Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo che combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale in vitro e l'incorporazione metabolica di sialoglycan con gruppi funzionali bioortogonali per espandere le cellule staminali primarie e progenitrici ed etichettare la loro superficie sialoglycoproteins per l'imaging o l'analisi della spettrometria di massa dei marcatori di superficie cellulare.

Abstract

Le cellule staminali neurali e progenitrici (NPG) sono la base cellulare per le strutture complesse e le funzioni del cervello. Si trovano in nicchie specializzate in vivo e possono essere isolati ed espansi in vitro,fungendo da risorsa importante per il trapianto di cellule per riparare i danni cerebrali. Tuttavia, gli NSPC sono eterogenei e non chiaramente definiti a livello molecolare o purificati a causa della mancanza di specifici marcatori di superficie cellulare. Il protocollo presentato, precedentemente riportato, combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale con un metodo di etichettatura glicana metabolica per identificare il sialoglycoproteooma superficiale dei NSPC primari. Il sistema di cocoltura nPC-endoteliale consente l'auto-rinnovamento e l'espansione dei NSPC primari in vitro,generando un numero sufficiente di NSPC. gruppi funzionali bioortogonali. Confrontando il sialoglybioteome da NPG auto-rinnovamento espanso in una co-coltura endoteliale con coltura neurale differenziante, identifichiamo un elenco di proteine di membrana che sono arricchite in NPC. Nel dettaglio, il protocollo prevede: 1) l'impostazione di una cocultura NSPC-endoteliale e la cultura differenziante NSPC; 2) etichettatura con azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); e 3) coniugazione di biotina a sialoglycan modificato per l'imaging dopo la fissazione della coltura neurale o l'estrazione di proteine dalla coltura neurale per l'analisi della spettrometria di massa. Quindi, i candidati marcatori di superficie arricchiti nsPC vengono selezionati mediante analisi comparativa dei dati della spettrometria di massa provenienti sia dal NSPC espanso che dalle colture neurali differenziate. Questo protocollo è altamente sensibile per identificare le proteine della membrana di scarsa abbondanza nei materiali di partenza e può essere applicato alla scoperta di marcatori in altri sistemi con modifiche appropriate

Introduzione

Le cellule staminali neurali sono definite come una popolazione cellulare multipotente che può auto-rinnovarsi per mantenere una piscina di cellule staminali e differenziarsi in neuroni e glia. Sono i principali tipi di cellule nel sistema nervoso e possono offrire un grande potenziale terapeutico nella medicina rigenerativa attraverso il trapianto di cellule in cervelli malati e feriti^1,2. Come lo sviluppo procede, la popolazione di cellule staminali neurali diventa eterogenea^3,4, e la proporzione di cellule staminali neurali nel cervello diminuisce gradualmente⁵. In generale, le cellule staminali neurali embrionali e altre cellule progenitrici neurali, collettivamente chiamate cellule staminali neurali e progenitrici (NPG), si trovano nelle zone germinali, nella zona ventricolare e nella zona subventricolare nei topi⁶. Nel cervello embrionale, le cellule staminali neurali generano neuroni direttamente o indirettamente attraverso cellule progenitrici intermedie (IPC), e in alcune specie attraverso la zona subventricolare esterna progenitori (oRG)^7,8. La firma molecolare specifica, la morfologia, la posizione nella nicchia delle cellule staminali e il potenziale di differenziazione determinano il ruolo di ciascun sottotipo nell'organogenesi cerebrale e nelle applicazioni cliniche⁹. Tuttavia, i marcatori di superficie cellulare attualmente disponibili non possono inequivocabilmente discriminare e purificare diversi sottotipi di NSPC, limitando la comprensione e l'utilizzo di questi sottotipi.

L'identificazione dei marcatori di superficie primari dei NSPC è limitata da tre ostacoli principali. Il primo è il numero limitato di nSPC nel tessuto, rendendo difficile preparare campioni di proteine della superficie cellulare per l'analisi comune della spettrometria di massa. La seconda limitazione è la difficoltà di produrre sottotipi di cellule pure per la generazione di dati proteici di membrana specifici del sottotipo. Infine, la terza sfida è il basso rapporto delle proteine della superficie cellulare nelle proteine intere cellule, che ostacola la loro sensibilità di rilevamento mediante l'analisi della spettrometria di massa.

Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un approccio chemiopromico per arricchire e identificare selettivamente le proteine della superficie cellulare nelle NSPC primarie etichettando metabolicamente le sialoglycoproteine¹⁰. Per generare un numero sufficiente di NSPC, abbiamo approfittato di un protocollo stabilito per espandere e mantenere gli NSPC embrionali primari in stati indifferenziati in vitro, co-culcolando gli NSPC con linee cellulari endoteliali del cervello del topo utilizzando un supporto permeabile matrice di inserimento (ad esempio, transwell) sistema¹¹. Al contrario, i PNG coltivati da soli senza cellule endoteliali generano progenie differenziata^11,12. Pertanto, i campioni di proteine di questi due sistemi di coltura possono essere analizzati comparativamente per identificare le proteine che sono espresse in modo differenziale negli NPC e nei neuroni differenziati. Poiché la maggior parte delle proteine della superficie cellulare sono modificate dall'acido silico¹³, precursore acido silico innaturale analogico N-azidoacetylmannosamine-tetraacilato (Ac₄ManNAz) è stato utilizzato per dirottare la via metabolica intrinseca in modo che endogeno, di recente i sialoglycan sitolizzati sono etichettati con gruppi di azido, generando una maniglia chimica¹⁴. Attraverso reazioni bioortogonali mediate azido-alkyne, che coniugano biotina ai sialoglycan, le proteine della superficie cellulare possono essere visualizzate e arricchite per l'identificazione proteomica attraverso un fluoroforo o una matrice accoppiata astampata da streptavidino^{o matrice 14}.

Qui, eseguiamo la colorazione dell'analisi del gel SDS-PAGE della superficie sialoglycoproteome da NSPC espansa in una co-coltura endoteliale e differenziando le cellule in un sistema non co-culturale. Purifichiamo anche selettivamente il sialoglycoproteome superficiale nei due sistemi di coltura per il confronto proteomico. Il nostro protocollo, rispetto ai tradizionali protocolli di purificazione della superficie cellulare basati sulla centrismola¹⁵, aumenta l'efficacia dell'estrazione delle proteine superficiali attraverso specifiche coniugazioni e affinità di tag Purificazione. Nel frattempo, aumenta la purezza di estrazione delle proteine della superficie cellulare sulla base della premessa che la verifica avviene principalmente alle proteine della superficie cellulare. Sebbene i fattori endoteliali non possano bloccare completamente la differenziazione degli NSPC espansi, lo studio comparativo tra una co-coltura e una cultura differenziata fornisce un metodo conveniente per individuare le proteine superficiali arricchite con cellule staminali senza la necessità di analizzare le proteine dai PNG purificate dal FACS¹⁶. Riteniamo che questo approccio possa essere applicato agli studi sulle proteine di superficie in altri sistemi con le modifiche appropriate.

Protocollo

Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dall'IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università di Tsinghua ed eseguiti in conformità con le linee guida dell'IACUC. La struttura animale di laboratorio presso l'Università di Tsinghua è stata accreditata dall'AAALAC (Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International). Per la messa in scena degli embrioni, la metà del giorno del tappo vaginale identificato è stata calcolata come giorno embrionale 0,5 (E0.5).

NOT: Tutte le cellule sono coltivate nell'incubatrice cellulare in condizioni di 37 e 5% di CO₂.

1. Preparazione della cultura endoteliale del topo in inserti di supporto permeabile

NOT: Le celle BEND3 sono mantenute secondo le istruzioni del produttore.

1. Preparare il supporto cellulare BEND3 (BM) aggiungendo 50 mL di FBS e 5 mL di penicillina-streptomicina in 500 mL di DMEM e mescolare bene.
2. Aspirare il mezzo dal piatto e lavare la coltura delle cellule BEND3 con 1 mL di PBS una volta. Aggiungere 1 mL di 0,25% Trypsin-EDTA nelle cellule e incubare le cellule per 4 min a 37 gradi centigradi.
3. Aggiungere 1 mL di BM nelle celle per neutralizzare Trypsin-EDTA e pipetta su e giù delicatamente per dissociare completamente le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo conico da 15 mL e pellet per centrifugazione a temperatura ambiente (RT) per 5 min a 400 x g.
4. Aspirare il supernatante dal tubo e risospendere le cellule con 9 mL di BM fresco, quindi aggiungere 1 mL di sospensione cellulare in un inserto supporto permeabile. Aggiungere altri 2 mL di BM fresco per bene nella camera inferiore della matrice. Continuare a coltura le cellule per un giorno.

2. Preparazione della cultura del corticale del mouse NSPC

1. Preparazione del piatto di coltura, mezzo di digestione della papaina, e mezzo di coltura corticale aderente (AM)
   1. Cappotto 6 pozzetti con poli-L-lysine (PLL) aggiungendo 1 mL di soluzione PLL per bene in piastre a 6 pozzetti. Quindi, incubare le piastre a RT per 30 min.
   2. Trasferire la soluzione PLL in un tubo conico da 15 mL. Lavare le piastre 3 volte con acqua doppia distillata. Asciugare le piastre e metterle da parte fino all'uso.
   3. Preparare il mezzo di digestione papaina sommando 50 U di papaina, 50 -L di L-glutamine e 50 -L di 100 mg/mL di acetil-L-cisteina in 5 mL di DMEM. Mescolare brevemente il mezzo e riscaldarlo a 37 gradi centigradi per 30 min per l'attivazione degli enzimi.
   4. Preparare il mezzo di coltura aderente alle cellule corticali (AM): aggiungere 500 500 l di pironevatodi di sodio, 500 l l di 100 mg/mL N-acetyl-L-Cysteine, 500 l di N2, 1 mL di B27 e 5 luna di 100 g/mL bFGF in 50 mL di DMEM. Mescolare bene il mezzo e scaldarlo a 37 gradi centigradi prima dell'uso.
2. Preparazione delle cellule corticali cerebrali primarie e successiva placcatura
   1. Sacrificare un topo incinta a tempo E10.5 con lussazione cervicale.
      NOT: A E10.5, la maggior parte delle cellule sta proliferando NSPC nella corteccia cerebrale, dando origine a grandi cloni di progenie in vitro.
   2. Sterilizzare l'addome del 75% di etanolo. Utilizzare forbici sottili e pinze microseghettate per aprire l'addome tagliando la pelle e il muscolo sottostante lungo il lato destro della linea mediana. Rimuovere delicatamente l'utero dalla cavità addominale con pinze seghettate e tagliarlo dalla cavità addominale con le forbici fini.
   3. Lavare l'utero con 40 mL di HBSS pre-raffreddato in piatto Petri da 10 cm. Quindi, trasferire l'utero in un nuovo piatto Petri 10 cm e lavarlo di nuovo con 40 mL di HBSS pre-raffreddato.
   4. Trasferire l'utero in una nuova teglia Petri di 10 cm con 40 mL di HBSS pre-raffreddato. Rimuovere gli embrioni dall'utero e dalla membrana amniotica, quindi tagliare le teste degli embrioni dai tronchi con microforzati Jeweler.
   5. Lavare le testine con 40 mL di HBSS pre-raffreddato e trasferire le testine in una nuova parabola Petri di 10 cm con 40 mL di HBSS pre-raffreddato. Usa le microcarpi Jewelers per staccare la pelle e la cartilagine che coprono il cervello, quindi taglia le cortice cerebrali e raccoglile in un tubo conico da 15 mL con HBSS pre-raffreddato.
   6. Pellet le cortice per centrifugazione per 3 min a 4 gradi centigradi e 300 x g. Aspirare il supernatante dal tubo, quindi aggiungere il mezzo di digestione papaina attivato e 15 -L di 4 mg/mL DNase I nel pellet di tessuto.
   7. Risospendere brevemente il pellet di tessuto con un leggero vortice. Incubare il tessuto a 37 gradi centigradi per 30 min. Durante questo periodo, allentare il tessuto da breve vortice ogni 10 min.
      NOT: Alla fine della digestione, non ci dovrebbero essere pezzi di tessuto visibili nel tubo.
   8. Pellet le cellule corticali per centrifugazione per 10 min a 4 gradi centigradi e 450 x g. Aspirare il supernatante dal tubo e lavare il pellet cellulare con DMEM pre-raffreddato. Ripetere questo passaggio una volta.
      NOT: Durante la digestione e il lavaggio, prestare attenzione a non pipettare i tessuti e pellet cellulare grossolanamente per evitare di danneggiare le cellule con una forte forza di tosare.
   9. Aspirare il supernatante dal tubo quindi aggiungere 1,5 mL di HBSS pre-raffreddato nel tubo. Dissociare il pellet di cellule corticali in singole celle con pipettaggio delicato. Contare il numero di cella con un emocitometro.
   10. Aggiungere 2 mL di AM e 2 x 10⁴ cellule corticali per bene in piastre a 6 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ per 3 h per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra.

3. Creazione della cocultura neurale-endoteliale e del sistema di etichettatura Ac₄ManNAz

1. Un giorno dopo aver placcato le celle BEND3 negli inserti, aspirare delicatamente il mezzo nella camera inferiore prima, quindi gli inserti. Lavare l'infaccia degli inserti 3 volte con DMEM preriscaldato. Lavare la superficie esterna degli inserti risciacquando con DMEM preriscaldato.
2. Aggiungere 1 mL di AM preriscaldato in un inserto, quindi trasferire gli inserti nei pozze con cellule corticali primarie. Incubare la co-cultura a 37 e 5% CO₂ per 12 h.
3. Sciogliere Ac₄ManNAz in DMSO per raggiungere una concentrazione di scorte di 200 mM. 12 h dopo aver impostato la cocoltura neurale-endoteliale, aggiungere 1 -L di ac₄pinze ManNAz per camera inferiore e 0,5 - L di stock per inserto nella co-cultura. Agitare immediatamente e delicatamente le piastre per mescolare bene il mezzo. Per le celle di controllo, aggiungere lo stesso volume di DMSO.
4. Coltura le cellule per altri 5 giorni a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂. Preparare l'AM con 10x bFGF come mezzo di rialimentazione (RM). Durante questo periodo, aggiungere 100 L di RM per inserto e 200 L di RM per camera inferiore per alimentare nuovamente le cellule endoteliali e neurali ogni due giorni. Durante il refeeding, non fornire Ac₄ManNAz o DMSO nella coltura.

4. Colorazione immunofluorescente delle sialoglycoproteine negli NSPC primari espansi e nei neuroni differenziati

1. Preparare bTTAA-CuSO₄ complesso 1 30x stock contenente 1,5 mCuSO₄ e 9 m BTTAA in acqua a doppia distillazione. Preparare il buffer 1 appena coniugato a biotina contenente 50 m biotin-alkyne, 2,5 mm di ascorbate di sodio e 1complesso BTTAA-CuSO₄ in PBS.
2. Rimuovere gli inserti dalle piastre di cocoltura. Aspirare il mezzo di coltura dai pozzi inferiori e lavare le cellule neurali una volta con PBS preriscaldato.
3. Aspira il PBS dai pozzi. Aggiungere 1 mL di soluzione PBS paraformaldeide pre-raffreddata 4% per bene nelle cellule e fissare le cellule a RT per 10 min. Quindi, lavare le cellule 3 volte con PBS pre-freddo.
4. Aspirare PBS dai pozzi e aggiungere 1 mL di buffer a biotina appena preparato 1 per bene nelle cellule. Incubare le cellule a RT per 10 min.
5. Aspirare il buffer di reazione dai pozzi. Lavare le cellule 3 volte con PBS. Preparare il buffer di colorazione contenente l'1% FBS e 1 g/mL Alexa Fluor 647-streptavidin. Aggiungere 1 mL di tampone di colorazione per bene nelle cellule e incubare le cellule a RT per 30 min.
6. Aspirare il buffer di colorazione dai pozzi e le cellule lavate 3 volte con PBS pre-raffreddato. Preparare il buffer di blocco contenente 5% BSA e 0,3% detergente non ionico-100 in PBS. Aggiungere 1 mL di buffer di blocco per bene nelle cellule e incubare a RT per 10 min.
7. Preparare una soluzione anticorpale primaria diluendo gli anticorpi anti-nestina e anti-tubulina III insieme nel buffer di blocco a rapporti di 1:20 e 1:1.000, rispettivamente. Rimuovere il buffer di blocco dai pozzetti e aggiungere 1 mL di soluzione anticorpale primaria per bene nelle cellule. Incubare le cellule a 4 gradi centigradi durante la notte.
8. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai pozzi. Lavare le cellule 3 volte con PBS pre-freddo. Preparare una soluzione anticorpale secondaria diluindo Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG1, Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG2b, e DAPI insieme nel buffer di blocco a una diluizione di 1:1,000. Aspirare il PBS dai pozzi e aggiungere 1 mL soluzione anticorpale secondaria per bene nelle cellule. Incubare le cellule a RT per 2 h.
9. Aspirare la soluzione anticorpale dai pozzi e lavare le cellule 3 volte con PBS pre-raffreddato. Successivamente, le celle sono pronte per l'acquisizione dell'immagine.

5. Purificazione delle Sialoglycoproteine da NPC primari espansi e neuroni differenziati

1. Preparare BTTAA-CuSO₄ complesso 2 15x stock contenente 1,5 m CuSO₄ e 3 mM BTTAA in acqua a doppia distillazione. Preparare il buffer di sospensione delle proteine A contenente il 4% SDS e 10 mM EDTA in acqua a doppia distillazione; tamburo di sospensione proteica B contenente 150 mM NaCl, trietanolamina 50 mM e 1% di etere oleyl in polioxyethylene (ad esempio Brij97) in acqua a doppia distillazione con pH 7.4. Prima dell'uso, mescolare il buffer A:buffer B : 1:8 (vol/vol) per preparare il buffer di sospensione proteica completo. Preparare il buffer di lavaggio delle proteine 1 contenente il 2% di SDS in PBS; tamburo di lavaggio delle proteine 2 contenente 8 M di urea in bicarbonato di ammonio 250 mM (ABC); e buffer di lavaggio proteico 3 contenente 2,5 M NaCl in PBS.
2. Rimuovere gli inserti dalle piastre di cocoltura. Aspirare il mezzo di coltura dai pozzi inferiori e lavare le cellule neurali una volta con PBS pre-raffreddato.
3. Aspirare il PBS dai pozzi e aggiungere 200 -L di tampone RIPA pre-raffreddato per bene nelle piastre. Incubare le piastre sul ghiaccio per 5 min. Raccogliere la lisi proteica in tubi da 1,5 mL. Pellet i detriti cellulari per centrifugazione per 10 min a 4 gradi centigradi e 12.000 x g.
4. Trasferire il supernatante in nuovi tubi da 1,5 mL. Determinare la concentrazione proteica con il kit BCA secondo le istruzioni del produttore. Regolare la concentrazione proteica a 1 mg/mL.
5. Aggiungere 100 alkyne-biotina, 2,5 m di ascorbate di sodio da 2,5 m e 1 x BTTAA-CuSO₄ complesso 2 a 1 mL di lisi proteica e mescolare bene la soluzione. Incubare il mix a RT per 1 h.
6. Trasferire la soluzione di reazione in 20 mL di metanolo pre-raffreddato in un tubo conico da 50 mL. Mescolare bene e incubare a -30 gradi durante la notte per far precipitare le proteine.
7. Pellet la proteina precipita per centrifugazione per 15 min a 4 e 4.500 x g. Lavare il pellet proteico due volte con 20 mL di metanolo pre-raffreddato. Aspirare il super-attuoso dal tubo. Risospendere il pellet proteico con 4 mL di tampone proteico resuspension e trasferire la sospensione della proteina in un nuovo tubo conico da 15 mL.
8. Prendere 50 - L di perline streptavidin e lavarle 3 volte con PBS. Aggiungere le perline lavate nella sospensione delle proteine. Incubare la soluzione a 4 gradi centigradi per 3 h su un rotatore verticale ad una velocità di rotazione di 20 giri/min.
9. Lavare le perline in sequenza con 6 tipi di buffer: buffer di lavaggio delle proteine 1, buffer di lavaggio delle proteine 2, buffer di lavaggio delle proteine 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC e 0,05 M ABC.
10. Dopo il lavaggio, risospendere le perline con 20 gradi di PBS e trasferire le perline in un nuovo tubo da 1,5 mL. Aggiungete nelle perline 20 luna di 2x di proteine e trattate a 95 gradi centigradi per 10 min. I campioni di proteine devono quindi essere sottoposti a SDS-PAGE e macchiati con Coomassie brillante blu R-250 secondo le istruzioni del produttore. Tagliare le proteine in gel come indicato da Coomassie brillante blu R-250 per l'analisi della spettrometria di massa.

Risultati

L'intera procedura per l'espansione in vitro e l'etichettatura metabolica degli NSPN embrionali primari richiede 6 giorni(Figura 1A). La qualità della linea cellulare BEND3 e degli NSPC primari appena isolati sono la chiave per un esperimento di successo. Le cellule BEND3 sono la fonte di fattori solubili che stimolano l'auto-rinnovamento e la proliferazione degli NSPC. Va assicurato che le cellule BEND3 siano prive di qualsiasi contaminazione e si dividano ...

Discussione

I marcatori di superficie sono comunemente utilizzati per etichettare e purificare specifici tipi di cellule in vitro e in vivo^17,18. La scoperta dei marcatori di superficie contribuisce notevolmente alla medicina rigenerativa e alle ricerche sulle cellule staminali fornendo strumenti molecolari per arricchire selettivamente una popolazione di cellule staminali da tessuti e piatti di coltura normali o patologici, offrendo una cellula purificata per uso clinico o ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2X	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
urea	Sigma	U5378