シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

要約

ここでは、インビトロ神経内皮共培養システムと、一次神経幹および前駆細胞を拡張し、その表面に標識するバイオオルトホグナル機能基を持つシアログリカンの代謝組み込みを組み合わせたプロトコルです。細胞表面マーカーのイメージングまたは質量分析分析のためのサイアログリコタンパク質。

要約

神経幹および前駆細胞(NSPC)は、脳の複雑な構造と機能の細胞基盤である。それらは生体内の専門のニッチに位置し、インビトロで単離および拡大することができ、脳損傷を修復するための細胞移植のための重要なリソースとして機能する。しかし、NSPCは不均一であり、分子レベルで明確に定義されていないか、特定の細胞表面マーカーの欠如のために精製される。以前に報告されたプロトコルは、神経内皮共培養システムと代謝グリカン標識法を組み合わせて、一次NSPCの表面シアログリコプロテオームを同定する。NSPC-内皮共培養システムは、インビトロでの一次NSPCの自己更新と拡張を可能にし、十分な数のNSPCを生成する。バイオオルトオショナル機能群。神経培養を分化する内皮共培養で拡張された自己更新型NCSPCのシアログリーコプロテオームを比較することにより、NSPCに富む膜タンパク質のリストを同定する。詳細には、プロトコルが含まれます:1)NSPC-内皮共培養およびNSPC分化培養のセットアップ;2)O-アセチル酸当たりのアジド糖を標識するN-アジドアセチルマンノサミン(Ac₄ManNAz);そして3)ビオチン結合は、質量分析のための神経培養または神経培養からのタンパク質抽出の固定後のイメージングのための改変シアログリカンに対する。次いで、NSPC富化表面マーカー候補は、拡大されたNSPCと分化された神経培養の両方から質量分析データの比較分析によって選択される。このプロトコルは、出発物質中の低い豊富な膜タンパク質を同定するために非常に敏感であり、適切な修飾を有する他のシステムにおけるマーカー発見に適用することができる

概要

神経幹細胞は、幹細胞プールを維持し、ニューロンとグリアに分化するために自己更新することができる多能性細胞集団として定義されています。それらは神経系の主要な細胞型であり、病気および傷ついた脳への細胞移植を通じて再生医療に大きな治療の可能性を提供^{するかもしれない1、2。}発達が進むにつれて、神経幹細胞集団は異^種3、4となり、脳内の神経幹細胞の割合は徐々に5に^{減少する。}一般的に言えば、胚性神経幹細胞および他の神経前駆細胞は、総称して神経幹および前駆細胞(NSPC)と呼ばれ、^マウス6の胚ゾーン、心室ゾーン、および心室下ゾーンに位置する。胚性脳では、神経幹細胞は中間前駆細胞(IPC)を介して直接的または間接的にニューロンを生成し、一部の種では外室ゾーン前駆体(oRGs)7、8を介して生成する。特定の分子シグネチャ、形態、幹細胞ニッチにおける位置、および分化電位はすべて、脳器形成および臨床応用における各サブタイプの役割を決定^する9。ただし、現在利用可能なセル サーフェス マーカーは、異なるサブタイプの NSPC を明確に区別および浄化することはできず、これらのサブタイプの理解と使用率を制限します。

プライマリ NSPC サーフェス マーカーの識別は、3 つの主要なハードルによって制限されます。1つ目は組織内のNCSPCの細胞数が限られているため、一般的な質量分析分析用の細胞表面タンパク質サンプルの調製が困難です。第2の制限は、サブタイプ特異的な膜タンパク質データを生成するための純粋な細胞サブタイプを生成する難しさです。最後に、第3の課題は、全細胞タンパク質中の細胞表面タンパク質の低比率であり、質量分析による検出感度を阻害します。

これらの問題を克服するために、シアロジリコタンパク^質10を代謝的に標識することにより、一次NSPCにおける細胞表面タンパク質を選択的に濃縮し同定する化学タンパク質アプローチを開発した。十分な数のNSPCを生成するために、我々は、透過性支持体を使用してマウス脳内皮細胞株とNSPCを共培養することにより、インビトロの未分化状態における原発性胚性NSPCを拡張および維持するために確立されたプロトコルを利用した。マトリックスインサート(例えば、トランスウェル)^{システム11.}対照的に、NPSCは内皮細胞を持たずに単独で培養し、分化した^{子孫11、12}を生成する。したがって、これら2つの培養システムからのタンパク質サンプルを比較分析して、NCPCと分化ニューロンで分別的に発現するタンパク質を同定することができる。ほとんどの細胞表面タンパク質は、シアル^酸13によって修飾されているように、非天然シアル酸前駆体アナログN-アジドアセチルマンノサミン-四面体化(Ac₄ManNAz)は、内因性、新たに内因性を持つ固有の代謝経路をハイジャックするために使用された合成されたシアログリカンは、アジド基で標識され、化学^{ハンドル14}を生成する。シオチンをシアロジカンに結合させるアジドアルキン媒介性バイオオルトゴン反応を通じて、細胞表面タンパク質は、ストレプトアビジン結合フッ素または^{マトリックス14}を介してプロテオミクス同定のために可視化および濃縮することができる。

ここでは、非共培養系における内皮共培養および分化細胞において拡大したNCから表面シアログリコプロテオームのSDS-PAGEゲル解析の染色を行う。我々はまた、プロテオミック比較のための2つの培養系における表面シアロジコプロテオームを選択的に精製する。当社のプロトコルは、従来の遠心分離ベースの細胞表面浄化^{プロトコル15}と比較して、特定のタグ結合と親和性を介して表面タンパク質抽出手順を減らすことによって抽出の有効性を高めます。浄化。一方、シアルリル化は主に細胞表面タンパク質で起こることを前提に、細胞表面タンパク質の抽出純度を高めます。内皮因子は拡大されたNSPCの分化を完全に妨げることはできませんが、共培養と分化培養との比較研究は、幹細胞を含有する表面タンパク質を必要とせずに特定する便利な方法を提供します。FACS¹⁶によって精製されたNPCからのタンパク質を分析する。このアプローチは、適切な改変を伴う他のシステムにおける表面タンパク質の研究に応用できると考えています。

プロトコル

この研究で使用されるすべての動物プロトコルは、清華大学のIACUC(機関動物ケアおよび使用委員会)によって承認され、IACUCのガイドラインに従って行われました。清華大学の実験動物施設は、AAALAC(ラボアニマルケアインターナショナルの評価と認定協会)によって認定されています。胚のステージングについて、同定された膣プラグの昼間は、胚日0.5(E0.5)として計算した。

注:すべての細胞は、37°Cおよび5%CO2の条件下で細胞インキュベーターで培養される。

1. 透過性支持インサートにおけるマウス内皮培養の調製

注:BEND3セルは、メーカーの指示に従って維持されます。

1. DMEMの500 mLに50mLのFBSと5mLのペニシリン連鎖マイシンを加えてBEND3細胞培地(BM)を調製し、よく混ぜます。
2. 皿から培地を吸引し、1mLのPBSでBEND3細胞培養物を1回洗浄する。0.25%トリプシン-EDTAの1 mLを細胞に加え、37°Cで4分間細胞をインキュベートします。
3. トリプシン-EDTAとピペットを上下に穏やかに中和し、細胞を完全に解離するために細胞にBMの1 mLを追加します。セル懸濁液を室温(RT)で遠心分離により新しい15 mL円錐管とペレットに400 x gで5分間移します。
4. チューブから上清を吸引し、新鮮なBMの9 mLで細胞を再懸濁し、その後、1つの透過性支持インサートに細胞懸濁液の1 mLを追加します。マトリックスの底室でよく新鮮なBMの別の2 mLを追加します。1日細胞を培養し続けます。

2. マウス原発皮質NSPC培養の準備

1. 培養プレート、パパイン消化培地、皮質付着培地(AM)の調製
   1. 6ウェルプレートに1mLのPLL溶液を加えてポリLリジン(PLL)で6ウェルプレートをコーティングします。その後、RTでプレートを30分間インキュベートします。
   2. PLL溶液を15 mL円錐管に移します。二重蒸留水でプレートを3回洗います。プレートをエアドライし、使用するまで脇に置いてください。
   3. パパイン消化培地を50U、L-グルタミンの50μL、100mg/mLアセチル-L-システインの50μLをDMEMの5mLに加えて調製する。培地を短時間混ぜ、酵素活性化のために30分間37°Cに温める。
   4. 皮質細胞付着培地(AM):L-グルタミンの500μL、ピルビン酸ナトリウムの500μL、100mg/mLの500μL、N2の500μL、B27の1mL、および100μg/mMMMMMの5μLを加える。培地をよく混ぜ、使用前に37°Cに温める。
2. 原発性脳皮質細胞の調製とその後のめっき
   1. 子宮頸部脱臼によるE10.5タイミング妊娠中マウスを犠牲にする。
      注:E10.5では、細胞の大半が大脳皮質のNCを増殖させ、インビトロで子孫の大きなクローンを生み出している。
   2. 腹部を75%エタノールで殺菌する。細かいはさみとマイクロサーチ鉗子を使用して、中間線の右側に沿って皮膚と下の筋肉を切断することによって腹部を開きます。子宮を皮切り鉗子でそっと腹腔から取り出し、細かいはさみで腹腔から切り取ります。
   3. 10cmペトリ皿で40mLの予冷HBSSで子宮を洗います。その後、子宮を新しい10cmペトリ皿に移し、40mLの予め冷やされたHBSSで再び洗います。
   4. 子宮を40 mLの予冷化されたHBSSの新しい10 cmペトリ皿に移す。子宮と健膜から胚を取り出し、その後、宝石のマイクロ鉗子で幹から胚の頭部を切り取ります。
   5. あらかじめ冷やされたHBSSの40 mLで頭部を洗い、予め冷やされたHBSSの40 mLの新しい10 cmペトリ皿に頭部を移す。ジュエリーマイクロフォースを使用して、脳を覆う皮膚や軟骨を剥離し、脳皮質を切り取り、予め冷やされたHBSSで15 mL円錐形のチューブに集めます。
   6. 4 °C および 300 x gで 3 分間遠心分離によるコルチクスをペレットします。チューブから上清を吸引し、次いで活性パパイン消化培地及び15μLの4mg/mL DNase Iを組織ペレットに添加する。
   7. 穏やかな渦によって組織ペレットを短時間再中断する。37 °Cで30分間組織をインキュベートします。この間、10分ごとに短い渦で組織を緩める。
      注:消化の終わりに、チューブ内に目に見える組織片があってはならない。
   8. 4 °C および 450 x gで 10 分間遠心分離によって皮質細胞をペレットします。チューブから上清を吸引し、予め冷やされたDMEMで細胞ペレットを洗浄します。この手順を 1 回繰り返します。
      注:消化と洗浄の間、強いせん断力で細胞を損傷しないように、組織と細胞ペレットを大まかにピペットしないように注意してください。
   9. チューブから上清を吸引し、チューブに予め冷やされたHBSSの1.5 mLを追加します。皮質細胞ペレットを穏やかなピペッティングで単一細胞に解離します。血球計でセル番号を数えます。
   10. 6ウェルプレートにAMの2 mLとウェルあたり2 x 10⁴皮質細胞を追加します。37°Cと5%CO₂でプレートを3時間インキュベートし、細胞をプレートに付着させます。

3. 神経内皮共培養_とAc4ManNAzラベリングシステムの設定

1. インサートにBEND3細胞をめっきした1日後に、まず底室内の培地を静かに吸引し、次に挿入する。あらかじめ温めたDMEMでインサートのエンフェイスを3回洗います。予め温めたDMEMで洗い流して、インサートの外面を洗い流します。
2. 予め温められたAMの1 mLを1つの挿入物に加え、一次皮質細胞と井戸に挿入物を移す。12時間37°Cと5%CO2で共培養をインキュベートします。
3. 200 mMのストック濃度を達成するためにDMSOでAc₄ManNAzを溶解します。神経内皮共培養を設定した後12時間、底室_あたりAc4ManNAzストックの1μLと、インサート当たり0.5μLのストックを共培養に加える。すぐにプレートを振り、穏やかに媒体をよく混ぜます。コントロール セルの場合は、DMSO の同じボリュームを追加します。
4. 細胞を37°Cおよび5%CO2でさらに5日間培_養する。10x bFGF を再給餌媒体(RM)として AM を準備します。この間、1日おきに内皮および神経細胞を再供給するために、インサートあたり100 μLのRMと底室あたり200 μLのRMを加えます。再供給中は、Ac₄ManNAz または DMSO をカルチャに供給しないでください。

4. 拡張原発性NSPCおよび分化ニューロンにおけるシアログリコタンパク質の免疫蛍光染色

1. BTTAA-CuSO_4×1 30xストック1.5mM CuSO₄と9mM BTTAAを二重蒸留水で調製します。PBSに50μMビオチンアルキン、2.5mMのアスコルビン酸ナトリウム、および1x BTTAA-CuSO₄複合体を含む新鮮なビオチン結合バッファー1を調製します。
2. 共培養プレートからインサートを取り外します。培養培地を底部ウェルから吸引し、あらかじめ温めたPBSで神経細胞を一度洗います。
3. 井戸からPBSを吸引する。細胞に十分に1分の予め冷やされた4%パラホルムアルデヒドPBS溶液の1 mLを加え、RTで細胞を10分間固定する。その後、予め冷やしたPBSで細胞を3回洗浄する。
4. ウェルからPBSを吸引し、細胞にウェルあたり1 mLの新たに調製されたビオチン結合バッファー1を加えます。RTで細胞を10分間インキュベートします。
5. 井戸から反応バッファーを吸引する。細胞をPBSで3回洗います。1%FBSおよび1 μg/mLアレクサフルオール647-ストレプトアビジンを含む染色バッファーを調製する。細胞にウェルあたり1 mLの染色バッファーを追加し、RTで細胞を30分間インキュベートします。
6. ウェルから染色バッファーを吸引し、予め冷やしたPBSで3回洗浄した細胞。PBSに5%BSAおよび0.3%の非イオン性洗剤-100を含む遮断バッファーを調製する。細胞にウェルあたり1mLのブロッキングバッファーを追加し、RTで10分間インキュベートします。
7. 抗ネスチンと抗β-チューブリンIII抗体をそれぞれ1:20および1:1,000の比率でブロッキングバッファーに希釈することにより、一次抗体溶液を調製する。ウェルからブロッキングバッファーを取り出し、ウェルあたり1mLの一次抗体溶液を細胞に加えます。細胞を一晩4°Cでインキュベートする。
8. 一次抗体溶液をウェルから取り出します。細胞を予冷やしたPBSで3回洗います。Alexa Fluor 488 ヤギの抗マウス IgG1、Alexa Fluor 546 ヤギの抗マウス IgG2b、および DAPI を 1:1,000 の希釈でブロッキング バッファーに一緒に希釈して二次抗体溶液を準備します。ウェルからPBSを吸引し、ウェル当たり1mLの二次抗体溶液を細胞に加えます。RTで細胞を2時間インキュベートします。
9. 抗体溶液をウェルから吸引し、予め冷やしたPBSで細胞を3回洗浄する。その後、セルはイメージキャプチャの準備ができています。

5. 拡張原発性NSPCおよび分化ニューロンからのシアログリコタンパク質の精製

1. 1.5 mM CuSO₄と3 mM BTTAAを含むBTTAA-CuSO₄複合体2 15xストックを二重蒸留水で準備します。タンパク質再懸濁バッファーAを二重蒸留水中に4%SDSおよび10mM EDTAを含有する。pH 7.4を有する二重蒸留水中の150mM NaCl、50mMトリエタノールアミン、および1%ポリオキシエチレンオレルエーテル(例えば、Brij97)を含有するタンパク質再懸濁バッファーB。使用前に、バッファーA:バッファーB=1:8(vol/vol)を混合して、全タンパク質再懸濁バッファーを調出します。PBSに2%SDSを含むタンパク質洗浄バッファー1を調剤する。重炭酸アンモニウム(ABC)に8M尿素を含有するタンパク質洗浄バッファー2;PBSに2.5M NaClを含有するタンパク質洗浄バッファー3と。
2. 共培養プレートからインサートを取り外します。培養剤を底部ウェルから吸引し、あらかじめ冷やされたPBSで神経細胞を一度洗います。
3. 井戸からPBSを吸引し、プレートにウェルあたり200 μLの予め冷やされたRIPAバッファーを追加します。氷の上のプレートを5分間インキュベートし、タンパク質のライシスを1.5 mLチューブに集えます。4 °C および 12,000 x gで 10 分間遠心分離による細胞破片をペレットします。
4. 上清を新しい1.5 mLチューブに移します。製造元の指示に従って BCA キットでタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度を 1 mg/mL に調整します。
5. 100 μM アルキンビオチン、2.5 mMのアスコルビン酸ナトリウム、および1x BTTAA-CuSO₄複合体2〜1mLのタンパク質溶解を加え、溶液をよく混合します。RTでミックスを1時間インキュベートします。
6. 反応溶液を50mL円錐管に予め冷やしたメタノールの20mLに移す。よく混ぜ、一晩-30°Cでインキュベートしてタンパク質を沈殿させる。
7. ペレットタンパク質は、4 °Cおよび4,500 x gで15分間遠心分離によって沈殿する。タンパク質ペレットを20mLの予め冷やしたメタノールで2回洗います。チューブから上清を吸引します。タンパク質再懸濁バッファーの4 mLでタンパク質ペレットを再懸濁し、新しい15 mL円錐管にタンパク質再懸濁液を移します。
8. 50 μLのストレプトアビジンビーズを取り、PBSで3回洗浄します。洗浄したビーズをタンパク質の再懸濁液に加えます。20 rpmの回転速度で垂直回転子の上で3時間4°Cで溶液をインキュベートします。
9. タンパク質洗浄バッファー1、タンパク質洗浄バッファー2、タンパク質洗浄バッファー3、0.5M ABC、0.25 M ABC、0.05 M ABCの6種類のバッファーでビーズを順番に洗浄します。
10. 洗浄後、20 μLのPBSでビーズを再中断し、ビーズを新しい1.5 mLチューブに移します。ビーズに2xタンパク質負荷バッファーの20 μLを追加し、95°Cで10分間処理します。タンパク質サンプルは、SDS-PAGEに従い、製造元の指示に従ってクーマッシーブリリアントブルーR-250で染色する必要があります。質量分析のためのクーマッシーブリリアントブルーR-250によって示されているようにゲル中のタンパク質をカットします。

結果

一次胚性NSPCのインビトロ拡張および代謝標識の全手順には6日かかります(図1A)。BEND3セルラインと新たに分離された一次NSPCの品質は、実験を成功させる鍵となります。BEND3細胞は、NSPCの自己再生および増殖を刺激する可溶性因子の源である。BEND3細胞に汚染がないことを確認し、神経細胞と共培養する前に細胞死を最小限に抑えて積極的に分裂?...

ディスカッション

表面マーカーは、一般的にインビトロおよびインビ^ボ17、18で特定の細胞タイプにラベルを付^け、精製するために使用されます。表面マーカーの発見は、正常または病理学的組織や培養皿から幹細胞集団を選択的に濃縮する分子ツールを提供することにより、再生医療や幹細胞研究に大きく貢献し、精製細胞を提供します。臨床使用または生物学的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1,000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378