人类多能干细胞有效分化为肝细胞

摘要

该协议详细介绍了单层无血清方法,在18天内从人类多能干细胞(hPSCs)中高效生成肝细胞样细胞。这需要六个步骤,因为hPSCs在形成肝细胞样细胞之前,按顺序分化成中间细胞类型,如原始条纹、最终内皮、后前体和肝芽祖细胞。

摘要

肝脏排毒有害物质,分泌重要蛋白质,并执行关键的代谢活动,从而维持生命。因此,肝衰竭(可能由慢性酒精摄入、肝炎、急性中毒或其他侮辱引起)是一种严重疾病,可最终导致出血、黄热病、昏迷,并最终死亡。然而,治疗肝功能的方法,以及肝功能和疾病的研究,由于人类肝细胞的缺乏,部分受阻。为此,该协议详细介绍了人类多能干细胞(hPSCs)与肝细胞样细胞的有效分化,其指导是一个发展路线图,描述了肝脏命运是如何在六个连续分化步骤中指定的。通过操纵发育信号通路,促进肝脏分化,并明确抑制不需要的细胞命运的形成,这种方法在第6天有效地生成人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞的种群和 PSC 差异的 18 个。这是通过时间精确控制发展信号通路实现的,由无血清培养基中的小分子和生长因子施加。该系统的分化发生在单层,并产生肝细胞样细胞,表达特征肝细胞酶,并有能力移植慢性肝衰竭的小鼠模型。在体外有效生成大量人类肝细胞的能力对治疗肝衰竭、药物筛选和肝病的机械研究都有影响。

引言

该协议的目的是有效地区分人类多能干细胞(hPSCs)到丰富的肝脏芽祖细胞和肝细胞样细胞2。获得现成的人类肝脏祖和肝细胞样细胞将加速研究肝功能和疾病的努力,并可能支持新的细胞移植疗法肝衰竭3,4 ⁵.这在过去被证明是具有挑战性的,因为hPSCs(包括胚胎和诱导多能干细胞)可以分化成人体的所有细胞类型;因此,很难将它们完全区分为单细胞类型的纯种群,如肝细胞6。

要将hPSC精确区分为肝细胞,首先不仅要了解肝细胞是如何指定的,还要了解非肝细胞类型是如何发育的。了解非肝细胞如何发育对于在分化期间从逻辑上抑制非肝系的形成非常重要,从而专门指导hPSC走向肝脏命运2。其次,必须划定hPSC区分肝脏命运的多重发育步骤。众所周知,hPSCs在形成肝细胞样细胞(HEP)之前,会按顺序分化成多种细胞类型,称为原始条纹(APS)、最终内皮(DE)、后前体(PFG)和肝芽祖细胞(LB)。早期的工作揭示了指示肝脏命运的信号和抑制交替非肝细胞类型(包括胃、胰腺和肠道祖细胞)形成的信号,每个发育系选择2,^7,8.

总体而言,这些见解已经产生了一种无血清,单层方法,以区分hPSCs对原始条纹,明确的内皮,后前体,肝芽祖,最后,肝细胞样细胞2。总体而言,该方法涉及以适当的密度在单层中播种 hPSC,制备六种分化介质的鸡尾酒(包含调节各种发育信号通路的生长因子和小分子),以及依次添加这些介质,在18天内诱导分化。在此过程中,不需要细胞的传递。值得注意的是,由于这种方法明确包括抑制非肝细胞类型形成的信号,这种分化方法1通过与现存的肝细胞和肝细胞样细胞的比较,更有效地生成肝祖和肝细胞样细胞区分方法2,9,10,11,12 。此外,本文中描述的协议使肝细胞的生成更快,最终表达出比其他协议9、10产生的肝转录因子和酶的更高水平^,11,12.

与当前差别化协议不同,此处描述的协议具有某些优势。首先,它需要hPSC的单层分化,这在技术上比三维分化方法要简单,例如那些依赖于胚胎体^{的方法13。}其次,这种方法利用了最近的进步,即最终内皮细胞(肝细胞的早期前体)可以在hPSC分化2,7的2天内有效和迅速生成,从而使后续生产纯度提高的肝细胞。第三,在并排比较中,该方法2产生的肝细胞样细胞产生更多的ALBUMIN,表达出比其它方法产生的肝细胞更高水平的肝转录因子和^{酶。 11,12}.

研究方案

1. 差异化介质的准备

注:有关所用材料和试剂的制造商信息,请参阅材料表。

1. 制备基础化学定义介质
   注:CDM2、CDM3、CDM4和CDM5是化学定义的介质,用作不同阶段将hPSC与肝细胞区分为基介质的基础介质。这些介质的组成可在表1中找到。
   1. 要制作 CDM2 或 CDM3,请准备含有聚乙烯醇 (PVA) 的库存溶液。将 0.5 g 的 PVA 粉末溶解在 50 mL 的 Iscove 改性 Dulbeco 介质 (IMDM) 中,以生成 10 mg/mL PVA 库存。
      注:由于PVA不易溶解,在锥形烧瓶中制备PVA/IMDM混合物,在加热垫上以+50°C连续搅拌;使用磁力搅拌器可以轻松实现搅拌。
   2. PVA在IMDM中均匀溶解后,从加热垫中取出PVA溶液,使其冷却至室温。
   3. 使用无菌 0.2 μm 过滤器过滤 PVA 溶液。
   4. 通过结合步骤 1.1.1 中过滤过的 PVA 和表 1和材料表中概述的各种商业购买的组件来准备 CDM2 和 CDM3。使用无菌 0.2 μm 滤光片单元过滤所有介质。
      注:基本介质可储存在4°C,但不超过2个月。
   5. 在表 1之后准备其余基介质 CDM4 和 CDM5。
2. 制备差异化介质
   1. 为小分子和生长因子准备库存解决方案,请根据制造商的建议对其进行重组。对于存储,将等分液放入无菌管中,以减少冻融周期,并保持在-20°C或建议。
      注:表2和以下步骤描述了用于不同分化阶段的分化介质的组成。
   2. 为了制备分化介质,首先在室温下解冻冷冻小分子和/或生长因子。接下来,对所需基介质的量进行等分。最后,通过在适当浓度的基介质中加入指定的小分子和生长因子来制备最终分化介质(表2)。
      注:理想的是在同一天使用新鲜制备的分化介质;否则可储存在4°C,并在三天内使用。
   3. 使用移液器尖端,在将培养基添加到细胞之前,将微分介质混合几次,以确保补充剂均匀分布(例如,在 12 孔板的每个孔中添加 1 mL 的分化介质)。

2. 将 hPSC 种子到以定义密度的板中,以便进行分化

1. 用于用hPSC播种的涂层细胞培养塑料。
   1. 在使用前一天在4°C处解冻基质(例如,Geltrex)。
   2. 第二天,通过将矩阵的 500 μL 添加到 50 mL 的冷 Dulbecco 的改良鹰介质 (DMEM)/F12 中来稀释矩阵 1:100。由于基质是一种水凝胶,在暴露于室温时不可逆转地聚合,因此在使用基质时,始终将基质管和介质保持在冰上。
   3. 注:在 DMEM/F12 中溶解 1:100 的基质可储存在 4°C,但应在 2 个月内使用。
   4. 要用基质涂覆培养板,请使用足够体积的基质溶液将稀释的基质移入所需数量的井中,以覆盖井的表面(例如,在 12 孔板的一个孔中添加 0.5 mL 的基质,或将 1 mL 添加到 6- 的一口井中井板)。如果需要,轻轻摇动板,以确保基质溶液已完全覆盖井底。
   5. 将基质涂层板留在 37°C 培养箱中至少 60 分钟。在此温度下,基质聚合形成井底的薄膜。
   6. 注:基质涂层板可保存在37°C培养箱中,并在3天内使用,只要基质没有干涸。
   7. 在用 hPSC 播种井之前,立即从涂层井中吸出剩余的基质溶液。
2. 用hPSCsS进行涂布板的分离和播种注意:解离剂含有分离细胞的酶,在解离剂中尽可能短的时间跨度中保留hPSC是很重要的。
   1. 在分化前用hPSC进行种子基质涂层培养板时,根据制造商的协议,在商用的mTeSR1介质(材料表)中,将无差别的hPSC增长到>70%的汇合度。在 hPSC 完全融合之前通过 hPSC 至关重要,因为 hPSC 可能在高汇合时自发地分化。
      注:hPSC必须采用卡约型,以确保在用于实验之前没有染色体异常。用于此分化协议的 hPSC 在 mTeSR1 介质中保持,并采用 EDTA 块状,以尽量减少核异常。异常的 hPSC 不应用于分化,因为它们可能异常迅速增殖;因此,这里推荐的细胞种子密度不适合核异常细胞。
   2. 种子 hPSC 进行分化,从大量融合的 hPSC 培养板中吸出 mTeSR1,并添加商业购买的解离剂(材料表)来分离 hPSC,使用刚到足够的分离剂覆盖以及细胞生长的碟(例如,在12孔盘每孔中加入0.5 mL的解散剂,6孔盘每孔1mL,每10厘米盘3 mL)。
   3. 在37°C的解离剂中孵育hPSC5分钟,或直到某些菌落开始分离。轻轻敲击井/板底部几次;分离几分钟后,大多数hPSC菌落应自由进入暂停。
   4. 要将分离的 hPSC 从板上去除,如果使用 6 孔板(如果使用 12 孔板,则添加 2 mL/孔 DMEM/F12)以稀释分离剂。使用 5 mL 血清学移液器多次轻轻上下移液器,从井表面冲洗掉所有细胞;在50 mL锥形管中收集重新悬浮的单个细胞。用相同体积的 DMEM/F12 第二次清洗板,以确保恢复所有 hPSC。
   5. 在含有细胞的50 mL锥形管中,添加DMEM/F12以稀释解散剂的原始体积1:5-1:10(例如,如果解散剂的原始体积为1 mL,则使用DMEM/F12将细胞悬浮总体积调整为10 mL以稀释解散剂在 1:10)
   6. 在 50 mL 锥形管中,在 350 x g下将收集的 hPSC 在 4°C 下 3 分钟,以颗粒细胞离心。
   7. 在等待细胞颗粒,吸气基质从板中hPSCS将播种。接下来,向受体孔中添加足够量的mTesR1,并辅以1 μM的商业获得的Thiazovivin(一种药理学ROCK抑制剂),以覆盖它们(例如,在12孔板每孔添加0.5 mL mTeSR1,或每孔6孔1mTeSR11mTeSR1)。
      注:在此步骤中包括低浓度的Thiazovivin,以提高单细胞存活率,从而增加hPSC的后续播种密度。
   8. 离心 hPSC 后,小心吸出上清液,将颗粒 hPSC 留在锥形管的底部。上清液含有解散剂,这将抑制hPSC的后续粘附,因此,在继续之前吸附绝大多数上清液是很重要的。
   9. 在 mTeSR1 中重新悬浮细胞颗粒,辅以 1 μM 的 thizovivin。使用 p1000 移液器,轻轻三聚2-3次,将细胞颗粒均匀地重新悬浮到单个细胞悬浮液中。不要过度三聚细胞颗粒,因为过多的机械力会损害hPSC并导致细胞存活率差。
   10. 重新悬浮hPSC后,立即将悬浮液10μL移入血细胞计并计算细胞数量。移液细胞尽快计数很重要,因为重力会导致hPSC自然沉降到50 mL管的底部,这将混淆准确的细胞计数。
   11. 调整与Thizovivin补充的mTeSR1的重新悬浮hPSC的体积,以达到电镀所需的细胞浓度。例如,在调整重新悬浮的hPSC的体积后,每口井的电池悬浮液增加0.5 mL,将160,000-250,000个电池种子放入12孔板的每口孔中,从而达到每口井的总体积1 mL(步骤2.2.7中向井中添加0.5 mL的介质)。 如果使用较大或较小的孔,则相应地将像元数/介质体积向上或向下缩放。
       注:在指示的细胞密度下播种 hPSC 非常重要。过度的康联 hPSC 不会有效地区分,并且低汇不足的 hPSC 在分化期间不会很好地存活。
   12. 以交叉模式(左,右;向前,然后向后)摇动板几次,以确保细胞均匀地分布在板/孔上。不要以圆形运动旋转板,因为细胞将沉降在板/孔的中心。通常,hPSC 将在 ±3-30 分钟内开始粘附在井表面。在开始分化之前,允许细胞生长至少 24 小时。

3. hPSC分化为内皮细胞和肝祖细胞

1. 在hPSC被镀了至少24小时(如步骤2.2.12所述)后,在进行分化之前,检查相对比显微镜下细胞的形态,特别强调镀值hPSC菌落的直径和密度。
   注:理想情况下,在步骤 3.2 之前,块块应易于间隔,且在整个油井中应适当大小和密度。大型(约>400 μm)或小菌落(约<200 μm)的hPSC不能用于分化(图4)。分化信号在大型 hPSC 菌落中不能均匀地作用,从而导致低效率的分化。在这个分化协议中,太小的菌落在hPSC分化的前3天不能很好地存活。如果种子hPSC的密度正确,hPSC菌落通常会在它们之间形成细胞的"桥梁",在添加第1天分化介质之前,总汇合量为+30-50%(图4)。
2. 如果菌落大小在步骤 3.1 中是理想的,则进入第 1 天的分化,这需要将 hPSC 分化为前原始条纹 (APS)。
3. 使用CDM2(表1和第1.2节)作为基介质混合表2中概述的所有试剂,制备第1天APS分化介质。移液混合多次,以确保组件在介质中的均匀分布。
4. 吸气去除从镀hPSC补充的thizovivin补充mTeSR1,并用IMDM介质短暂清洗hPSC。不要用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替IMDM清洗,因为PBS缺乏钙离子(Ca2+),因此对hPSC有毒;它会破坏细胞形态学。
5. 短暂 IMDM 洗涤后,向 hPSC 添加第 1 天介质。记录将细胞重新放入 37°C 培养箱的时间和位置
6. 继续后续的分化步骤,在一天的同一时间(表2)中制备(表2),并在相应日(以24小时间隔)向细胞添加相应的分化介质(图1)。每天更换新鲜介质,即使连续几天的分化使用相同的差异化介质。在介质变化之间,用IMDM介质清洗一次细胞,以去除死细胞和先前介质成分的残留物。
7. 随着分化进展超过肝芽阶段,细胞数量增加,因此,在板的每口井中加入更多的介质,以确保分化因子和营养的量不受限制。例如,在微分的1至6天,在12口井的井中加入1 mL分化介质,但在分化后天(分化天数7至18天)添加1.5-2 mL的后续分化介质。

4. 内皮细胞和肝祖细胞通过免疫染色的表征

1. 制备阻断缓冲液:10%驴血清+0.1%Triton X100在去离子磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。
2. 准备染色缓冲液:1%驴血清+0.1%Triton X100在DPBS。
3. 从12孔板中的细胞中吸气培养基。
4. 在室温下加入4%的甲醛(DPBS)15分钟,以修复细胞,然后用DPBS清洗细胞两次。
5. 在室温下加入阻塞缓冲液1小时,以阻止和渗透固定细胞。
6. 吸气溶液,在染色缓冲液中加入稀释的原抗体。(有关抗体稀释比的材料表。
7. 在4°C下使细胞过夜。
8. 在 DPBS 中用 0.1% Triton X100 洗涤细胞。
9. 在室温下,在染色缓冲液中加入二次抗体染色1小时。(参见二次抗体稀释材料表。
10. 取出二级抗体,在室温下加入DAPI5分钟,进行核反染色。
11. 用 DPBS 中的 0.1% Triton X100 洗涤两次,以去除多余的抗体和 DAPI。
12. 使用蔡司观察者 D1 进行荧光显微镜。或者,将板储存在 4°C 中,直到进行成像。有关预期结果,请参阅图 3。

5. 通过荧光活细胞分拣(FACS)分析对肝脏祖细胞的表征

注:使用 FACS 精确量化在分化第 6 天出现的 AFP® 分化 LB 细胞的百分比。按照相同的步骤,在分化的第18天量化ALB®分化肝细胞的百分比。

1. 结合抗AFP抗体。
2. 使用R-phycoeryrin结合试剂盒在浓度(0.55微克/μL)的抗AFP抗体中加入R-phycorrrrin(参见材料表)。
   注:确保抗体经过纯化,并在不含胺的缓冲液中重组。确保标记反应中使用的抗体量必须小于 PE 的含量(即 60 μg 的抗体,PE 为 100 μg)。抗体结合不良可能导致不可靠的结果。
3. 为要标记的10μL抗体添加1μL的改性剂试剂。轻轻混合。
4. 取出 R-PE 混合物 (100 μL),并将上述混合物直接移至冻干 R-PE 材料中。
5. 将盖子放回原位,在室温下将小瓶在黑暗中站立 3 小时。
6. 孵育3小时或以上后,加入1μL的quencher试剂,用于10μL的抗体使用。偶联体可在 30 分钟后使用。
7. 将偶联抗体储存在4°C。
8. 使用 DMEM/F12 以 6 口格式清洗差异化或无差别型 hPSC。
9. 在室温下用解离剂(6孔板中1 mL/孔)短暂处理5分钟,直到细胞分离。收获和染色未分化的hPSC和分化的肝祖细胞相同,并在同一实验中并行分析,以确保抗体染色的特异性。
10. 轻轻轻点培养皿以分离细胞。使用 p1000 移液器将细胞从板中分离出来,并将细胞收集到 50 mL 锥形管中。在继续下一步之前,确保单元格已基本分离。随后,用1xDPBS缓冲液再清洗两次,以收集残余细胞。
11. 在50mL锥形管中,在+5卷1xDPBS缓冲液中稀释解散剂。用p1000移液器严格地三次三次,以确保所有细胞分离成单个细胞。
    注:必须在离心之前生成单个细胞,否则不能轻易分离。但是,不要过度三聚,因为这可能会损坏细胞的完整性。计算细胞数量,并使用推荐的细胞与抗体比率的比例,该比例以前已针对最小背景和最大信号检测进行了优化。
12. 含有细胞悬浮液在300 x g下5分钟的离心锥管,在4°C下。
13. 吸气上清液小心,不要干扰细胞颗粒。
14. 在固定/perm缓冲液中彻底悬浮细胞颗粒,产生单细胞悬浮液,并在4°C的冰上固定20分钟。此外,在这一步使用2 mL微离心管使细胞颗粒沉积在管的V形角,最大限度地减少了在输水过程中细胞损失。
15. 用1.8 mL的压气缓冲液清洗每个颗粒两次。通过移液器与 p1000 移液器混合 6 次,将细胞颗粒彻底悬浮在 perm/洗涤缓冲液中。然后,离心机,去除上清液,用1.8 mL的perm/洗涤缓冲液重复清洗过程。
16. 在perm/洗涤缓冲液中重新悬浮细胞颗粒,以便有100μL/个体染色,随后将细胞悬浮液转移到2 mL微离心管中。
    注:在抗体染色之前,必须在此步骤中生成单细胞悬浮液。细胞的聚合不会被染色,因此会混淆FACS分析。此外,在这一步使用2 mL微离心管使细胞颗粒沉积在管的V形角,最大限度地减少了在输水过程中细胞损失。
17. 在FACS缓冲液中重新悬浮细胞后,将它们与单独的2 mL管中等分(对于未染色的控制和抗体染色的样品)。
18. 在黑暗中室温下,每150,000个细胞使用抗AFP-PE0.33 μL染色30分钟。例如,对于 100 μL 单个染色,染色如下:0.33 μL a-AFP PE 和 100 μL 的 perm/洗涤缓冲液。用p200移液器重新悬浮细胞,确保均匀染色。
    注:只有移液器混合,不涡旋,因为这可能会降低蛋白质的稳定性。
19. 在1-2 m/洗涤缓冲液(1.9 mL/单个染色)中清洗、重新悬浮细胞两次,在800 x g下在4°C下将离心机5分钟。洗涤细胞,洗涤液的洗涤液的洗涤液的缓冲液不低于1-2 mL,以确保充分洗涤。
    注:只有移液器混合,不涡旋,因为这可能会降低蛋白质的稳定性。离心后,小心吸出上清液,防止细胞脱去并去除尽可能多的上清液,以尽量减少抗体的携带,并确保更完整的洗涤。
20. 在 300 μL 的 perm/洗涤缓冲液中重新悬浮每个洗涤颗粒,并通过 100 μm 过滤器将其应变到 FACS 管中,在 FACS 分析之前将大块细胞进行应变。
21. 在 PE 通道上的 FACS Aria 流细胞测定仪上分析细胞。分析每个单独的污渍至少 10,000 个事件,并通过 FSC-A/SSC-A 分析分析事件,通过在 FSC-W/FSC-H 上进行门控,然后通过 SSC-H/SSC-W 进行门控来选择单元单。

结果

在 APS 分化 24 小时后,菌落通常采用不同于未分化的菌落的形态,同时失去通常限制 hPSC 菌落的明亮边界。形态上,原始条纹细胞通常具有不规则的边界,比hPSCs传播更紧密,更紧凑-这是令人回味的上皮到中生体过渡,因为多能表细胞分化和进入原始条纹在体内。如果分化前的hPSC的菌落大小过大,将有一个明显升高的中心,由未分化的细胞组成。含有如此大团状的培养物应该被丢弃,...

讨论

这种方法使丰富的肝芽祖细胞,以及随后的肝细胞样细胞,从hPSC生成。产生丰富人类肝细胞种群的能力对于实际利用这种细胞非常重要。以前从hPSCs生成肝细胞的方法产生了含有肝脏和非肝细胞的不纯细胞群,在移植到啮齿动物体内后,除了肝^组织15外,还产生了骨骼和软骨。因此,明确抑制非肝分化对于产生可能适合各种应用的丰富肝脏种群至关重要。

值得注意的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0