التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

Summary

يفصّل هذا البروتوكول طريقة أحادية الطبقة وخالية من المصل لتوليد خلايا شبيهة بخلايا الكبد بكفاءة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في غضون 18 يومًا. وهذا ينطوي على ست خطوات كما hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع الخلايا المتوسطة مثل خط البدائية, endoderm النهائي, القلفة الخلفية وذرية برعم الكبد قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالكبد.

Abstract

يزيل الكبد السموم من المواد الضارة، ويفرز البروتينات الحيوية، وينفذ الأنشطة الأيضية الرئيسية، وبالتالي الحفاظ على الحياة. وبالتالي، فإن فشل الكبد - الذي يمكن أن ينجم عن تناول الكحول المزمن، والتهاب الكبد، والتسمم الحاد، أو غيرها من الإهانات - هو حالة خطيرة يمكن أن تتوج بالنزيف واليرقان والغيبوبة والموت في نهاية المطاف. ومع ذلك, وقد أحبطت نُهج لعلاج فشل الكبد, فضلا عن دراسات وظائف الكبد والمرض, جزئيا بسبب عدم وجود إمدادات وفيرة من خلايا الكبد البشرية. ولهذا الغرض، يفصّل هذا البروتوكول التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى (hPSCs) في الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد، مسترشدة بخارطة طريق تنموية تصف كيفية تحديد مصير الكبد عبر ست خطوات تمايز متتالية. من خلال التلاعب مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل مصائر الخلايا غير المرغوب فيها بشكل صريح، تولد هذه الطريقة بكفاءة مجموعات من الذرية برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بالكبد بحلول أيام 6 و18 من التمايز PSC، على التوالي. ويتحقق ذلك من خلال التحكم الدقيق زمنياً في مسارات الإشارات التنموية، التي تمارسها الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في وسط ثقافة خالية من المصل. التمايز في هذا النظام يحدث في الطبقات الأحادية وينتج الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تعبر عن إنزيمات خلايا الكبد المميزة ولها القدرة على تطعيم نموذج الماوس من فشل الكبد المزمن. القدرة على توليد بكفاءة أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر له تداعيات لعلاج فشل الكبد، لفحص المخدرات، وللدراسات الميكانيكية لأمراض الكبد.

Introduction

الغرض من هذا البروتوكول هو التمييز بكفاءة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) في السكان المخصب من الذرية برعم الكبد والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد². الوصول إلى إمدادات جاهزة من الذرية الكبد البشري والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد تسريع الجهود للتحقيق في وظائف الكبد والمرض ويمكن تمكين علاجات زرع الخلوية الجديدة لفشل الكبد^{3،4، 5}. وقد ثبت أن هذا الأمر ينطوي على تحديات في الماضي لأن الـ hPSCs (التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القوى) يمكن أن تفرق في جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان؛ وبالتالي، كان من الصعب تمييزها حصرا إلى مجموعة نقية من نوع خلية واحدة، مثل خلايا الكبد⁶.

للتمييز الدقيق hPSCs في خلايا الكبد, أولاً من المهم أن نفهم ليس فقط كيف يتم تحديد خلايا الكبد ولكن أيضا كيف تتطور أنواع الخلايا غير الكبد. معرفة كيفية تطور الخلايا غير الكبدية من المهم أن تقمع منطقيا تشكيل السلالات غير الكبد ية أثناء التمايز، وبالتالي توجيه حصرا hPSCs نحو مصير الكبد². ثانياً، من الضروري تحديد الخطوات التنموية المتعددة التي تميز من خلالها المراكز hPSCs نحو مصير الكبد. ومن المعروف أن hPSCs تميز بالتتابع إلى أنواع متعددة من الخلايا المعروفة باسم خط البدائية (APS)، endoderm النهائي (DE)، القلفة الخلفية (PFG) وذرية برعم الكبد (LB) قبل تشكيل الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HEP). كشف العمل في وقت سابق عن إشارات تحدد مصير الكبد والإشارات التي قمعت تشكيل أنواع الخلايا البديلة غير الكبد (بمافي ذلك المعدة والبنكرياس والذرية المعوية) في كل اختيار النسب التنموي2، ^{7 , 8}.

وبشكل جماعي، أدت هذه الرؤى إلى طريقة أحادية الطبقة خالية من المصل للتمييز بين hPSCs نحو خط بدائي، بطانة الجلد النهائي، القلفة الخلفية، الذرية برعم الكبد وأخيرا، الخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية². وبشكل عام، تنطوي الطريقة على بذر الـ hPSCs في طبقة أحادية الكثافة، وإعداد ستة كوكتيلات من وسائط التمايز (التي تحتوي على عوامل نمو وجزيئات صغيرة تنظم مختلف مسارات الإشارات التنموية)، إضافة هذه الوسائط بالتتابع للحث على التمييز على مدى 18 يوما. خلال هذه العملية، لا حاجة إلى تمرير الخلايا. من الجدير بالذكر، لأن هذه الطريقة تشمل صراحة الإشارات التي تقمع تشكيل أنواع الخلايا غير الكبدية، وهذا النهج التمايز¹ أكثر كفاءة يولد الذرية الكبد والخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية بالمقارنة مع الموجودة طرقالتمايز 2،^{9،10،11،12.} وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في هذا النص يتيح الجيل الأسرع من خلايا الكبد التي تعبر في نهاية المطاف عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات من تلك التي تنتجها بروتوكولات أخرى^{9،10 , 11 , 12}.

البروتوكول الموضح هنا له مزايا معينة على بروتوكولات التمايز الحالية. أولاً، ينطوي على تمايز أحادي الطبقة بين hPSCs، وهو أبسط من الناحية الفنية مقارنة بأساليب التمايز ثلاثية الأبعاد، مثل تلك التي تعتمد على الأجسام الجنينية¹³. ثانيا، يستغل هذا الأسلوب تقدما في الآونة الأخيرة حيث خلايا endoderm النهائي (مقدمة مبكرة لخلايا الكبد) يمكن أن تولد بكفاءة وسرعة في غضون 2 أيام من التمايز hPSC^2،7، وبالتالي تمكين اللاحقة إنتاج خلايا الكبد مع زيادة النقاء. ثالثا، في مقارنات جنبا إلى جنب، والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد التي تنتجها هذه الطريقة² تنتج المزيد من ALBUMIN والتعبير عن مستويات أعلى من عوامل النسخ الكبدي والانزيمات مقارنة مع خلايا الكبد المنتجة في طرق أخرى^{10، 11}و12 .

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام التمايز

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على معلومات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالمواد والكواشف المستخدمة.

1. إعداد وسائط أساسية محددة كيميائياً (آلية التنمية النظيفة)
   ملاحظة: آلية التنمية النظيفة 2 وآلية التنمية النظيفة(3) وآلية التنمية النظيفة(4) وآلية التنمية النظيفة(5) هي وسائط معرّفة كيميائياً تُستخدم كوسائط أساسية للتمركزات المنسّلة المُعرِّفة بخلايا الكبد في مراحل مختلفة. ويمكن الاطلاع على تكوين هذه الوسائط في الجدول 1.
   1. لجعل CDM2 أو CDM3، وإعداد حل الأسهم التي تحتوي على الكحول البولي فينيل (PVA). حل 0.5 غرام من مسحوق PVA في 50 مل من دولبكو تعديل Dulbecco المتوسطة (IMDM) لتوليد 10 ملغ / مل PVA الأسهم.
      ملاحظة: منذ PVA لا يذوب بسهولة، وإعداد خليط PVA / IMDM في قارورة مخروطية مع التحريك المستمر في ~ 50 درجة مئوية على وسادة التدفئة. التحريك يمكن أن يتحقق بسهولة باستخدام النمام المغناطيسي.
   2. بعد حل PVA بشكل متجانس في IMDM، قم بإزالة محلول PVA من لوحة التدفئة والسماح لها بتهدئة درجة حرارة الغرفة.
   3. استخدم فلتر معقم ًا بـ 0.2 ميكرومتر لتصفية محلول PVA.
   4. إعداد آلية التنمية النظيفة 2 وآلية التنمية النظيفة(3) عن طريق الجمع بين الحماية المنوّية (PVA) المصفاة من الخطوة 1-1-1 ومختلف المكونات المشتراة تجارياً على النحو المبين في الجدول 1 وجدول المواد. استخدام وحدات تصفية معقمة، 0.2 ميكرومتر لتصفية جميع الوسائط.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسيط الأساسي عند 4 درجة مئوية ولكن لمدة لا تزيد عن شهرين.
   5. إعداد الوسائط الأساسية المتبقية CDM4 وCDM5 على النحو التالي الجدول1.
2. إعداد وسائط التمايز
   1. لإعداد حلول الأسهم للجزيئات الصغيرة وعوامل النمو، وإعادة تشكيلها وفقا لتوصيات الشركات المصنعة. للتخزين، aliquot في أنابيب معقمة للحد من دورات تجميد ذوبان والحفاظ على -20 درجة مئوية أو على النحو الموصى به.
      ملاحظة: ويرد في الجدول 2 وفي الخطوات التالية وصف لتكوين وسيلة التمايز التي ستستخدم في مختلف مراحل التمايز.
   2. لإعداد وسيط التمايز، أولا ً إذابة الجزيئات الصغيرة المجمدة و/أو عوامل النمو في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، aliquot من الكمية المطلوبة من المتوسطة الأساسية. وأخيراً، قم بإعداد وسائط التمايز النهائية بإضافة الجزيئات الصغيرة المحددة وعواملالنمو إلى الوسط الأساسي بالتركيزات المناسبة (الجدول 2).
      ملاحظة: وينبغي أن تستخدم في نفس اليوم في نفس اليوم وسيلة تمايز معدة حديثا؛ وإلا فإنه يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون ثلاثة أيام.
   3. باستخدام طرف ماصة، اخلط وسيط التمايز عدة مرات لضمان توزيع المكملات الغذائية بشكل متجانس قبل إضافة الوسيط إلى الخلايا (على سبيل المثال، أضف 1 مل من التمايز المتوسط إلى كل بئر من لوحة 12 بئرًا.)

2. hPSCs البذور على لوحات في الكثافات المحددة للتمايز

1. معطف الخلايا ثقافة البلاستيك التي سيتم استخدامها للبذر مع hPSCs.
   1. إذابة المصفوفة (على سبيل المثال، Geltrex) عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل يوم الاستخدام.
   2. في اليوم التالي، تمييع المصفوفة 1:100 بإضافة 500 ميكرولتر من المصفوفة إلى 50 مل من متوسط النسر المعدل (DMEM)/F12. منذ المصفوفة هو هيدروجيل أن البلمرة لا رجعة فيه عند التعرض لدرجة حرارة الغرفة، عند العمل مع المصفوفة، والحفاظ دائما على أنابيب المصفوفة ووسائل الإعلام على الجليد.
   3. ملاحظة: المصفوفة المذابة 1:100 في DMEM/F12 يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية ولكن ينبغي استخدامها في غضون 2 أشهر.
   4. لطلاء لوحة الثقافة مع المصفوفة، ماصة المصفوفة المخففة في العدد المطلوب من الآبار باستخدام حجم كاف فقط من حل المصفوفة لتغطية سطح البئر (على سبيل المثال، إضافة 0.5 مل من المصفوفة إلى بئر واحد من لوحة 12 جيدا أو 1 مل إلى بئر واحد من 6- كذلك لوحة). إذا لزم الأمر، يهز لوحة بلطف للتأكد من أن حل المصفوفة قد غطت تماما الجزء السفلي من البئر.
   5. اترك اللوحة المغلفة بالمصفوفة في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. في هذه درجة الحرارة، والبوليمرات المصفوفة لتشكيل فيلم رقيقة في الجزء السفلي من البئر.
   6. ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بألواح مغلفة بالمصفوفة في حاضنة 37 درجة مئوية واستخدامها في غضون 3 أيام طالما أن المصفوفة لم تجف.
   7. قم بإستنسخ حل المصفوفة المتبقي من الآبار المغلفة مباشرة قبل بذر الآبار مع hPSCs.
2. تمرير والبذر لوحات المغلفة مع hPSCsNOTE: وكيل التفكك يحتوي على الإنزيمات التي تفكك الخلايا ومن المهم أن تترك hPSCs في عامل التفكك لقصيرة من timespan ممكن.
   1. لبذور لوحات الثقافة المغلفة مصفوفة مع hPSCs قبل التمايز، تنمو hPSCs غير متمايزة إلى > 70٪ الملاءمة في mTeSR1 المتاحة تجاريا المتوسطة (جدولالمواد)وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ومن الأهمية بمكان أن تمر هذه المراكز قبل أن تصبح مُتناقة تماماً، لأن هذه المراكز قد تفرق تلقائياً عند التقاء عال.
      ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs karyotyped للتأكد من عدم وجود تشوهات كروموسومية قبل استخدامها للتجارب. تم الاحتفاظ بـ hPSCs المستخدمة في بروتوكول التمايز هذا في وسائل الإعلام mTeSR1 وتم تمريرها ككتل مع EDTA لتقليل التشوهات الكاريوتيكية. لا ينبغي استخدام hPSCs Karyotypically-abnormal للتمايز، لأنها قد تنتشر بسرعة غير طبيعية. وبالتالي فإن كثافات بذر الخلايا الموصى بها هنا ليست مناسبة للخلايا غير الطبيعية karyotypically.
   2. لبذور hPSCs للتمايز، يستنشق mTeSR1 من لوحة الثقافات hPSC إلى حد كبيرconfluent وإضافة وكيل التفكك اشترى تجاريا (جدول المواد) لتفكك hPSCs، وذلك باستخدام ما يكفي من عامل التفكك لتغطية سطح جيدا أو الطبق الذي تنمو الخلايا (على سبيل المثال، إضافة 0.5 مل من عامل التفكك لكل بئر من لوحة 12 جيدا، 1 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا أو 3 مل لكل طبق 10 سم).
   3. حضانة hPSCs في عامل التفكك في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى تبدأ بعض المستعمرات فصل. اضغط بلطف الجزء السفلي من البئر / لوحة عدة مرات. بعد عدة دقائق من التفكك، يجب أن معظم المستعمرات hPSC تأتي بحرية في تعليق.
   4. لإزالة hPSCs منفصلة من لوحة، إضافة 2 مل / جيدا من DMEM / F12 إذا كان العمل مع لوحة 6-جيدا (أو 1 مل / جيدا إذا كان العمل مع لوحة 12 جيدا) لتخفيف عامل التفكك. استخدام ماصة المصلية 5 مل لالماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لغسل جميع الخلايا من سطح البئر. جمع الخلايا واحدة علقت مرة أخرى في أنبوب مخروطي 50 مل. اغسل اللوحة مرة ثانية بنفس الحجم من DMEM/F12 لضمان استرداد جميع الـ hPSCs.
   5. إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على الخلايا، إضافة DMEM/F12 لتخفيف الحجم الأصلي لعامل التفكك بنسبة 1:5-1:10 (على سبيل المثال، إذا كان الحجم الأصلي لعامل التفكك 1 مل، ضبط الحجم الإجمالي لتعليق الخلية إلى 10 مل مع DMEM/F12 لتخفيف عامل التفكك في 1:10)
   6. طرد مركزي hPSCs التي تم جمعها في أنبوب مخروطي 50 مل في 350 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية إلى خلايا بيليه.
   7. في انتظار الخلايا إلى بيليه، يستنشق مصفوفة من لوحة التي سيتم زرع hPSCS. بعد ذلك، إضافة كميات كافية من mTesR1 تستكمل مع 1 ميكرومتر من الثيازوفيفيين التي تم الحصول عليها تجاريا (مثبط الصخور الدوائية) إلى الآبار المتلقي لتغطيتها (على سبيل المثال، إضافة 0.5 مل mTeSR1 لكل بئر من لوحة 12 جيدا أو 1 مل من mTeSR1 لكل بئر من لوحة 6 جيدا).
      ملاحظة: يتم تضمين Thiazovivin في تركيز منخفض في هذه الخطوة لتعزيز بقاء خلية واحدة وبالتالي كثافة البذر اللاحقة من hPSCs.
   8. بعد hPSCs الطرد المركزي، يستنشق بعناية supernatant، وترك hPSCs بيليه في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي. يحتوي ال [سوبرنتنت] إنفصال عاملة أيّ سيمنع تصاق لاحقة من [هبس] ولذلك, هو مهمّة أن يستنشق الأغلبية كبيرة من ال [سوبرنت] قبل باشر.
   9. إعادة تعليق بيليه الخلية في mTeSR1 تستكمل مع 1 ميكرومتر من ثيازوفيفين. مع ماصة p1000، triturate بلطف 2-3 مرات لإعادة تعليق بالتساوي بيليه الخلية في تعليق خلية واحدة. لا الإفراط في triturate بيليه الخلية كما القوة الميكانيكية المفرطة سوف تضر hPSCs ويؤدي إلى ضعف بقاء الخلية.
   10. بعد إعادة تعليق hPSCs، ماصة على الفور 10 درجة مئوية من التعليق في مقياس الهيموميتومتر وحساب عدد الخلايا. من المهم أن خلايا ماصة لحساب في أسرع وقت ممكن، كما الجاذبية سوف يؤدي إلى hPSCs يستقر بشكل طبيعي في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل، والتي سوف تشوش دقة عد الخلايا.
   11. ضبط حجم hPSCs المعاد تعليقها مع mTeSR1 الثيازوفيفين المكمّل لتحقيق تركيز الخلية المطلوب للطلاء. على سبيل المثال، بعد ضبط حجم hPSCs المعلقة، أضف 0.5 مل من تعليق الخلية لكل بئر إلى البذور 160،000-250،000 خلية في كل بئر من لوحة 12 جيدا، وبالتالي تحقيق حجم إجمالي قدره 1 مل في كل بئر (تمت إضافة 0.5 مل من وسائل الإعلام إلى البئر في الخطوة 2.2.7). إذا تم استخدام آبار أكبر أو أصغر، حجم أرقام الخلايا / أحجام الوسائط صعودا أو خفض وفقا لذلك.
       ملاحظة: من المهم أن البذور hPSCs في كثافة الخلايا المشار إليها. ولن تميز هذه المراكز التي تتسم بالإفراط في الإفراط في الإفراط في الإفراط في الإفراط في استخدام هذه المراكز بكفاءة، ولن تبقى هذه المراكز على قيد الحياة بشكل جيد أثناء التمايز.
   12. هز اللوحة في نمط متقاطع (يسار، ثم يمين؛ إلى الأمام، ثم إلى الخلف) عدة مرات للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي عبر اللوحة/البئر. لا تدور لوحة في حركة دائرية، كما الخلايا سوف يستقر في وسط لوحة / جيدا. عادة، سوف تبدأ hPSCs التمسك سطح البئر في غضون 3-30 دقيقة~ السماح للخلايا بالنمو لمدة 24 ساعة على الأقل قبل بدء التمايز.

3. تمايز hPSCs في الخلايا البطانية وكبد Progenitors

1. بعد أن تم طلاء hPSCs لمدة 24 ساعة على الأقل (كما هو موضح في الخطوة 2.2.12)، قبل المضي قدما في التمايز، تحقق من مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر على النقيض من المرحلة، مع التركيز بشكل خاص على قطر وكثافة مستعمرات hPSC مطلية.
   ملاحظة: ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون الكتل متباعدة بسهولة وبحجمها وكثافتها المناسبين في جميع أنحاء البئر قبل الخطوة 3-2. كبيرة (تقريبا >400 [م]) أو مستعمرات صغيرة (تقريبا <200 [م]) من [هبس] لا قابل للاستعمال للتمايز (الشكل 4). إشارات التمايز لن تعمل بالتساوي في جميع أنحاء مستعمرات hPSC الكبيرة، مما يؤدي إلى التمايز غير الفعال. المستعمرات الصغيرة جداً لا تبقى على قيد الحياة بشكل جيد خلال الأيام الثلاثة الأولى من تمايز hPSC في بروتوكول التمايز هذا. إذا كانت كثافة hPSCs البذور صحيحة، فإن مستعمرات hPSC غالبا ً ما تشكل "جسور" الخلايا بينها والتقاء إجمالي سيكون~ 30-50٪ قبل إضافة اليوم 1 التمايز المتوسط (الشكل 4).
2. إذا كانت أحجام المستعمرة مثالية في الخطوة 3.1، انتقل إلى اليوم 1 من التمايز، مما ينطوي على تمايز hPSCs في خط بدائي أمامي (APS).
3. إعداد وسيط تمايز اليوم الأول للوكالة عن طريق خلط جميع الكواشف المبينة في الجدول 2 باستخدام آلية التنمية النظيفة 2 (الجدول 1 والفرع 1-2) كوسيلة أساسية. Pipet لخلط عدة مرات لضمان التوزيع حتى من المكونات في وسائل الإعلام.
4. يستنشق لإزالة الثيازوفيفين تكمل mTeSR1 من hPSCs مطلي وغسل لفترة وجيزة hPSCs مع وسائل الإعلام IMDM. لا تغسل مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) بدلا من IMDM، كما PBS يفتقر إلى أيونات الكالسيوم (كاليفورنيا^{2 +}) وبالتالي سامة لhPSCs. فإنه سوف يعطل مورفولوجيا الخلية.
5. بعد غسل IMDM قصيرة، إضافة اليوم 1 المتوسطة إلى hPSCs. تسجيل الوقت والمكان الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية
6. مواصلة خطوات التمايز اللاحقةعن طريق إعداد (الجدول 2) وإضافة وسيط التمايز المعني إلى الخلايا في الأيام المعنية (على فترات 24 ساعة) من التمايز في نفس الوقت تقريباً من اليوم (الشكل1). يستعاض عن هاذا الإعلام الجديد يوميا، حتى لو كانت أيام التمايز المتتالية تستخدم نفس وسائط التمايز. بين تغييرات الوسائط، يغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائط IMDM لإزالة الخلايا الميتة وبقايا المكونات المتوسطة السابقة.
7. مع تقدم التمايز إلى ما وراء مرحلة برعم الكبد، تزداد أعداد الخلايا وبالتالي، أضف المزيد من الوسائط إلى كل بئر من اللوحة لضمان عدم الحد من كمية عوامل التمايز والمواد الغذائية. على سبيل المثال، أضف 1 مل تمايز متوسط إلى كل بئر من 12-well في البداية في الأيام 1 إلى 6 من التمايز ولكن إضافة 1.5-2 مل من وسائط التمايز اللاحقة في الأيام اللاحقة من التمايز (أيام 7 إلى 18 من التمايز).

4. توصيف الخلايا الانسيابية وذرية الكبد عن طريق التلطيخ المناعي

1. إعداد حاجز حجب: 10٪ مصل الحمار + 0.1٪ تريتون X100 في الفوسفات منزوع الأيونات المخزنة المالحة (DPBS).
2. إعداد العازلة تلطيخ: 1٪ مصل الحمار + 0.1٪ تريتون X100 في DPBS.
3. يستنشق المتوسطة من الخلايا في لوحة 12 جيدا.
4. إضافة 4٪ بارافورمالدهايد (في DPBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا ثم غسل الخلايا مرتين مع DPBS.
5. إضافة حظر العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لمنع وpermeabilize الخلايا الثابتة.
6. قم بإستنسخ حل الحظر وأضف جسم ًا مضادًا أساسيًا مخففًا في المخزن المؤقت للتلطيخ. (انظر جدول المواد للاطلاع على نسب تخفيف الأجسام المضادة.)
7. وصمة عار الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
8. غسل الخلايا ثلاث مرات مع 0.1٪ تريتون X100 في DPBS.
9. أضف وصمة عار جسم مضاد ثانوي في المخزن المؤقت للتلطيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. (انظر جدول المواد للتخفيف من الأجسام المضادة الثانوية.)
10. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وإضافة DAPI لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإجراء مضادة للبقع النووية.
11. غسل مرتين مع 0.1٪ تريتون X100 في DPBS لإزالة الأجسام المضادة الزائدة وDAPI.
12. إجراء الفحص المجهري الفلوري مع مراقب زايس D1. بدلا ً من ذلك، قم بتخزين اللوحة في 4 درجات مئوية حتى يتم إجراء التصوير. وللاطلاع على النتائج المتوقعة، انظر الشكل 3.

5. توصيف الذرية الكبد عن طريق الفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS) تحليل

ملاحظة: استخدم FACS لتحديد النسبة المئوية لخلايا LB المتمايزة AFP+ التي تظهر في اليوم السادس من التمايز. اتبع نفس الخطوات لتحديد النسبة المئوية لخلايا الكبد المتمايزة ALB+ بحلول اليوم 18 من التمايز.

1. تُجمّه جسم مضاد للوكالة الفرنسية للشرطة فِبا
2. إضافة R-phycoerythrin إلى الأجسام المضادة للوكالة بتركيز (0.55 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام R-phycoerythrin مجموعة الاقتران (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تأكد من تنقية الأجسام المضادة وإعادة تشكيلها في المخازن المؤقتة التي لا تحتوي على الأمينات. تأكد من أن كمية الأجسام المضادة المستخدمة في رد فعل وضع العلامات يجب أن تكون أقل من كمية PE (أي 60 ميكروغرام من الأجسام المضادة مع 100 ميكروغرام من PE). قد يؤدي ضعف اقتران الأجسام المضادة إلى نتائج غير موثوقبها.
3. إضافة 1 ميكرولتر من الكاشف المعدّل ل10 ميكرولتر من الأجسام المضادة ليتم تسميتها. يُخلط المزيج برفق.
4. إزالة مزيج R-PE (100 درجة مئوية) وماصة الخليط أعلاه مباشرة في مادة R-PE lyophilized.
5. ضع الغطاء مرة أخرى واترك القارورة واقفة لمدة 3 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
6. بعد الحضانة لمدة 3 ساعة أو أكثر، أضف 1 ميكرولتر من كاشف التبريد لـ 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المستخدمة. يمكن استخدام المتقارن بعد 30 دقيقة.
7. تخزين الأجسام المضادة المترافقة في 4 درجة مئوية.
8. غسل hPSCs متمايزة أو غير متمايزة في شكل 6-جيدا مع DMEM/F12.
9. علاج لفترة وجيزة مع عامل التفكك (1 مل / جيدا في لوحة 6 جيدا) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى فصل الخلايا. حصاد ووصمة عار على حد سواء hPSC غير متمايزة وخلايا ذرية الكبد المتمايزة متطابقة وتحليلها بالتوازي في نفس التجربة لضمان خصوصية تلطيخ الأجسام المضادة.
10. انقر برفق على طبق بيتري لفصل الخلايا. استخدام ماصة p1000 لفصل الخلايا من لوحة وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل. تأكد من أن الخلايا قد تم فصلمعظمها قبل المتابعة مع الخطوة التالية. في وقت لاحق، وغسل الآبار مرتين أكثر مع 1xDPBS العازلة لجمع الخلايا المتبقية.
11. في أنبوب مخروطي 50mL، تخفيف وكيل التفكك في ~ 5 مجلدات من 1X DPBS العازلة. Triturate بدقة 3-4 مرات مع ماصة p1000 لضمان أن يتم فصل جميع الخلايا في خلايا واحدة.
    ملاحظة: لا بد من توليد خلايا واحدة قبل الطرد المركزي أو كتل في وقت لاحق لا يمكن فصلها بسهولة. ومع ذلك، لا الإفراط في triturate لأن هذا قد يضر سلامة الخلية. عد عدد الخلايا واستخدم النسبة الموصى بها من الخلايا إلى نسبة الأجسام المضادة، والتي تم تحسينها مسبقًا للكشف عن الحد الأدنى من الخلفية والإشارة القصوى.
12. أنبوب مخروطي الطرد المركزي يحتوي على تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
13. يستنشق ال [سوبرنتنت] مع عناية لا أن يزعج الخلية بيليه.
14. إعادة تعليق بيليه الخلية تماما في تثبيت / بيرم العازلة لتوليد تعليق خلية واحدة وإصلاح على الجليد في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير بـ 2 مل في هذه الخطوة يمكّن بيليه الخلية من الإيداع في الزاوية على شكل حرف V من الأنبوب، مما يقلل من فقدان الخلايا أثناء عمليات الغسل.
15. غسل كل بيليه مع 1.8 مل من بيرم / غسل العازلة مرتين. إعادة تعليق بيليه الخلية تماما في بيرم / غسل العازلة عن طريق خلط ماصة 6 مرات مع ماصة p1000. ثم، الطرد المركزي، وإزالة supernatant وتكرار عملية الغسيل مع 1.8 مل من بيرم / غسل العازلة.
16. إعادة تعليق بيليه الخلية في بيرم / غسل العازلة بحيث يكون هناك 100 درجة مئوية / وصمة عار الفردية ونقل تعليق الخلية في وقت لاحق أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
    ملاحظة: لا بد من توليد تعليق خلية واحدة في هذه الخطوة قبل تلطيخ الأجسام المضادة. لن تكون ملطخة المجاميع من الخلايا، وبالتالي سوف يخلط تحليل FACS. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير بـ 2 مل في هذه الخطوة يمكّن بيليه الخلية من الإيداع في الزاوية على شكل حرف V من الأنبوب، مما يقلل من فقدان الخلايا أثناء عمليات الغسل.
17. بعد إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS، aliquot لهم في أنابيب كل 2 مل الفردية (لكل من السيطرة غير ملطخة وعينات ملطخة بالأجسام المضادة).
18. وصمة عار مع المضادة للAFP-PE 0.33 درجة مئوية لكل 150،000 خلية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. على سبيل المثال، لوصمة عار 100 ميكرولتر الفردية، وصمة عار على النحو التالي: 0.33 درجة مئوية من PE أ-AFP و 100 درجة مئوية من بيرم / غسل العازلة. إعادة تعليق الخلايا مع ماصة p200 جيدا لضمان حتى تلطيخ.
    ملاحظة: فقط ماصة مزيج ولا دوامة لأن هذا قد يقلل من استقرار البروتين.
19. غسل، وإعادة تعليق الخلايا مرتين في 1-2 مل من بيرم / غسل العازلة (1.9 مل / وصمة عار الفردية) والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. غسل الخلايا مع ما لا يقل عن 1-2 مل من بيرم / غسل العازلة لضمان الغسيل الكافي.
    ملاحظة: فقط مزيج الماصات ولا دوامة لأن هذا قد يقلل من استقرار البروتين. بعد الطرد المركزي، يستنشق supernatant بعناية لمنع الخلايا من الخلع وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant للحد من الأجسام المضادة ترحيل وضمان غسل أكثر اكتمالا.
20. إعادة تعليق كل بيليه غسلها في 300 درجة مئوية من بيرم / غسل العازلة وسلالة من خلال مرشح 100 درجة مئوية في أنبوب FACS لإجهاد كتل كبيرة من الخلايا قبل تحليل FACS.
21. تحليل الخلايا على قياس تدفق ARIA FACS على قناة PE. تحليل ما لا يقل عن 10،000 الأحداث لكل وصمة عار الفردية، وتحليل الأحداث بحكم تحليل FSC-A /SSC-A، حدد singlets الخلية عن طريق gating على FSC-W /FSC-H متبوعاً SSC-H/SSC-W.

النتائج

بعد 24 ساعة من التمايز APS، سوف تعتمد المستعمرات عموما مورفولوجيا مختلفة من المستعمرات غير المتمايزة المصاحبة لفقدان الحدود المشرقة التي عادة ما تحصر مستعمرات hPSC. من الناحية الشكلية، خلايا خط بدائية عموما لها حدود خشنة وأكثر انتشارا وأقل إحكاما من hPSCs-هذا هو مذكر من الانتق...

Discussion

هذه الطريقة تمكن من توليد السكان المخصب من الذرية برعم الكبد، والخلايا الشبيهة بالكبد في وقت لاحق، من hPSCs. القدرة على توليد السكان المخصب من خلايا الكبد البشرية مهم للاستخدام العملي لهذه الخلايا. الطرق السابقة لتوليد خلايا الكبد من hPSCs أسفرت عن مجموعات الخلايا غير النقية التي تحتوي على كل ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0