Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.

Resumo

A haste neural e as células progenitoras (NSPCs) são a base celular para as complexas estruturas e funções do cérebro. Eles estão localizados em nichos especializados in vivo e podem ser isolados e expandidos in vitro, servindo como um importante recurso para o transplante de células para reparar danos cerebrais. No entanto, os NSPCs são heterogêneos e não claramente definidos no nível molecular ou purificados devido à falta de marcadores específicos de superfície celular. O protocolo apresentado, que foi relatado previamente, combina um sistema neural-endothelial da cocultura com um método metabólico da rotulagem do glicana para identificar o sialoglycoproteome de superfície de nspcs preliminares. O sistema de cocultura NSPC-endotelial permite a autorenovação e expansão de NSPCs primários in vitro, gerando um número suficiente de nspcs. os Sialoglicanos em nspcs cultivados são rotulados usando um repórter metabólico de ácido siálico não natural com grupos funcionais bioortogonais. Comparando o sialoglycoproteome dos NSPCs Self-renovando expandidos em uma cocultura endothelial com diferenciação da cultura neural, nós identificamos uma lista de proteínas da membrana que são enriquecidas em NSPCs. Em detalhe, o protocolo envolve: 1) set-up de uma cocultura NSPC-endotelial e de uma cultura de diferenciação de NSPC; 2) rotulagem com azidoaçúcar por-O-acetilado N-azidoacetilmannosamina (AC₄Mannaz); e 3) conjugação de biotina ao sialoglicíno modificado para imagem após fixação da cultura neural ou extração protéica da cultura neural para análise de espectrometria de massas. Em seguida, os candidatos a marcadores de superfície enriquecidos com NSPC são selecionados por análise comparativa de dados de espectrometria de massas tanto do NSPC expandido quanto de culturas neurais diferenciadas. Este protocolo é altamente sensível para identificar proteínas da membrana da baixa abundância nos materiais de partida, e pode ser aplicado à descoberta do marcador em outros sistemas com modificações apropriadas

Introdução

Células-tronco neurais são definidas como uma população de células multipotentes que podem se autorenovar para manter uma piscina de células-tronco e diferenciar-se em neurônios e glia. Eles são os principais tipos de células no sistema nervoso e podem oferecer grande potencial terapêutico na medicina regenerativa através da transplantação celular em cérebros doentes e feridos^1,2. Como o desenvolvimento^{prossegue, a}população de células-tronco neural torna-se heterogênea^{3,4, e}a proporção de células-tronco neurais no cérebro diminui gradualmente⁵. De modo geral, células-tronco neurais embrionárias e outras células progenitoras neurais, denominadas coletivamente de tronco neural e células progenitoras (nspcs), estão localizadas nas zonas germinais, na zona ventricular e na zona zona em camundongos⁶. No cérebro embrionário, as células-tronco neurais geram neurônios direta ou indiretamente através de células progenitoras intermediárias (ipcs), e em algumas espécies através dos progenitores da zona zona externa (orgs)^7,8. A assinatura molecular específica, a morfologia, a localização no nicho de células-tronco e o potencial de diferenciação determinam o papel de cada subtipo na organogênese cerebral e nas aplicações clínicas⁹. No entanto, os marcadores de superfície de célula atualmente disponíveis não podem discriminar inequivocamente e purificar diferentes subtipos de NSPCs, limitando a compreensão e a utilização desses subtipos.

A identificação de marcadores de superfície primários de NSPCs é limitada por três grandes obstáculos. O primeiro é o número limitado de células NSPCs no tecido, dificultando a preparação de amostras de proteínas de superfície celular para análise de espectrometria de massas comum. A segunda limitação é a dificuldade na produção de subtipos de células puras para a geração de dados de proteínas de membrana subtipo-específicos. Finalmente, o terceiro desafio é a baixa proporção de proteínas de superfície celular em proteínas de células inteiras, o que dificulta suas sensibilidades de detecção por espectrometria de massas.

Para superar estes problemas, nós desenvolvemos uma aproximação chemoproteomic para enriquecer seletivamente e identificar proteínas de superfície da pilha em nspcs preliminares pela rotulagem metabolicamente as sialoglycoproteínas¹⁰. Para gerar um número suficiente de NSPCs, aproveitamos um protocolo estabelecido para expandir e manter NSPCs embrionários primários em Estados indiferenciados in vitro, por coculturando NSPCs com linhas celulares endoteliais cerebrais do camundongo usando um suporte permeável sistema de inserção da matriz (por exemplo, transwell)¹¹. Em contrapartida, as npscs cultivadas isoladamente sem células endoteliais geram Progênese diferenciada^11,12. Assim, amostras de proteínas desses dois sistemas de cultura podem ser analisadas comparativamente para identificar proteínas diferencialmente expressas em NSPCs e neurônios diferenciados. Como a maioria das proteínas de superfície celular são modificadas por ácido siálico¹³, não natural ácido siálico precursor analógico N-azidoacetilmannosamina-tetraacylated (AC₄Mannaz) foi usado para seqüestrar a via metabólica intrínseca de modo que endógena, recém- sialoglicanos sintetizados são marcados com grupos azido, gerando um punho químico¹⁴. Com as reações do azido-alkyne-negociadas, que conjugar a biotina aos sialoglycans, as proteínas de superfície da pilha podem ser visualizadas e enriquecidas para a identificação proteômica com um fluoróforo streptavidin-acoplado ou uma matriz¹⁴.

Aqui, nós realizamos a mancha da análise do gel de SDS-PAGE do sialoglycoproteome de superfície dos NSPCs expandidos em uma cocultura endotelial e em pilhas diferenciando-se em um sistema da não-cocultura. Nós igualmente seletivamente purificar o sialoglycoproteome de superfície nos dois sistemas da cultura para a comparação proteômica. Nosso protocolo, comparado com os protocolos tradicionais da purificação de superfície da pilha da centrifugação-baseada¹⁵, aumenta a eficácia da extração reduzindo os procedimentos de extração da proteína de superfície com a conjugação e a afinidade específicas do Tag Purificação. Entretanto, aumenta a pureza da extração de proteínas de superfície da pilha baseadas na premissa que o sialylation acontece na maior parte nas proteínas de superfície da pilha. Embora os fatores endothelial não possam completamente obstruir a diferenciação de NSPCs expandidos, o estudo comparativo entre uma cocultura e uma cultura diferenciada fornece um método conveniente para identificar proteínas de superfície pilha-enriquecidas da haste sem a necessidade de analisar proteínas de NPCs purificadas por FACS¹⁶. Acreditamos que essa abordagem pode ser aplicada a estudos de proteínas superficiais em outros sistemas com as modificações apropriadas.

Protocolo

Todos os protocolos animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo IACUC (Comitê institucional de cuidados e uso de animais) da Universidade de Tsinghua e realizados de acordo com as diretrizes do IACUC. A instalação de laboratório de animais na Universidade de Tsinghua foi credenciada pela AAALAC (Associação para avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais internacionais). Para o estadiamento dos embriões, o meio-dia do tampão vaginal identificado foi calculado como dia embrionário 0,5 (E 0,5).

Nota: Todas as células são cultivadas na incubadora de células em condições de 37 ° c e 5% CO₂.

1. preparação da cultura endotelial do camundongo em inserções de suporte permeável

Nota: As células BEND3 são mantidas de acordo com as instruções do fabricante.

1. Prepare o meio de célula BEND3 (BM) adicionando 50 mL de FBS e 5 mL de penicilina-estreptomicina em 500 mL de DMEM e misture bem.
2. Aspirar o meio do prato e lave a cultura das células BEND3 com 1 mL de PBS uma vez. Adicionar 1 mL de 0,25% de Trypsin-EDTA nas células e incubar as células durante 4 min a 37 ° c.
3. Adicionar 1 mL de BM nas células para neutralizar Trypsin-EDTA e pipeta para cima e para baixo suavemente para dissociar completamente as células. Transfira a suspensão celular para um novo tubo cônico de 15 mL e pellet por centrifugação à temperatura ambiente (RT) por 5 min a 400 x g.
4. Aspirar o sobrenadante do tubo e suspender as células com 9 mL de BM fresco, em seguida, adicione 1 mL de suspensão celular em uma inserção de suporte permeável. Adicione mais 2 mL de BM fresco por poço na câmara inferior da matriz. Continue a cultura das células por um dia.

2. preparação de mouse primário cortical NSPCs cultura

1. Preparação da placa de cultura, meio de digestão de papaína e meio de cultura cortical aderente (AM)
   1. Cubra 6 placas de poço com poli-L-lisina (PLL) adicionando 1 mL de solução de PLL por poço em placas de 6 poços. Em seguida, incubar as placas em RT por 30 min.
   2. Transfira a solução PLL para um tubo cônico de 15 mL. Lave as placas 3 vezes com água destilada dupla. Airdry as placas e colocá-los de lado até o uso.
   3. Prepare o meio de digestão de papaína adicionando 50 U de papaína, 50 μL de L-glutamina e 50 μL de 100 mg/mL de acetil-L-cisteína em 5 mL de DMEM. Misture o meio brevemente e aqueça-o ao ° c 37 por 30 minutos para a ativação da enzima.
   4. Prepare o meio de cultura aderente da célula cortical (AM): Adicione 500 μL de L-glutamina, 500 μL de piruvato de sódio, 500 μL de 100 mg/mL de N-acetil-L-cisteína, 500 μL de N2, 1 mL de B27 e 5 μL de 100 μg/mL de bFGF em 50 mL de DMEM. Misture bem o meio e aqueça-o a 37 ° c antes de usar.
2. Preparação de células corticais cerebrais primárias e posterior chapeamento
   1. Sacrifique um rato grávida cronometrado E 10.5 por luxação cervical.
      Nota: Na E 10.5, a maioria das células está proliferando NSPCs no córtex cerebral, dando origem a grandes clones de Progênese in vitro.
   2. Esterilizar o abdômen em 75% etanol. Use tesouras finas e fórceps micro-Serrated para abrir o abdômen cortando a pele e o músculo subjacente ao longo do lado direito da linha média. Retire o útero da cavidade abdominal suavemente com pinça serrilhada e cortá-lo a partir da cavidade abdominal com tesouras finas.
   3. Lave o útero com 40 mL de HBSS pré-refrigerados em um prato de Petri de 10 cm. Em seguida, transfira o útero para um novo prato de Petri de 10 cm e lave-o novamente com 40 mL de HBSS pré-refrigerados.
   4. Transfira o útero para um novo prato de Petri de 10 cm com 40 mL de HBSS pré-refrigerados. Retire os embriões do útero e da membrana amniótica, em seguida, cortar as cabeças dos embriões fora dos troncos com micropinça Jewelers.
   5. Lave as cabeças com 40 mL de HBSS pré-refrigerados e transfira as cabeças para um novo prato de Petri de 10 cm com 40 mL de HBSS pré-refrigerados. Use micropinça Jewelers para descascar a pele e cartilagem cobrindo os cérebros, em seguida, cortar os córtices cerebrais fora e coletá-los em um tubo cônico de 15 mL com HBSS pré-refrigerados.
   6. Pellet os córtices por centrifugação por 3 min a 4 ° c e 300 x g. Aspirar o sobrenadante do tubo, em seguida, adicione o meio de digestão de papaína ativada e 15 μL de 4 mg/mL de DNase I na pelota do tecido.
   7. Resuspend a pelota do tecido momentaneamente pelo vortexing delicado. Incubar o tecido a 37 ° c durante 30 min. Durante este tempo, afrouxe o tecido pelo vortexing breve cada 10 minutos.
      Nota: No final da digestão, não deve haver partes visíveis do tecido no tubo.
   8. Pellet as células corticais por centrifugação por 10 min a 4 ° c e 450 x g. Aspirar o sobrenadante do tubo e lavar o pellet celular com DMEM pré-resfriado. Repita este passo uma vez.
      Nota: Durante a digestão e lavagem, tome cuidado para não pipeta os tecidos e a pelota da pilha aproximadamente para evitar danificar as pilhas com uma força de corte forte.
   9. Aspirar o sobrenadante do tubo, em seguida, adicione 1,5 mL de HBSS pré-refrigerados no tubo. Dissociar a pelota cortical da pilha em únicas pilhas com pipetagem delicada. Conte o número da célula com um hemociômetro.
   10. Adicionar 2 mL de AM e 2 x 10⁴ células corticais por poço em placas de 6 poços. Incubar a placa a 37 ° c e 5% CO₂ para 3 h para deixar as células anexadas à placa.

3. set-up da co-cultura neural-endothelial e do sistema de rotulagem da C.a.₄Mannaz

1. Um dia após o chapeamento BEND3 células nas inserções, gentilmente aspirar o meio na câmara inferior primeiro, em seguida, as inserções. Lave o inscreve das pastilhas 3 vezes com DMEM pré-aquecido. Lave a superfície exterior das pastilhas enxaguando com DMEM pré-aquecido.
2. Adicione 1 mL de AM pre-aquecido em uma inserção, a seguir transfira as inserções nos poços com pilhas corticais preliminares. Incubar a cocultura a 37 ° c e 5% CO₂ por 12 h.
3. Dissolva a C.a.₄Mannaz em DMSO para conseguir uma concentração de estoque de 200 milímetros. 12 h após a criação da cocultura neural-endotelial, adicione 1 μL de estoque de AC₄Mannaz por câmara inferior e 0,5 μL de estoque por pastilha na cocultura. Agitar as placas imediatamente e suavemente para misturar o meio bem. Para as células de controle, adicione o volume igual de DMSO.
4. Cultive as células por mais 5 dias a 37 ° c e 5% CO₂. Prepare o am com 10x bFGF como o meio de realimentação (RM). Durante este tempo, adicione 100 μL de RM por pastilha e 200 μL de RM por câmara inferior para refeed as células endoteliais e neurais todos os dias. Durante a refeeding, não forneça a C.a.₄Mannaz ou o DMSO na cultura.

4. coloração imunofluorescente de Sialoglicoproteínas em NSPCs primários expandidos e neurônios diferenciados

1. Preparar BTTAA-CuSO₄ complexo 1 30x estoque contendo 1,5 mm CuSO₄ e 9 mm bttaa em água destilada dupla. Prepare recém-tampão conjugado com biotina 1 contendo 50 μM de biotina-alquíne, ascorbato de sódio de 2,5 mM e complexo 1x BTTAA-CuSO₄ em PBS.
2. Retire as pastilhas das placas de cocultura. Aspirar o meio de cultura dos poços inferiores e lavar as células neurais uma vez com PBS pré-aquecido.
3. Aspirar a PBS dos poços. Adicione 1 mL de solução de PBS paraformaldeído pré-refrigerado a 4% por poço nas células e fixe as células em RT durante 10 min. Em seguida, lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado.
4. Aspirar PBS dos poços e adicionar 1 mL de tampão recém-preparado biotina-conjugada 1 por poço nas células. Incubar as células em RT por 10 min.
5. Aspirar o tampão de reacção dos poços. Lave as células 3 vezes com PBS. Prepare o tampão de coloração contendo 1% FBS e 1 μg/mL Alexa fluor 647-streptavidin. Adicionar 1 mL de tampão de coloração por poço nas células e incubar as células em RT por 30 min.
6. Aspirar o tampão de coloração dos poços e células lavadas 3 vezes com PBS pré-resfriado. Prepare o tampão de bloqueio contendo 5% de BSA e 0,3% detergente não iônico-100 em PBS. Adicionar 1 mL de tampão de bloqueio por poço nas células e incubar em RT por 10 min.
7. Prepare uma solução preliminar do anticorpo diluindo os anticorpos do anti-Nestin e do anti-β-tubulin III junto no amortecedor de obstrução nas proporções de 1:20 e de 1:1000, respectivamente. Retire o tampão de bloqueio dos poços e adicione 1 mL de solução de anticorpos primários por poço nas células. Incubar as células a 4 ° c durante a noite.
8. Retire a solução de anticorpos primários dos poços. Lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado. Prepare uma solução de anticorpos secundários diluindo Alexa fluor 488 cabra anti-mouse IgG1, Alexa fluor 546 cabra IgG2b, e DAPI juntos no bloqueio de buffer em uma diluição de 1:1000. Aspirar a PBS dos poços e adicionar 1 mL de solução de anticorpos secundários por poço em células. Incubar as células em RT por 2 h.
9. Aspirar a solução de anticorpos dos poços e lavar as células 3 vezes com PBS pré-resfriado. Depois, as células estão prontas para captura de imagem.

5. purificação de Sialoglicoproteínas de NSPCs primários expandidos e neurônios diferenciados

1. Preparar BTTAA-CuSO₄ Complex 2 15x estoque contendo 1,5 mm CuSO₄ e 3 mm bttaa em água destilada dupla. Prepare o tampão de ressuscipensão A contendo 4% de SDS e 10 mM de EDTA em água destilada dupla; tampão de ressuscipensão proteica B contendo 150 mM de NaCl, Trietanolamina de 50 mM e éter de polioxietileno a 1% (por exemplo, Brij97) em água destilada dupla com pH 7,4. Antes de usar, misture o buffer a: buffer B = 1:8 (Vol/Vol) para preparar o amortecedor completo da ressuscipensão da proteína. Prepare o tampão de lavagem da proteína 1 que contem 2% SDS em PBS; tampão de lavagem da proteína 2 que contem a ureia de 8 M no bicarbonato do amónio de 250 milímetros (ABC); e tampão de lavagem de proteínas 3 contendo 2,5 M de NaCl em PBS.
2. Retire as pastilhas das placas de cocultura. Aspirar o meio de cultura dos poços inferiores e lavar as células neurais uma vez com PBS pré-resfriado.
3. Aspirar a PBS dos poços e adicionar 200 μL de tampão RIPA pré-refrigerado por poço nas placas. Incubar as placas no gelo por 5 min. colete a Lise proteica em tubos de 1,5 mL. Pellet os restos de células por centrifugação por 10 min a 4 ° c e 12.000 x g.
4. Transfira o sobrenadante para os novos tubos de 1,5 mL. Determine a concentração da proteína com o jogo de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Ajuste a concentração proteica para 1 mg/mL.
5. Adicionar 100 μM de alquine-biotina, 2,5 mM de ascorbato de sódio e 1x BTTAA-CuSO₄ Complex 2 a 1 ml de Lise proteica e misture bem a solução. Incubar a mistura em RT por 1 h.
6. Transfira a solução de reacção para 20 mL de metanol pré-refrigerado num tubo cônico de 50 mL. Misture bem e incubar a-30 ° c durante a noite para precipitar as proteínas.
7. Pellet a proteína precipitados por centrifugação por 15 min a 4 ° c e 4.500 x g. Lave o pellet de proteínas duas vezes com 20 mL de metanol pré-resfriado. Aspirar o sobrenadante do tubo. Resuspend a pelota da proteína com 4 ml do amortecedor da ressuscipensão da proteína e transfira o ressuspensão da proteína em um tubo cônico de 15 ml novo.
8. Tomar 50 μL de grânulos de streptavidina e lavá-los 3 vezes com PBS. Adicione os grânulos lavados no Resuspension da proteína. Incubar a solução a 4 ° c por 3 h em um rotador vertical a uma velocidade de rotação de 20 rpm.
9. Lave as contas sequencialmente com 6 tipos de buffers: tampão de lavagem de proteínas 1, tampão de lavagem de proteínas 2, tampão de lavagem de proteínas 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC e 0, 5 M ABC.
10. Após a lavagem, Ressuspender os grânulos com 20 μL de PBS e transferir os grânulos para um novo tubo de 1,5 mL. Adicionar 20 μL de tampão de carga de proteína 2x nos grânulos e tratar a 95 ° c durante 10 min. As amostras de proteínas devem então ser submetidas a SDS-PAGE e manchadas com o azul brilhante R-250 de Coomassie de acordo com as instruções do fabricante. Corte as proteínas em gel como indicado pela Coomassie azul brilhante R-250 para análise de espectrometria de massas.

Resultados

Todo o procedimento para expansão in vitro e rotulagem metabólica de NSPCs embrionários primários demora 6 dias (Figura 1a). A qualidade da linha celular BEND3 e os NSPCs primários recém-isolados são fundamentais para uma experiência bem-sucedida. As células BEND3 são a fonte de fatores solúveis que estimulam a autorenovação e a proliferação de NSPCs. Deve-se garantir que as células BEND3 estejam livres de qualquer contaminação e se dividam ...

Discussão

Os marcadores de superfície são comumente usados para rotular e purificar os^{tipos de células}específicas in vitro e in vivo^17,18. Descoberta de marcadores de superfície contribui grandemente para a medicina regenerativa e pesquisas de células-tronco, fornecendo ferramentas moleculares para enriquecer seletivamente uma população de células-tronco de tecidos normais ou patológicos e pratos de cultura, oferecendo uma célula purificada recurso para uso clí...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1,000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378