوامر البرمجيات، ونتيجة لذلك، تحدث أخطاء كثيرة خلال هذه التجارب، بما في ذلك انسداد القنوات، نقص النمو أو الحجز، أو عدم جودة عالية مجهرية الصور أو الأفلام. الصك نفسه، والمواد الاستهلاكية، مثل لوحات موائع جزيئية، وهي أيضا مكلفة نسبيا مع سعرها أكثر من 200 دولار للوحة الواحدة وليست قابلة لإعادة الاستخدام. وهكذا، بينما الأسلوب الذي يعطي نتائج قوية، الخبرة الفنية اللازمة لاستخدامها مرتفع نسبيا ويتطلب التدريب المتكررة من جانب الخبراء في هذا المجال. ويحاول هذا التقرير حل هذه المشكلة عن طريق توفير دليل للمستخدمين الجدد لهذه المفاعلات الحيوية لدراسة خصائص الأغشية الحيوية.

اكتسب نظام موائع جزيئية، وقادرة على القيام بالتحليل الخلوي، قدرا كبيرا من الاهتمام لمختلف الطرائق العلمية، كما هو الحال في علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة، وأمراض الدم، الأورام وبحوث الخلايا الجذعية. وبشكل أكثر تحديداً، أدى العديد من منشورات تصف المواضيع التي وثيقة الصلة بالتطبيقات الطبية37،47، بما في ذلك الجراثيم الالتصاق الشفوي48، تحديد الآثار المترتبة على التكنولوجيا استضافة بيوسورفاكتانتس الزائفة الزّنجاريّة و المكوّرات العنقودية الذهبية49،50، التفاعلات بين العوامل الممرضة في كولاي51، العقدية التقيد52، والعلاج من التليف الكيسي53. ونظرا لحقيقة أن هذا النظام موائع جزيئية شديد التنوع، فمن المتوقع أنه سيتم توزيع أنظمة أكثر وأكثر في جميع أنحاء العالم.

ينبغي النظر بعناية في بعض الخطوات المحددة في البروتوكول. وسائل الإعلام يمكن أن تضعف إلى 50% مع dH2س للمساعدة في منع الفقاعات وانسداد ولكن لم يكن مطلوباً في هذه الحالة. يجب تحديد قيمة محددة OD600 المستخدمة لبذر استخدام يدير المحاكمة من تجربة النمو لمعرفة ما يعمل بشكل أفضل لمجموعة معينة من الظروف المستخدمة. يمكن أن يؤدي إلى فقاعات في قنوات موائع جزيئية فقاعات في الآبار قبل الختم وينبغي إزالة أي برزت أو امتص بها مع تلميح ماصة. من المهم أن تبقى البكتيريا خارج القنوات السربنتين الصغيرة. بوجود كميات متساوية من وسائل الإعلام في الإدخال والإخراج أثناء عملية البذر، فسيتم التحكم تدفق بسبب الضغط من حجم السائل وبالتالي تدفق فقط بسبب ضغوط النظام المطبق. وينبغي إعداد المسافات المعايرة أثناء التثبيت ممثل الشركة. هذه الإعدادات محددة لكل كاميرا.

وهناك العديد من التحديات التي تحدث عند العثور على عتبة الأكثر تمثيلاً لصورة. تعيين قيم الحد الأقصى يمكن أن يكون صعباً إذا كانت كثافة بكسل المتوسط عبر المناطق الخلفية غير متناسقة تسببها أما تحديد موقف مرحلة التي ليست في المركز للقناة أو من الحطام على اللوحة. إطار قياسي MM، انقر فوق العملية، ومن ثم حدد أداة أساسية وتصحيح التظليل لتصحيح حالات عدم التناسق هذه. ومع ذلك، هذه الأداة عموما فقط مفيداً إذا كان المستخدم قد اتخذت صوراً القنوات قبل البذر التي يمكن استخدامها كمرجع الصور. أو، إذا كان مرجع تظليل الخلفية/الصور غير متوفرة، وسوف يحتاج المستخدم إلى استخدام حكمهم لتعيين قيمة عتبة التي تغطي معظم منطقة الخلية دون بما في ذلك الخلفية للصورة بأكملها. وبدلاً من ذلك، حدد المناطق تمثيلاً لقياس أن استبعاد مناطق عدم تناسق من فوق منطقة مستطيلةأو منطقة القطع الناقصأو المنطقة تتبع تحديد منطقة وحدد المنطقة النشطة بدلاً من كامل صورة في إطار إظهار إحصائيات المنطقة (تحت أدوات التحليل). إذا كان يستخدم منطقة ممثل للعتبة صورة مشرقة الميدانية، ينبغي أن تستخدم نفس المنطقة لقياس الصورة فيتك المقابلة. أنه من المفيد أن تسجل الإحصاءات المكانية محددة (غادر، أعلى، العرض، الارتفاع، و منطقة، و محيط) المرتبطة بتلك المنطقة الممثل حيث سيتم العثور على نفس المنطقة و قياس الصورة فيتك المقابلة.

لمنع تراكم البيانات على محرك الأقراص الثابت الذي سوف يؤدي إلى إبطاء الكمبيوتر، يمكن شراء قرص صلب خارجي لتخزين البيانات. وثمة خيار آخر لتخزين البيانات، وتيسير تبادل البيانات هو منصة المعلوماتية الحيوية سيفيرسي. إنشاء حساب على نظام سيفيرسي بالذهاب إلى http://www.cyverse.org/. بمجرد تسجيل الدخول، شن "البيئة الاكتشاف" ثم حدد "سجل في سيفيرسي". حدد "البيانات"، ثم انتقل إلى كنت المجلد. إذا كان المكدس الصورة على الكمبيوتر المحلي ثم حدد "تحميل"، ثم "تحميل بسيطة من سطح المكتب". العثور على الملف المكدس الصورة وحدد للتحميل. الملف أو مجلد يمكن تقاسمها مع المتعاونين إذا كان لديك حساب في سيفيرسي، ويتم منح الإذن. تتطلب مشاركة المجلد البيانات للجمهور العام تضاف هذه البيانات الوصفية لكل ملف باستخدام سيفيرسي الموافقة على المعايير. هذا الإجراء لن تناقش هنا لأن هذا ليس في نطاق هذا العمل.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل قد أمكن من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (نيجمس) (5P20GM103427)، مكون من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium Chloride, ACSVWRBDH9208-500GPart of the minimal media composition
BioFlux 1000 48 Well Low Shear PlateFluxion Biosciences910-0047
BioFlux 1000Z Microfluidic Imaging SystemFluxion BiosciencesBF 1000Z
Calcium Chloride Dihydride, ACD GradeVWR97061-904Part of the minimal media composition
Dextrose, Anhydrous, ACSVWRBDH9230-500GPart of the minimal media composition
Magnesium Sulfate ACS GradeVWREM-MX0070-1Part of the minimal media composition
Potassium Phosphate Monobasic, ACS GradeVWRBDH9268-500GPart of the minimal media composition
Pseudomonas Aeurginosa GFPATCC15692GFPPseudomonas aeurinosa bacterial strain PA01 with GFP modification used for this study.
Sodium Chloride, ACSVWRBDH9286-500GPart of the minimal media composition
Sodium Phosphate, Monobasic, Anhydrous, Reagent GradeVWR97061-942Part of the minimal media composition

References

  1. Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
  2. Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
  3. Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
  4. Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  5. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  6. Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
  7. Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
  8. Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -. T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1 (2018).
  9. Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
  10. Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
  11. Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
  12. LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
  13. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
  16. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
  17. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
  19. Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
  20. Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
  21. Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
  22. Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299 (2017).
  23. Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
  24. Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
  25. Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
  26. Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
  27. Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
  28. Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
  30. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  31. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  32. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
  33. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  34. Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470 (2010).
  35. Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  36. Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
  37. Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467 (2014).
  38. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  39. Kim, J., Park, H. -. D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  40. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  41. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  42. Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
  43. Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9 (2014).
  44. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
  45. . Biofilm Morphology Suite Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018)
  46. . Cyverse Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018)
  47. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
  48. Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
  49. Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
  50. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  51. Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
  52. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
  53. Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved