Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

Özet

Bu protokol, 18 gün içinde insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSCs) hepatosit benzeri hücreleri verimli bir şekilde üretmek için bir monolayer, serum içermeyen bir yöntem ayrıntıları. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut ve karaciğer tomurcuk ataları hepatosit benzeri hücreler oluşturmadan önce gibi ara hücre türlerine ayırt olarak altı adım gerektirir.

Özet

Karaciğer zararlı maddeleri detoxifies, hayati proteinleri salgıları ve önemli metabolik faaliyetleri yürütür, böylece yaşam sürdürüyor. Sonuç olarak, karaciğer yetmezliği-kronik alkol alımı, Hepatit, akut zehirlenme veya diğer hakaret neden olabilir-kanama, sarılık, koma ve sonunda ölüm sonuçlanabilir ciddi bir durumdur. Ancak, karaciğer yetmezliği tedavisinde yaklaşımlar, yanı sıra karaciğer fonksiyon ve hastalığın çalışmaları, insan karaciğer hücrelerinin bol tedarik eksikliği kısmen stymied olmuştur. Bu amaçla, bu protokol insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSCs), karaciğer kaderi altı ardışık farklılaşma adımları boyunca nasıl belirtildiğini açıklayan bir gelişimsel yol haritası tarafından yönlendirilen hepatosit benzeri hücrelere verimli farklılaşma ayrıntıları. Karaciğer farklılaşma teşvik ve açıkça istenmeyen hücre kaderlerinin oluşumunu bastırmak için gelişimsel sinyal yolları manipüle ederek, bu yöntem verimli insan karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin nüfusu üretir gün 6 ve 18 PSC farklılaşma, sırasıyla. Bu, küçük moleküller ve büyüme faktörleri tarafından serum içermeyen bir kültür ortamında uygulanan, gelişimsel sinyalizasyon yollarının geçici olarak hassas kontrolü yoluyla elde edilir. Bu sistemde farklılaşma monolayers oluşur ve karakteristik hepatosit enzimleri ifade ve kronik karaciğer yetmezliği bir fare modeli erit yeteneğine sahip hepatosit benzeri hücreler verir. Verimli bir şekilde insan karaciğer hücrelerinin çok sayıda üretmek için yetenek karaciğer yetmezliği tedavisi için etkileri vardır, ilaç taraması için, ve karaciğer hastalığının mekanik çalışmalar için.

Giriş

Bu protokol amacı verimli insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmektir (hpscs) karaciğer tomurcuk ataları ve hepatosit benzeri hücrelerin zenginleştirilmiş nüfus². İnsan karaciğer ataları ve hepatosit benzeri hücreler hazır bir tedarik erişim karaciğer fonksiyon ve hastalık araştırmak için çabaları hızlandıracak ve karaciğer yetmezliği için yeni hücresel transplantasyon terapileri olanaklı hale gelebilir^{3,4, 5}' i yapın. Bu hPSCs beri geçmişte zorlu kanıtlanmış (hangi embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreleri dahil) insan vücudunun tüm hücre türlerine ayırt edebilirsiniz; Sonuç olarak, onları sadece tek bir hücre tipi saf bir nüfus içine ayırt etmek zor olmuştur, karaciğer hücreleri gibi⁶.

HPSCs 'i karaciğer hücrelerine tam olarak ayırt etmek için, ilk olarak karaciğer hücrelerinin sadece nasıl belirlenmesini değil, karaciğer hücresi türlerinin nasıl geliştiği de anlaşılması önemlidir. Nasıl non-karaciğer hücrelerinin geliştirmek bilgi mantıksal olarak farklılaşma sırasında karaciğer olmayan sırların oluşumunu bastırmak için önemlidir, böylece sadece bir karaciğer kader²doğru hpscs rehberlik. İkincisi, hPSCs bir karaciğer kaderi ayırt hangi aracılığıyla birden fazla gelişimsel adımları tanımlamak için esastır. Bu hpscs sırayla ilkel çizgi (APS), kesin endoderm (de), posterior foregut (PFG) ve karaciğer tomurcuk ataları (lb) olarak bilinen birden çok hücre türleri farklılaştırarak hepatosit benzeri hücreler (hep) şekillendirmeden önce bilinmektedir. Önceki çalışma, karaciğer kaderi ve diğer non-karaciğer hücre türleri (mide, pankreatik ve bağırsak progenitors dahil) oluşumunu bastırdı sinyalleri belirterek sinyalleri ortaya her gelişimsel soy seçim^{2, 7 , 8}' den itibaren.

Toplu olarak, bu Öngörüler ilkel çizgi, kesin endoderm, posterior foregut, karaciğer tomurcuk ataları ve son olarak, hepatosit benzeri hücreler²hpscs ayırt etmek için bir serum-ücretsiz, tek tabakalı yöntemi yükselmişti. Genel yöntem, uygun bir yoğunlukta bir tek tabakalı hpscs tohumlama içerir, farklılaşma medya altı kokteyl hazırlanıyor (büyüme faktörleri ve çeşitli gelişimsel sinyalizasyon yollarını düzenleyen küçük molekülleri içeren), ve ardışık olarak 18 gün boyunca farklılaşma neden bu medyayı ekleyerek. Süreç boyunca, hücrelerin hiçbir geçiş gereklidir. Not, çünkü bu yöntem açıkça olmayan karaciğer hücre türleri oluşumunu bastırmak sinyalleri içerir, bu farklılaşma yaklaşımı¹ daha verimli karaciğer ataları ve hepatosit gibi hücreler genişletici karşılaştırıldığında üretir farklılaşma yöntemleri^2,9,10,11,12. Ayrıca, bu metinde açıklanan protokol, hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer protokoller tarafından üretilenden daha yüksek seviyelerde olduğunu ifade eden hepatositlerin daha hızlı oluşumunu sağlar^{9,10 , 11} ' i ^{, 12}' ye kadar.

Burada açıklanan protokol mevcut farklılaşma protokolleri üzerinde bazı avantajları vardır. İlk olarak, üç boyutlu farklılaşma yöntemleri ile karşılaştırıldığında Teknik olarak daha basit olan hpscs Tek tabakalı farklılaşma gerektirir, gibi embriyoid organları güvenenler gibi¹³. İkinci olarak, bu yöntem son bir avans bu nedenle kesin endoderm hücreleri (karaciğer hücrelerine erken bir ön) verimli ve hızlı bir şekilde 2 gün içinde HPSC farklılaşma^2,7içinde oluşturulan olabilir, böylece sonraki etkinleştirme artan saflık ile hepatosit üretimi. Üçüncü olarak, yan yana karşılaştırmalar, bu yöntem tarafından üretilen hepatosit benzeri hücreler² daha fazla albumin üretmek ve hepatik transkripsiyon faktörleri ve enzimlerin diğer yöntemlerle üretilen hepatositlere kıyasla daha yüksek düzeyde ifade^{10, 11,12}.

Protokol

1. farklılaşma ortamının hazırlanması

Not: Kullanılan malzemeler ve reaktifler ile ilgili üretici bilgileri için malzeme tablosuna bakın.

1. Baz kimyasal olarak tanımlanan medyanın hazırlanması (CDM)
   Not: CDM2, CDM3, CDM4 ve CDM5 çeşitli aşamalarında karaciğer hücreleri Için hPSCs ayırt etmek için temel Medias kullanılan kimyasal olarak tanımlanır ortam. Bu Medias bileşimi Tablo 1' de bulunabilir.
   1. CDM2 veya CDM3 yapmak için, polivinil alkol (PVA) içeren bir hisse senedi çözümü hazırlayın. 10 mg/mL PVA stok oluşturmak için Iscove 'un modifiye Dulbecco 'nun Orta (ıMDM) 50 mL 'de 0,5 g PVA tozu çözülür.
      Not: PVA kolayca Çözünmezse, PVA/ıMDM karışımından kesintisiz karıştırma ile konik bir Flask hazırlayın ~ 50 °C ' de ısıtma yastığı üzerinde; karıştırma kolayca manyetik karıştırıcı kullanılarak elde edilebilir.
   2. PVA, ıMDM 'de homojen bir şekilde çözündüğünde, PVA çözümünü ısıtma yastığı üzerinden çıkarın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
   3. PVA çözümünü filtrelemek için steril, 0,2 μm filtre kullanın.
   4. CDM2 ve CDM3, süzülmüş PVA 'yı adım 1.1.1 ve ticari olarak satın alınan çeşitli bileşenlerden Tablo 1 ve malzeme tablosundaözetlenen şekilde birleştirerek hazırlayın. Tüm medyayı filtrelemek için steril, 0,2 μm filtre üniteleri kullanın.
      Not: Temel ortam 4 °C ' de saklanabilir ancak 2 aydan uzun sürmez.
   5. Kalan temel ortam CDM4 ve CDM5 aşağıdaki Tablo 1hazırlayın.
2. Farklılaşma medyaları hazırlanması
   1. Küçük moleküller ve büyüme faktörleri için stok çözümlerini hazırlamak için, üreticilerin tavsiyelerine göre onları yeniden oluşturur. Depolama için, donma çözme döngülerini azaltmak ve-20 °c ' de ya da tavsiye edilen şekilde tutmak için steril borularının içine kısım.
      Not: Çeşitli farklılaşma aşamalarında kullanılacak farklılaşma ortamının bileşimi Tablo 2 ' de ve aşağıdaki adımlarda açıklanmıştır.
   2. Farklılaşma ortamını hazırlamak için ilk olarak dondurulmuş küçük molekülleri ve/veya büyüme faktörlerini oda sıcaklığında çözün. Sonra, temel orta gerekli miktarda dışarı kısım. Son olarak, belirtilen küçük molekülleri ve büyüme faktörlerini uygun konsantrasyonlarda temel ortama ekleyerek son farklılaşma medyasını hazırlayın (Tablo 2).
      Not: Taze hazırlanmış farklılaşma ortamı, aynı gün ideal şekilde kullanılmalıdır; Aksi takdirde 4 °C ' de depolanabilir ve üç gün içinde kullanılabilir.
   3. Bir pipet ucu kullanarak, takviyeleri homojen bir şekilde orta hücrelere eklemeden önce dağıtıldığından emin olmak için farklılaşma orta birkaç kez karıştırın (örneğin, her iyi bir 12-kuyu plakasının 1 mL farklılaşma orta ekleyin.)

2. farklılaşma için tanımlanan yoğunluklarda plakalar üzerine tohum hPSCs

1. HPSCs ile tohumlama için kullanılacak Coat hücre kültürü plastikler.
   1. Matris (örneğin, Geltrex), kullanım gününden bir gece önce 4 °C ' de çözüyor.
   2. Ertesi gün, matrisin 500 μL '50 sini soğuk Dulbecco 'nun değiştirilmiş kartal Orta (DMEM)/F12 ' ye ekleyerek matris 1:100 seyreltin. Matris, matris ile çalışırken, oda sıcaklığına maruz kaldıktan sonra geri dönülemez şekilde polimerize olan bir hidrojel olduğundan, matris tüpleri ve medyayı her zaman buzda tutun.
   3. Not: DMEM/F12 'de çözülmüş matris 1:100, 4 °C ' de depolanabilir ancak 2 ay içinde kullanılmalıdır.
   4. Matris ile bir kültür plaka kat için, kuyu yüzeyi kapsayacak şekilde matris çözüm sadece yeterli hacim kullanarak kuyuların gerekli sayısına seyreltilmiş matris pipet (örneğin, bir iyi bir 12-kuyu plaka veya 1 mL bir kuyu için Matrix 0,5 mL eklemek 6-bir iyi iyi plaka). Gerekirse, matris çözeltisi tam kuyu alt kaplı olduğundan emin olmak için hafifçe plaka sallayın.
   5. Matris kaplı plakayı 37 °C ' lik bir kuluçte en az 60 dakika içinde bırakın. Bu sıcaklıkta matris, kuyu dibinde ince bir film oluşturmak için polimerleştirir.
   6. Not: Matris kaplı plakalar 37 °C ' de tutulabilir ve matris kurumamış olduğu sürece 3 gün içinde kullanılabilir.
   7. Kalan matris çözümünü, kuyuları hPSCs ile tohumlama işleminden hemen önce kaplanmış kuyulardan aspirate.
2. Geçmeli ve kaplı levhalar hpscsnot ile tohumlama: ayrışma aracı hücreleri ayırmak enzimleri içerir ve hpscs ayrışma aracısına mümkün olduğunca kısa bir TimeSpan bırakmak önemlidir.
   1. Farklılaşma öncesinde hPSCs ile matris kaplı kültür plakaları tohum için, >% 70 konfluency ticari olarak kullanılabilir mTeSR1 Orta (malzeme tablosu) üreticinin protokole göre farklılaşmamış hpscs büyümek. HPSCs kendiliğinden yüksek konfluence ayırt olabilir gibi onlar tam confluent haline önce hPSCs geçiş için önemlidir.
      Not: hpscs, deney için kullanmadan önce kromozomal anormalliklerin olmadığından emin olmak için karyotiplenmelidir. Bu farklılaşma protokolü için kullanılan hPSCs mTeSR1 medyada tutulan ve karyotifik anomalileri en aza indirmek için EDTA ile kümeleri olarak geçilmiş. Karyotypically-anormal hPSCs farklılaşma için kullanılmamalıdır, onlar anormal hızla çoğalabilir gibi; Böylece hücre-tohumlama yoğunlukları burada tavsiye karyotypically-anormal hücreler için uygun değildir.
   2. Ayrımlama için çekirdek hpscs için, büyük ölçüde-confluent HPSC kültürler plaka mTeSR1 Aspire ve ticari satın ayrışma Ajan eklemek (malzeme tablosu) hpscs ayırmak için, sadece yeterli ayrışma Ajan yüzeyini kapsayacak şekilde kullanarak iyi ya da hangi hücrelerin büyüyor (örneğin, bir 12-kuyu plaka başına ayrışma Ajan 0,5 ml eklemek, 1 ml iyi bir 6-kuyu plaka veya 3 ml başına 10 cm çanak).
   3. 37 °C ' de 5 dakika ya da bazı koloniler dağılmaya başlayana kadar hPSCs 'de dissosyasyon ajanında inkübasyon yapın. Hafifçe iyi/plaka birkaç kez alt dokunun; dissociation birkaç dakika sonra, çoğu hPSC koloniler serbestçe süspansiyon içine gelmelidir.
   4. Bir 6-well plaka (ya da 1 ml/iyi bir 12-Well plaka ile çalışıyorsanız) ayrışma ajanını seyreltmesi için plaka dan Disosiye hpscs ayırmak için, dmem/F12 2 ml/Well ekleyin. Kuyu yüzeyinden tüm hücreleri yıkamak için birden çok kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet 5 mL serolojik pipet kullanın; 50 mL konik tüpte resuspended tek hücreleri toplayın. Tüm hPSCs kurtarma sağlamak için DMEM/F12 aynı hacim ile plaka ikinci kez yıkayın.
   5. 50 ml konik tüp hücreleri içeren, 1:5-1:10 tarafından ayrışma Ajan orijinal hacminin seyreltmesi için dmem/F12 ekleyin (örneğin, kesilme aracı orijinal hacmi 1 ml ise, hücre süspansiyon toplam hacmi ayarlayın 10 ml dmem/F12 ile seyreltmesi için 1:10 adresindeki ayrışma Agent)
   6. Toplanan hPSCs 'yi 4 °C ' de 3 dk için 350 x g 'de 50 ml 'lik konik tüpte Pelet hücrelerine santrifüjler.
   7. Hücreleri Pellet için beklerken, hpscs 'nin tohumlu olduğu plakalı matris Aspire. Sonra, 1 μM ticari olarak elde edilen thiazovivin (bir farmakolojik kaya inhibitörü) onları kapsayacak şekilde alıcı kuyuları ile tamamlayıcı mTesR1 yeterli miktarda ekleyin (örneğin, eklemek 0,5 mL mTeSR1 başına bir 12-kuyu plaka veya 1 mL mTeSR1 iyi başına bir 6-kuyu plaka).
      Not: Thiazovivin düşük konsantrasyonda Bu adımda tek hücreli hayatta kalma ve dolayısıyla hPSCs sonraki tohumlama yoğunluğu geliştirmek için dahil edilir.
   8. Hpscs santrifüpten sonra, özenle supernatant Aspire, konik tüpün altında pelleted hpscs bırakarak. Süpernatant hpscs sonraki yapışma inhibe edecek ve böylece, devam etmeden önce süpernatant büyük çoğunluğu Aspire önemlidir ayrışma Ajan içerir.
   9. MTeSR1 içinde hücre Pelet resuspend thiazovivin 1 μM ile tamamlayıcı. Bir P1000 pipet ile, hafifçe tek bir hücre süspansiyon içine hücre Pelet eşit pelletini 2-3 kez triturate. Aşırı mekanik kuvvet hpscs zarar ve kötü hücre hayatta kalma yol açacak gibi hücre Pelet aşırı triturate yapmayın.
   10. Hpscs Resuspension sonra, hemen bir hemasitometre içine süspansiyon 10 μL pipet ve hücre sayısını saymak. Yerçekimi hPSCs doğal olarak 50 mL tüpünün altına yerleşmek için yol açacak gibi, mümkün olan en kısa sürede sayma için hücreleri pipet önemlidir, hangi doğru hücre sayımı konur.
   11. Kaplama için istenen hücre konsantrasyonu elde etmek için thiazovivin-tamamlayıcı mTeSR1 ile resuspended hPSCs hacmini ayarlayın. Örneğin, yeniden resuspended hPSCs hacmini ayarladıktan sonra, her iyi bir 12-kuyu plakasının her bir kuyu içine tohum 160000-250000 hücrelere iyi başına hücre süspansiyon 0,5 mL ekleyin, böylece her iyi 1 mL toplam hacmi elde (0,5 mL medya iyi adım 2.2.7 eklenmiştir). Daha büyük veya daha küçük kuyular kullanılırsa, hücre numaralarını/ortam birimlerini yukarı veya aşağı göre ölçeklendirin.
       Not: Belirtilen hücre yoğunluğunda hPSCs tohum önemlidir. Aşırı konfluent hPSCs verimli ve altında-confluent hPSCs farklılaşma sırasında iyi hayatta olmayacaktır ayırt olmaz.
   12. Hücrelerin plaka/kuyu boyunca eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için birkaç kez çapraz desenle (sol, sonra sağ; ileri, sonra geri) plakayı sallayın. Hücreler plaka merkezi/iyi yerleşecek gibi, dairesel bir hareket içinde plaka girdap yok. Genellikle, hPSCs içinde kuyu yüzeyine yapışması başlayacaktır ~ 3-30 min. hücrelerin farklılaşma başlatmadan önce en az 24 saat büyüymesine Izin verin.

3. hPSCs endodermal hücreler ve karaciğer progenitors içine farklılaşma

1. HPSCs en az 24 saat (adım 2.2.12 açıklandığı gibi) için kaplama olduktan sonra, farklılaşma ile devam etmeden önce, bir faz-kontrast mikroskop altında hücrelerin morfoloji kontrol, çap ve kaplama hPSC kolonilerin yoğunluğu belirli bir vurgu ile.
   Not: İdeal olarak, kümeleri kolayca aralıklı ve uygun boyut ve yoğunluk boyunca iyi önce adım 3,2 olmalıdır. Büyük (yaklaşık > 400 μm) veya küçük koloniler (yaklaşık < 200 μm) hPSCs farklılaşma için kullanılabilir değildir (Şekil 4). Farklılaşma sinyalleri büyük hPSC kolonileri boyunca eşit hareket etmez, verimsiz farklılaşma yol açacaktır. Çok küçük olan koloniler, bu farklılaşma protokolünde hPSC farklılaşma ilk 3 gün boyunca iyi hayatta değildir. Hpscs seribaşı yoğunluğu doğruysa, HPSC kolonileri genellikle aralarında hücrelerin "köprüler" oluşturur ve genel konfluence olacak ~ 30-50 gün eklemeden önce 1 farklılaşma ortamı (Şekil 4).
2. Koloni boyutları adım 3,1 ' te ideal ise, hPSCs 'nin anterior ilkel çizgi (APS) farklılaşması gerektiren farklılaşma günü 1 ' e geçin.
3. Tablo 2 ' de CDM 2 (tablo 1 ve Bölüm 1,2) kullanarak temel ortam olarak özetlenen tüm reaktifleri karıştırarak gün 1 APS farklılaşma ortamı hazırlayın. Ortamlardaki bileşenlerin bile dağılımını sağlamak için birkaç kez karıştırmak için pipet.
4. Thiazovivin mTeSR1 takviyalı hPSCs kaldırmak için aspirate ve kısaca ıMDM medya ile hPSCs yıkayın. PBS kalsiyum iyonları (CA^{2 +}) yoksun ve böylece hpscs için toksik olduğu gıbı, ımdm yerine fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ile yıkayın etmeyin; hücre morfolojisi bozacak.
5. Kısa ıMDM yıkama sonra gün 1 orta hPSCs ekleyin. Saati kaydedin ve hücreleri 37 °C ' ye geri yerleştirin.
6. Sonraki farklılaşma adımlarına (Tablo 2) hazırlayarak ve ilgili farklılaşma ortamını, günün aynı saatinde (Şekil 1), ilgili günlerde (24 saat aralıklarla) farklılaşma için hücrelere ekleyerek devam edin. Her gün taze medya ile değiştirin, ardışık gün ayrımı aynı farklılaşma ortamını kullansa bile. Medya değişiklikleri arasında, ölü hücreleri ve önceki orta parçaların kalıntısını çıkarmak için hücreleri bir kez ıMDM medyasında yıkayın.
7. Farklılaşma karaciğer tomurcuk aşamasının ötesinde ilerledikçe, hücre numaraları artar ve bu nedenle, farklılaşma faktörleri ve besin miktarını sınırlamak değil sağlamak için her iyi plaka daha fazla medya ekleyin. Örneğin, her kuyu için 1 mL farklılaşma ortamı ekleyin 12-iyi başlangıçta 1 ile 6 arasında farklılaşma ancak daha sonraki günlerde farklılaşma (gün 7-18 farklılaşma) üzerinde 1.5-2 mL sonraki farklılaşma medya ekleyin.

4. Immünostasyon tarafından endodermal hücreler ve karaciğer progenitors karakterizasyonu

1. Engelleme arabelleği hazırlayın:% 10 eşek serum + 0,1% Triton X100 deiyonize fosfat tamponlu tuzlu (DPBS).
2. Boyama tamponu hazırlayın: 1% eşek serum + 0,1% Triton X100 DPBS içinde.
3. 12-kuyu plaka hücrelerinden aspirate orta.
4. Hücreleri düzeltmek ve ardından hücreleri dpbs ile iki kez yıkamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 civarında formaldehite (dpbs) ekleyin.
5. Sabit hücreleri engellemek ve nüfuz etmek için oda sıcaklığında 1 h engelleme arabelleği ekleyin.
6. Engelleme çözümünü aspirate ve boyama tamponunun içinde seyreltilmiş primer antikor ekleyin. (Bkz. antikorlar seyreltme oranları için malzeme tablosu .)
7. Hücreleri 4 °C ' de gece leke.
8. DPBS 'de% 0,1 Triton X100 ile hücreleri yıkayın.
9. Oda sıcaklığında 1 saat için boyama tampon ikincil antikor leke ekleyin. (Bkz. ikincil antikorların dilüsyonları için malzeme tablosu .)
10. İkincil antikor çıkarın ve nükleer counterstain yapmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPı ekleyin.
11. Aşırı antikor ve DAPı 'yi kaldırmak için DPBS 'de% 0,1 Triton X100 ile iki kez yıkayın.
12. Zeiss Observer D1 ile floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Alternatif olarak, görüntüleme gerçekleştirilene kadar plaka 4 °C ' de saklayın. Beklenen sonuçlar için bkz: Şekil 3.

5. floresans aktif hücre-sıralama (FACS) analizi ile karaciğer progenitors karakterizasyonu

Not: Dış AFP + farklılaştırılmış LB hücrelerinin yüzdesini kesin olarak ölçmek için FACS kullanarak 6. 18. farklılaşma sırasında ALB + farklılaştırılmış hepatositlerin yüzdesini ölçmek için aynı adımları izleyin.

1. Bir anti-AFP antikor Conjugate.
2. R-phycoerythrin konjugasyon kiti kullanılarak (0,55 μg/μL) konsantrasyon karşıtı-AFP antikor için R-phycoerythrin ekleyin (bkz. malzeme tablosu).
   Not: Antikorlar saflaştırılmış ve aminler içermeyen arabellekleri reconstituted emin olun. Bir etiketleme reaksiyonunda kullanılan antikor miktarının PE miktardan daha az olması gerektiğinden emin olun (örn. 100 μg PE ile 60 μg antikor). Antikorların kötü konjugasyonu güvenilir olmayan sonuçlara yol açabilir.
3. Etiketlenecek 10 μL antikor için 1 μL değiştirici reakajın ekleyin. Yavaşça karıştırın.
4. R-pe karışımından (100 μL) çıkarın ve yukarıdaki karışımı doğrudan liyofilize R-PE malzemesine pipet atın.
5. Kap geri yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlıkta 3 saat boyunca şişe ayakta bırakın.
6. 3 saat veya daha fazla süre için inküreden sonra, 10 μL antikor için 1 μL giderici reaktif ekleyin. Konjugat 30 dakika sonra kullanılabilir.
7. 4 °c ' de konjuge antikor saklayın.
8. Ayrıştırılmış veya ayırt edilmemiş hPSCs DMEM/F12 ile 6-well formatında yıkayın.
9. Hücreler ayrılıncaya kadar oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ayrışma ajanı (6-kuyu plakasında 1 mL/Well) ile kısaca tedavi edin. Hasat ve her iki farklılaşmayan HPSC ve farklılaşmış karaciğer progenitör hücreleri aynı şekilde leke ve antikor boyama özgüllüğü sağlamak için aynı deney paralel olarak analiz.
10. Hücreleri ayırmak için Petri tabağı hafifçe dokunun. Plaka kapalı hücreleri ayırmak ve 50 mL konik tüp hücreleri toplamak için bir P1000 pipet kullanın. Bir sonraki adıma geçmeden önce hücrelerin çoğunlukla ayrılmış olduğundan emin olun. Daha sonra, kalan hücreleri toplamak için 1xDPBS tampon ile iki kez daha yıkayın kuyuları.
11. 50mL konik tüpte, ~ 5 hacimde 1x DPBS tampon içinde seyreltmeli disajasyon ajanı. Triturate, tüm hücrelerin tek hücrelere dağıldığından emin olmak için bir P1000 pipet ile titizlikle 3-4 kez.
    Not: Santrifüjleme veya kümeleri öncesinde tek hücreler oluşturmak zorunludur, daha sonra kolaylıkla Disosiye edilemez. Ancak, bu hücre bütünlüğünü zarar verebilir gibi aşırı triturate yok. Hücrelerin sayısını saymak ve daha önce minimal arka plan ve maksimal sinyal algılama için optimize edilmiş antikor oranı, hücrelerin önerilen oranını kullanın.
12. 4 °C ' de 5 dak için 300 x g 'de hücre süspansiyonunu içeren santrifüj konik tüp.
13. Hücre peletini rahatsız etmek için değil bakım ile süpernatant aspirate.
14. Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için sabitleme/perus tamponunun içine resuspend hücre Pelet ve 4 °C ' de buz üzerinde düzeltme 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 20 dk. Not. Ayrıca, bu adımda 2 mL mikrosantrifüjlük tüpün kullanımı, hücre Pelet tüpün V şeklinde-köşesinde yatırmak için sağlar, yıkanmaları sırasında hücre kaybını minimize.
15. Her Pelet ile yıkayın 1,8 ml Perm/yıkama tampon iki kez. Bir P1000 pipet ile 6 kez karıştırma pipet tarafından Perm/Wash tampon iyice resuspend hücre Pelet. Sonra, santrifüjün, süpernatant kaldırmak ve 1,8 ml Perm/yıkama tampon ile yıkama işlemini tekrarlayın.
16. Yeniden resuspend hücre Pelet Perm/yıkama tampon böylece 100 μL/bireysel leke olacak ve daha sonra 2 mL mikrosantrifüjü tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak.
    Not: Antikor boyama öncesinde bu adımda tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak zorunludur. Hücrelerin toplamları lekelenmez ve böylece FACS Analizi konacak. Ayrıca, bu adımda 2 mL mikrosantrifüjlük tüpün kullanımı, hücre Pelet tüpün V şeklinde-köşesinde yatırmak için sağlar, yıkanmaları sırasında hücre kaybını minimize.
17. FACS arabelleğinde resuspending hücreler sonra, bireysel 2 ml tüpler içine kısım (hem lekelenmiş kontrol ve antikor-lekeli örnekler için).
18. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika için 150.000 hücre başına Anti-AFP-PE 0,33 μL ile leke. Örneğin, bir 100 μL bireysel leke için, aşağıdaki gibi leke: 0,33 μL a-AFP PE ve 100 μL Perm/Wash tampon. P200 pipet ile resuspend hücreler bile boyama sağlamak için.
    Not: Sadece pipet-mix ve bu protein stabilitesi azaltabilir gibi Vortex yok.
19. Yıkama, iki kez 1-2 ml Perm/yıkama tampon (1,9 ml/bireysel leke) ve 4 °c ' de 5 dakika için 800 x g santrifüjler hücreleri yeniden pelletini. Yeterli yıkama sağlamak için az 1-2 mL Perm/yıkama tamponunu içeren hücreleri yıkayın.
    Not: Sadece pipet karışımı ve bu protein stabilitesi azaltabilir gibi Vortex yok. Santrifübe sonra, dikkatlice dislodging hücreleri önlemek ve antikor Carry-Over en aza indirmek ve daha eksiksiz bir yıkama sağlamak için mümkün olduğunca çok süpernatant kaldırmak için süpernatant Aspire.
20. Her yıkanmış Pelet 300 μL Perm/Wash tampon resuspend ve bir 100 μm filtre üzerinden bir FACS tüp içine germek hücreleri büyük kümeleri için önce FACS Analizi gerin.
21. PE kanalındaki FACS Aria akış sitometri üzerindeki hücreleri analiz edin. Her bir leke için en az 10.000 olayları analiz edin ve FSC-a/SSC-a analizi sayesinde olayları ayrıştırın, SSC-h/SSC-w tarafından izlenen FSC-w/FSC-h üzerinde gating tarafından hücre tekli seçin.

Sonuçlar

APS farklılaşma 24 h sonra, koloniler genellikle hPSC kolonileri circumscribes parlak sınır kaybı ile uyumlu farklılaşmış koloniler daha farklı bir morfoloji benimsemeye olacaktır. Morfolojik, ilkel çizgi hücreleri genellikle düzensiz sınırları var ve daha Spread ve hPSCs daha az kompakt-bu pluripotent epiblast hücreleri ayırt ve ilkel içine giriþ olarak epitelyal-mesenkimal geçiş uyarılıdır çizgi in vivo. Farklılaşma öncesinde hPSCs kolonisi boyutu çok büy...

Tartışmalar

Bu yöntem, karaciğer tomurcuk progenitors zenginleştirilmiş nüfus üretimi sağlar ve daha sonra hepatosit benzeri hücreler, hPSCs dan. İnsan karaciğer hücrelerinin zenginleştirilmiş nüfus oluşturmak için yeteneği bu tür hücrelerin pratik kullanımı için önemlidir. Önceki yöntemler hPSCs gelen hepatositler üretmek için karaciğer ve non-karaciğer hücreleri hem de içeren ezik hücre nüfus sağladı, kemirgenler içine transplantasyon üzerine, karaciğer dokusu ek olarak kemik ve kıkırdak ver...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0