تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

Summary

يقدم هنا هو البروتوكول الذي يجمع بين في المختبر العصبية بطانة نظام الثقافة المشتركة والدمج الأيضي للسيالوجيكان مع المجموعات الوظيفية bioorthogonal لتوسيع الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف وتسمية سطحها البروتينات السيالوجية للتصوير أو تحليل الطيف الكتلي لعلامات سطح الخلية.

Abstract

الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs) هي الأساس الخلوي للهياكل المعقدة ووظائف الدماغ. وهي تقع في محاريب متخصصة في الجسم الحي ويمكن عزلها وتوسيعها في المختبر، بمثابة مورد مهم لزراعة الخلايا لإصلاح تلف الدماغ. ومع ذلك، فإن الـ NSPCs غير متجانسة وغير محددة بوضوح على المستوى الجزيئي أو يتم تنقيتها بسبب عدم وجود علامات سطح الخلية المحددة. البروتوكول المقدم، الذي تم الإبلاغ عنه سابقاً، يجمع بين نظام الثقافة المشتركة العصبية البطانة مع طريقة وضع العلامات على الغليكان الأيضي لتحديد سطح sialoglycoproteome من NSPCs الأولية. يسمح نظام الثقافة المشتركة NSPC-endothelial بالتجديد الذاتي وتوسيع المراكز الوطنية للدعم والتغذية الأولية في المختبر،مما يولد عدداً كافياً من الـ NSPCs. المجموعات الوظيفية البيوثوغنالية. من خلال مقارنة sialoglycoproteome من NSPCs التجديد الذاتي توسعت في ثقافة مشتركة بطانة مع الثقافة العصبية المختلفة، ونحن تحديد قائمة من البروتينات الغشاء التي يتم إثراء في NSPCs. وينطوي البروتوكول بالتفصيل على ما يلي: (1) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية وثقافة مختلفة؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (2) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطانة والبطانة الوطنية؛ (3) إنشاء ثقافة مشتركة بين البطان 2) وضع العلامات مع azidosugar لكل O-أسيتيل N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz)؛ و 3) البيوتين الاقتران إلى sialoglycan المعدلة للتصوير بعد تثبيت الثقافة العصبية أو استخراج البروتين من الثقافة العصبية لتحليل الطيف الكتلي. ثم يتم اختيار المرشحين علامة سطح المخصب NSPC عن طريق التحليل المقارن لبيانات قياس الطيف الكتلي من كل من NSPC الموسعة والثقافات العصبية المتمايزة. هذا البروتوكول حساس للغاية لتحديد بروتينات الغشاء ذات الوفرة المنخفضة في مواد البداية، ويمكن تطبيقه على اكتشاف العلامات في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة

Introduction

يتم تعريف الخلايا الجذعية العصبية على أنها مجموعة خلايا متعددة القوى التي يمكن تجديدها ذاتيا للحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية والتفريق في الخلايا العصبية وغليا. وهي أنواع الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي ويمكن أن توفر إمكانات علاجية كبيرة في الطب التجديدي من خلال زرع الخلايا في العقول المريضة والمصابة^1،2. مع تقدم التنمية ، يصبح عدد الخلايا الجذعية العصبية غير^{متجانسة 3،4}، وتنخفض نسبة الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ تدريجيا⁵. بشكل عام، توجد الخلايا الجذعية العصبية الجنينية وغيرها من الخلايا السلف العصبية، وتسمى مجتمعة الجذعية العصبية والخلايا السلف (NSPCs)، في المناطق الإنباتية، والمنطقة البطينية، والمنطقة التحتية في الفئران⁶. في الدماغ الجنيني، تولد الخلايا الجذعية العصبية الخلايا العصبية بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال خلايا السلف المتوسطة (IPCs)، وفي بعض الأنواع من خلال الذرية المنطقة الفرعية الخارجية (oRGs)^7،8. التوقيع الجزيئي المحدد، مورفولوجيا، الموقع في محراب الخلايا الجذعية، وإمكانات التمايز كلها تحدد دور كل نوع فرعي في تكوين الأعضاء في الدماغ والتطبيقات السريرية⁹. ومع ذلك، فإن علامات سطح الخلية المتاحة حاليالا يمكن أن تميز بشكل لا لبس فيه وتنقية أنواع فرعية مختلفة من NSPCs، مما يحد من فهم واستخدام هذه الأنواع الفرعية.

ويحد من تحديد العلامات السطحية الأولية للمراكز الوطنية للدعم في مجال الحماية ثلاث عقبات رئيسية. الأول هو عدد الخلايا المحدودة من NSPCs في الأنسجة، مما يجعل من الصعب إعداد عينات بروتين سطح الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي المشترك. والقيد الثاني هو صعوبة إنتاج أنواع فرعية من الخلايا النقية لتوليد بيانات بروتين الغشاء الخاص بالنوع الفرعي. وأخيرا، فإن التحدي الثالث هو انخفاض نسبة البروتينات السطحية للخلايا في بروتينات الخلايا بأكملها، مما يعوق حساسياتها الكشف عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي.

للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير نهج كيميائي لتخصيب وتحديد البروتينات السطحية للخلايا بشكل انتقائي في NSPCs الأولية عن طريق وضع العلامات الأيضية للبروتينات sialoglycoproteins¹⁰. لتوليد عدد كاف من النقاط الاستراتيجية الوطنية، استفدنا من بروتوكول راسخ لتوسيع والحفاظ على الـ NSPCs الجنينية الأولية في الدول غير المتمايزة في المختبر، من خلال المشاركة في زراعة NSPCs مع خطوط الخلايا البطانية الدماغ الماوس باستخدام دعم نفاذية مصفوفة إدراج(على سبيل المثال، transwell) نظام¹¹. وعلى النقيض من ذلك، فإن NPSCs المستزرعة وحدها دون الخلايا البطانية تولد ذرية مختلفة^11،12. وهكذا، يمكن تحليل عينات البروتين من هذين النظامين الثقافة نسبيا لتحديد البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في NSPCs والخلايا العصبية المتمايزة. كما يتم تعديل معظم البروتينات السطحية الخلية من قبل حمض السياليك¹³، غير طبيعي حمض السياليك السلائف التناظرية N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac₄ManNAz) تم استخدامها لاختطاف المسار الأيضي المتأصلة بحيث الذاتية ، حديثا يتم تسمية sialoglycans توليفها مع مجموعات azido، وتوليد مقبض كيميائي¹⁴. من خلال التفاعلات الحيوية الأزيدو-الألكيين بوساطة، والتي تترافق الكائنات الحية إلى السيالوجيكانات، يمكن تصور البروتينات السطحية للخلايا وإثرائها لتحديد البروتيوميك من خلال فلوروفور أو مصفوفة^14.

هنا، نقوم بتلطيخ تحليل هلام SDS-PAGE للسطح sialoglycoproteome من NSPCs الموسعة في ثقافة مشتركة بطانة وخلايا مختلفة في نظام غير ثقافة مشتركة. نحن أيضا تنقية انتقائية سطح sialoglycoproteome في نظامين الثقافة للمقارنة البروتيومية. بروتوكولنا، مقارنة مع التقليدية المستندة إلى الطرد المركزي خلية سطح البروتوكولات^{تنقية 15،}يزيد من فعالية استخراج عن طريق الحد من إجراءات استخراج البروتين السطحي من خلال اقتران علامة محددة وتقارب تنقيه. وفي الوقت نفسه، فإنه يزيد من نقاء استخراج البروتينات سطح الخلية على أساس فرضية أن sialylation يحدث في الغالب في البروتينات سطح الخلية. على الرغم من أن العوامل البطانية لا يمكن أن تمنع تماما التفريق بين NSPCs الموسعة، فإن الدراسة المقارنة بين الثقافة المشتركة والثقافة المتمايزة توفر طريقة ملائمة لتحديد البروتينات السطحية الغنية بالخلايا الجذعية دون الحاجة إلى تحليل البروتينات من NPCs تنقية من قبل FACS¹⁶. ونحن نعتقد أن هذا النهج يمكن تطبيقه على دراسات البروتينات السطحية في أنظمة أخرى مع التعديلات المناسبة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها) من جامعة Tsinghua وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للIACUC. وقد تم اعتماد مرفق الحيوانات المختبرية في جامعة تسينغهوا من قبل رابطة تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات الدولية). لمراحل الأجنة، تم حساب منتصف اليوم من القابس المهبلي المحدد على أنه يوم جنيني 0.5 (E0.5).

ملاحظة: يتم زراعة جميع الخلايا في حاضنة الخلية في ظل ظروف 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2.

1. إعداد ثقافة البطانة الماوس في إدراج دعم نفاذية

ملاحظة: يتم الحفاظ على خلايا BEND3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

1. إعداد BEND3 خلية متوسطة (BM) عن طريق إضافة 50 مل من FBS و 5 مل من البنسلين-ستربيتوميسين في 500 مل من DMEM ومزيج جيدا.
2. يستنشق الوسط من الطبق ويغسل ثقافة الخلايا BEND3 مع 1 مل من PBS مرة واحدة. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA في الخلايا وحضانة الخلايا لمدة 4 دقائق في 37 درجة مئوية.
3. إضافة 1 مل من BM في الخلايا لتحييد التربسين-EDTA والماصة صعودا وهبوطا بلطف لتفكك الخلايا تماما. نقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي جديد 15 مل وبيليه عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق في 400 × ز.
4. يستنشق supernatant من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا مع 9 مل من BM الطازجة، ثم إضافة 1 مل من تعليق الخلية في إدراج دعم نفاذية واحدة. إضافة آخر 2 مل من BM الطازجة لكل بئر في الغرفة السفلى من المصفوفة. الاستمرار في ثقافة الخلايا ليوم واحد.

2. إعداد الماوس الابتدائية القشرية NSPCs الثقافة

1. إعداد لوحة الثقافة، والباباين الهضم المتوسطة، والقشرية أتباع الثقافة المتوسطة (AM)
   1. طبقة 6-لوحات جيدا مع بولي-L-يسين (PLL) عن طريق إضافة 1 مل من محلول PLL في جيدا في لوحات 6 جيدا. ثم، احتضان لوحات في RT لمدة 30 دقيقة.
   2. نقل الحل PLL في أنبوب مخروطي 15 مل. غسل لوحات 3 مرات مع الماء المقطر مزدوجة. تجفيف الأطباق ووضعها جانبا حتى استخدامها.
   3. إعداد وسط هضم البابين عن طريق إضافة 50 U من البابين، 50 درجة مئوية من L-الجلوتامين، و 50 ميكرولتر من 100 ملغ / مل أسيتيل-L-سيستين في 5 مل من DMEM. اخلطي المتوسط لفترة وجيزة وسخنيه إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط الإنزيم.
   4. إعداد الخلية القشرية التمسك الثقافة المتوسطة (AM): إضافة 500 ميكرولتر من L-الجلوتامين، 500 ميكرولتر من بيروفات الصوديوم، 500 ميكرولتر من 100 ملغ / مل N-أسيتيل-L-سيستين، 500 ميكرولتر من N2، 1 مل من B27، و 5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل bFGF في 50 مل من DMEM. يُمزج المزيج المتوسط جيداً ويُسخّن إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. إعداد الخلايا القشرية الدماغية الأولية والطلاء اللاحق
   1. التضحية بفأر حامل E10.5 موقوتة عن طريق خلع عنق الرحم.
      ملاحظة: في E10.5، تنتشر غالبية الخلايا NSPCs في القشرة الدماغية، مما يؤدي إلى استنساخ كبيرة من ذرية في المختبر.
   2. تعقيم البطن بنسبة 75٪ الإيثانول. استخدام مقص غرامة وملقط مسننة صغيرة لفتح البطن عن طريق قطع الجلد والعضلات الكامنة على طول الجانب الأيمن من الخط الأوسط. إزالة الرحم من تجويف البطن بلطف مع ملقط مسننة وقطع من تجويف البطن مع مقص غرامة.
   3. اغسل الرحم بـ 40 مل من HBSS قبل التبريد في طبق بيتري 10 سم. ثم نقل الرحم إلى طبق بيتري جديد 10 سم وغسله مرة أخرى مع 40 مل من HBSS المبردة مسبقا.
   4. نقل الرحم إلى طبق بيتري جديد 10 سم مع 40 مل من HBSS المبردة مسبقا. إزالة الأجنة من الرحم والغشاء السلوي، ثم قطع رؤوس الأجنة قبالة من جذوع مع microforceps المجوهرات.
   5. اغسل الرؤوس بـ 40 مل من HBSS pre-chills ونقل الرؤوس إلى طبق بيتري جديد 10 سم مع 40 مل من HBSS قبل المبردة. استخدام microforceps المجوهرات لقشر الجلد والغضاريف التي تغطي العقول، ثم قطع القشريات الدماغية قبالة وجمعها في أنبوب مخروطي 15 مل مع HBSS قبل المبردة.
   6. بيليه القشرية عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية و 300 × ز. يستنشق supernatant من الأنبوب، ثم إضافة تنشيط الباباين الهضم المتوسطة و 15 درجة مئوية من 4 ملغ / مل DNase الأول في بيليه الأنسجة.
   7. إعادة تعليق بيليه الأنسجة لفترة وجيزة عن طريق دوامة لطيف. حضانة الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، تخفيف الأنسجة عن طريق دوامة قصيرة كل 10 دقيقة.
      ملاحظة: في نهاية عملية الهضم ، يجب ألا تكون هناك قطع أنسجة مرئية في الأنبوب.
   8. بيليه الخلايا القشرية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية و 450 × ز. يستنشق supernatant من الأنبوب وغسل بيليه الخلية مع DMEM المبردة مسبقا. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      ملاحظة: أثناء الهضم والغسيل، وتوخي الحذر من ماصة الأنسجة وخلية بيليه تقريبا لتجنب الإضرار الخلايا مع قوة قص قوية.
   9. قم بإستقان الـ supernatant من الأنبوب ثم أضف 1.5 مل من HBSS المبردة مسبقًا إلى الأنبوب. فصل بيليه الخلية القشرية في خلايا واحدة مع الأنابيب لطيف. عد رقم الزنزانة بمقياس الهيموكيتومات.
   10. إضافة 2 مل من AM و 2 × 10⁴ الخلايا القشرية في جيدا في لوحات 6 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 3 ساعة للسماح للخلايا نعلق على لوحة.

3. إنشاء العصبية بطانة الثقافة المشتركة وAc₄ManNAz نظام وضع العلامات

1. يوم واحد بعد طلاء BEND3 الخلايا في إدراج، يستنشق بلطف المتوسطة في الغرفة السفلى أولا، ثم إدراج. اغسل يُغلى الإدراج 3 مرات مع DMEM المُسخّن مسبقاً. اغسل السطح الخارجي للإدراج عن طريق الفرّة مع DMEM الدافئة مسبقاً.
2. إضافة 1 مل من AM pre-warmed في إدراج واحد، ثم نقل إدراج في الآبار مع الخلايا القشرية الأولية. احتضان الثقافة المشتركة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 12 ساعة.
3. حل Ac₄ManNAz في DMSO لتحقيق تركيز المخزون من 200 mM. 12 ح بعد إعداد العصبية بطانة الثقافة المشتركة، إضافة 1 درجة مئوية من Ac₄ManNAz الأسهم لكل غرفة أسفل و 0.5 درجة مئوية من المخزون لكل إدراج في الثقافة المشتركة. تُرج الأطباق على الفور وبلطف لخلط المتوسطة جيداً. بالنسبة لخلايا التحكم، أضف وحدة تخزين متساوية من DMSO.
4. زراعة الخلايا لمدة 5 أيام أخرى في 37 درجة مئوية و 5٪ CO_2. إعداد AM مع 10x bFGF كوسيلة إعادة التغذية (RM). خلال هذا الوقت، إضافة 100 درجة مئوية من RM لكل إدراج و 200 درجة مئوية من RM لكل غرفة أسفل لإعادة تغذية الخلايا البطانية والعصبية كل يوم. أثناء ال [رفيد], لا يزوّد [أك]₄[منز] أو [دمسو] داخل الثقافة.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي من البروتينات السيالوجية في NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة

1. إعداد BTTAA-CuSO₄ مجمع 1 30X الأسهم التي تحتوي على 1.5 MM CuSO₄ و 9 M BTTAA في الماء المقطر المزدوج. إعداد جديد البيوتين المترافق العازلة 1 التي تحتوي على 50 ميكرومتر البيوتين الألكيين، 2.5 مليون متر أسكوربات الصوديوم، و 1X BTTAA-CuSO₄ مجمع في PBS.
2. قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. يستنشق وسط الثقافة من الآبار السفلية ويغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع PBS قبل تسخينها.
3. إستنشق الـ(بي بي إس) من الآبار إضافة 1 مل من قبل المبردة 4٪ بارافورماللديهايد PBS الحل في جيدا في الخلايا وإصلاح الخلايا في RT لمدة 10 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقا.
4. يستنشق PBS من الآبار وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت الملتصق بالبيوتين الطازج 1 لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في RT لمدة 10 دقائق.
5. يستنشق العازلة رد الفعل من الآبار. غسل الخلايا 3 مرات مع PBS. إعداد العازلة تلطيخ تحتوي على 1٪ FBS و 1 ميكروغرام / مل اليكسا فلور 647-streptavidin. إضافة 1 مل من وصمة عار العازلة في جيدا في الخلايا وحضانة الخلايا في RT لمدة 30 دقيقة.
6. قم بإستئني المخزن المؤقت التلطيخ من الآبار والخلايا المغسولة 3 مرات مع PBS المبردة مسبقاً. إعداد العازلة حظر تحتوي على 5٪ BSA و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية-100 في PBS. إضافة 1 مل من حظر العازلة في جيدا في الخلايا وحضانة في RT لمدة 10 دقيقة.
7. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للعش والمضادة لبيتا توبولين الثالث معا في العازلة حظر بنسب 1:20 و 1:1000، على التوالي. إزالة المخزن المؤقت حظر من الآبار وإضافة 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسية لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
8. إزالة الحل الأساسي الأجسام المضادة من الآبار. غسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقا. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس IgG1، اليكسا فلور 546 الماعز المضادة للماوس IgG2b، وDAPI معا في حظر العازلة في تخفيف 1:1000. يستنشق PBS من الآبار وإضافة 1 مل حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر في الخلايا. حضانة الخلايا في RT لمدة 2 ساعة.
9. قم بإستئني محلول الأجسام المضادة من الآبار واغسل الخلايا 3 مرات مع PBS المبردة مسبقاً. بعد ذلك، تكون الخلايا جاهزة لالتقاط الصور.

5. تنقية البروتينات Sialoglyco من NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة

1. إعداد BTTAA-CuSO₄ مجمع 2 15X الأسهم التي تحتوي على 1.5 mM CuSO₄ و 3 M M BTTAA في الماء المقطر مزدوجة. إعداد البروتين إعادة تعليق العازلة A تحتوي على 4٪ SDS و 10 MM EDTA في الماء المقطر مزدوجة؛ البروتين إعادة تعليق العازلة B تحتوي على 150 مل كلوريد الفينيل، 50 mM ثلاثي إيثانولامين، و 1٪ بوليأوكسي إيثيلين أوليل الأثير (على سبيل المثال، Brij97) في الماء المقطر مزدوجة مع درجة الحموضة 7.4. قبل الاستخدام، قم بخلط المخزن المؤقت A:buffer B = 1:8 (vol/vol) لإعداد المخزن المؤقت لإعادة تعليق البروتين الكامل. إعداد البروتين غسل العازلة 1 التي تحتوي على 2٪ SDS في PBS. بروتين غسل العازلة 2 التي تحتوي على 8 M اليوريا في 250 mM بيكربونات الأمونيوم (ABC)؛ والبروتين غسل العازلة 3 التي تحتوي على 2.5 M NaCl في PBS.
2. قم بإزالة الإدراجات من لوحات الثقافة المشتركة. يستنشق وسط الثقافة من الآبار السفلية ويغسل الخلايا العصبية مرة واحدة مع PBS المبردة مسبقا.
3. قم بإستئني الـ PBS من الآبار وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA المبرد مسبقًا لكل بئر في الأطباق. احتضان لوحات على الجليد لمدة 5 دقائق. بيليه الحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية و 12،000 × ز.
4. نقل supernatant إلى أنابيب جديدة 1.5 مل. تحديد تركيز البروتين مع مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 1 ملغ / مل.
5. إضافة 100 م ألكيين البيوتين، 2.5 مليون متر أسكوربات الصوديوم، و 1X BTTAA-CuSO₄ مجمع 2 إلى 1 مل من تحلل البروتين وخلط الحل جيدا. احتضان المزيج في RT لمدة 1 ساعة.
6. نقل حل رد الفعل في 20 مل من الميثانول المبردة مسبقا في أنبوب مخروطي 50 مل. يُخلط المزيج جيداً ويُحضن عند -30 درجة مئوية بين عشية وضحاها للتعجيل بالبروتينات.
7. بيليه البروتين يعجل بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية و 4500 × ز. اغسل يبيليه البروتين مرتين مع 20 مل من الميثانول المبردة مسبقا. يستنشق الـ"سوبرناينت" من الأنبوب إعادة تعليق بيليه البروتين مع 4 مل من البروتين إعادة تعليق العازلة ونقل البروتين تعليق في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
8. خذ 50 ميكرولتر من حبات streptavidin وغسلها 3 مرات مع PBS. إضافة الخرز غسلها في إعادة تعليق البروتين. احتضان الحل في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعة على الدوار الرأسي بسرعة دوران 20 دورة في الدقيقة.
9. غسل الخرز بالتتابع مع 6 أنواع من المخازن المؤقتة: البروتين غسل العازلة 1، البروتين غسل العازلة 2، البروتين غسل العازلة 3، 0.5 M ABC، 0.25 M ABC و 0.05 M ABC.
10. بعد الغسيل، إعادة تعليق الخرز مع 20 درجة مئوية من PBS ونقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 20 درجة مئوية من 2X البروتين تحميل العازلة في الخرز وعلاج في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم يجب أن تخضع عينات البروتين إلى SDS-PAGE وملطخة مع Coomassie الأزرق الرائع R-250 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قطع البروتينات في هلام كما هو مبين من قبل Coomassie الأزرق اللامع R-250 لتحليل الطيف الكتلي.

النتائج

الإجراء الكامل للتوسع في المختبر ووضع العلامات الأيضية من NSPCs الجنينية الأولية يستغرق 6 أيام(الشكل 1A). جودة خط الخلية BEND3 وNSPCs الأولية المعزولة حديثا هي المفتاح لتجربة ناجحة. خلايا BEND3 هي مصدر العوامل القابلة للذوبان التي تحفز التجديد الذاتي وانتشار الشركا...

Discussion

وتستخدم عادة علامات السطح لتسمية وتنقية أنواع محددة من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي^17،18. اكتشاف علامات السطح يساهم إلى حد كبير في الطب التجديدي وأبحاث الخلايا الجذعية من خلال توفير الأدوات الجزيئية لإثراء انتقائي لسكان الخلايا الجذعية من الأنسجة العا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378