יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

Summary

פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.

Abstract

הכבד מטהר חומרים מזיקים, מפריש חלבונים חיוניים, ומבצע פעילויות מטבולית מפתח, ובכך לקיים חיים. כתוצאה מכך, אי ספיקת כבד-אשר יכול להיגרם על ידי צריכת אלכוהול כרונית, צהבת, הרעלה חריפה, או עלבונות אחרים-הוא מצב חמור שיכול להגיע לדימום, צהבת, תרדמת, ובסופו של דבר מוות. עם זאת, גישות לטיפול בכישלון בכבד, כמו גם מחקרים של תפקוד הכבד ומחלות, היו מעטים בחלקם על ידי חוסר אספקה בשפע של תאי הכבד האנושיים. למטרה זו, פרוטוקול זה מפרט את הבידול היעיל של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך תאים של hepatocyte, מונחה על ידי מפת דרכים התפתחותית המתארת כיצד מצוין גורל הכבד על פני שישה צעדי בידול רצופים. על ידי מניפולציה מסלולים התפתחותיים איתות כדי לקדם בידול הכבד, כדי לדכא במפורש את היווצרות של גורלות תא בלתי רצויים, שיטה זו מפיקה ביעילות אוכלוסיות של ושלתי הכבד האנושי ניצן ו hepatocyte-תאים כמו יום 6 ו -18 של PSC בידול, בהתאמה. הדבר מושג באמצעות שליטה מדויקת באופן זמני של משעולים אותות התפתחותיים, המופעל על ידי מולקולות קטנות וגורמי גדילה במדיום תרבות ללא סרום. הבידול במערכת זו מתרחשת במונאולאיירס ומניב תאים הירופציט המבטאים אנזימים מאפיינים מאופיינים ובעלי יכולת לעבור מודל עכבר של אי ספיקת כבד כרונית. היכולת לייצר ביעילות מספר גדול של תאי כבד אנושיים בתוך מבחנה יש השלכות לטיפול בכשל בכבד, לסינון תרופות, ולמחקרים מכניסטיים של מחלות כבד.

Introduction

המטרה של פרוטוקול זה היא להבדיל ביעילות בתאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לתוך אוכלוסיות מועשר של הכבד ניצן ושלתי ו hepatocyte תאים². גישה לאספקת מוכן של הכבד האנושי ושלתי ו hepatocyte תאים להאיץ את המאמצים לחקור את תפקוד הכבד ואת המחלות יכול לאפשר טיפולים חדשים השתלת תאים לכשל בכבד^{3,4, 5}. המשך זה הוכיח מאתגרת בעבר מאז hPSCs (אשר כוללים מעובריים והמושרה תאים גזע pluripotent יכול להבדיל לכל תא-סוגי הגוף האנושי; כתוצאה מכך, היה קשה להבדיל באופן בלעדי לאוכלוסיה טהורה של סוג תא אחד, כגון תאי כבד⁶.

כדי להבדיל בדיוק hPSCs לתוך תאי הכבד, הראשון הוא קריטי להבין לא רק איך תאי הכבד מצוינים אלא גם איך התאים שאינם בתוך הכבד להתפתח. הידע של איך לפתח את התאים שאינם בכבד חשוב לדכא באופן הגיוני את היווצרות של שאינם בכבד במהלך הבידול, ובכך בלעדית המנחה hPSCs לעבר גורל הכבד². שנית, חיוני להתוות את הצעדים ההתפתחותיים שדרכם hPSCs להבדיל לקראת גורל כבד. ידוע כי hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא מרובים סוגים הידועים כרצף פרימיטיבי (APS), אנדופפיל מוחלט (DE), האחורי הקדמי (PFG) ואת הכבד ניצן ושלתי (LB) לפני יצירת התאים האלה כמו החציט (הפטיטיס). בתחילת העבודה חשף את האותות המציינים את גורל הכבד ואת האותות שדיכא את היווצרות של התאים החלופיים שאינם בכבד (כולל הקיבה, הלבלב, ואת המעיים ושלתי) בכל בחירה התפתחותית השושלת^2, מיכל ^{סבן , שמונה}.

באופן קולקטיבי, תובנות אלה העניק עלייה ללא סרום, שיטה מונאולייר להבדיל hPSCs לכיוון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעור מוחלט, האחורי הקדמי, הכבד ניצן ושלתי ולבסוף, hepatocyte כמו תאים². באופן כללי השיטה כרוכה בזריעת hPSCs במונאולייר בצפיפות מתאימה, הכנת שישה קוקטיילים של בידול מדיה (המכיל גורמי גדילה ומולקולות קטנות המתוסתים שיטות איתות התפתחותיות שונות), ו ברציפות הוספת מדיה אלה כדי לגרום לבידול במהלך 18 ימים. במהלך התהליך, אין צורך בשלב ההתיישנות של תאים. של הערה, כי שיטה זו כוללת במפורש אותות לדכא את היווצרות סוגי תאים שאינם של הכבד, גישה זו בידול¹ ביתר יעילות יוצר ושלתי כבד ותאים hepatocyte בהשוואה למצב הנמצא בידול שיטות^2,9,10,11,12. יתר על כן, הפרוטוקול המתואר בטקסט זה מאפשר את הדור מהר יותר של hepatocytes כי בסופו של דבר לבטא רמות גבוהות יותר של מקדמי שעתוק הכבד ואנזימים מאלה המיוצרים על ידי פרוטוקולים אחרים^{9,10 ,} מיכל בן ^{11 ,} . ^{שתיים עשרה}

לפרוטוקול המתואר כאן יש יתרונות מסוימים בנוגע לפרוטוקולי הבידול הנוכחיים. ראשית, היא כרוכה בבידול מונאולייר של hPSCs, שהוא מבחינה טכנית פשוטה יותר לעומת שיטות בידול תלת ממדיות, כגון אלה המסתמכים על גופים embryoid¹³. שנית, שיטה זו מנצלת מראש לאחרונה לפיה התאים הניתנים לעור מוחלט (מקודמן מוקדם לתאי הכבד) יכול להיות ביעילות ובמהירות שנוצר בתוך 2 ימים של hpsc בידול^2,7, ובכך מאפשר את הבאים ייצור הפטוציטים בטוהר מוגבר. שלישית, בהשוואות זה לצד זה, התאים האחרים המיוצרים על-ידי שיטה זו² יוצרים אלבומין נוסף ומבטאים רמות גבוהות יותר של גורמי שעתוק בכבד ואנזימים לעומת hepatocyte המיוצרים בשיטות אחרות^{10, 11,12}.

Protocol

1. הכנת בידול מדיה

הערה: עיין בטבלה של חומרים לקבלת מידע אודות היצרן בנוגע לחומרים וריאגנטים בשימוש.

1. הכנת מדיה בסיסית המוגדרת כימית (CDM)
   הערה: CDM2, CDM3, CDM4 ו-CDM5 הם מדיה המוגדרים כימית המשמשים כאמצעי הבסיס להבדיל בין hPSCs תאי הכבד בשלבים שונים. הרכב של מדיה אלה ניתן למצוא בטבלה 1.
   1. כדי להפוך CDM2 או CDM3, להכין פתרון מניות המכיל אלכוהול פוליוויניל (PVA). התמוססות 0.5 g של אבקת PVA ב 50 מ ל של Iscove שונה של בינונית של המדיום (IMDM) כדי ליצור 10 מ"ג/mL מניות PVA.
      הערה: מאז PVA אינו מתמוסס בקלות, להכין את התערובת PVA/IMDM בבקבוקון חרוט עם ערבוב רציפה ב ~ 50 ° c על משטח חימום; ערבוב ניתן להשיג בקלות באמצעות מערבב מגנטי.
   2. לאחר PVA מומס הומוגנמית ב IMDM, להסיר את הפתרון PVA מתוך משטח החימום ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. השתמש במסנן של 0.2 יקרומטר סטרילי כדי לסנן את פתרון pva.
   4. הכן את ה-CDM2 ו-CDM3 על-ידי שילוב ה-PVA המסונן משלב 1.1.1 ורכיבים שונים שנקנו באופן מסחרי כמתואר בטבלה 1 ובטבלת החומרים. השתמש ביחידות סינון של 0.2 יקרומטר, כדי לסנן את כל המדיה.
      הערה: ניתן לאחסן בסיס בסיסי ב-4 ° c אך לא יותר מחודשיים.
   5. הכן את מדיית הבסיס הנותרת CDM4 ו-CDM5 לאחר הטבלה 1.
2. הכנת בידול מדיה
   1. להכנת פתרונות מניות למולקולות קטנות ולגורמי גדילה, מרכיבים אותם מחדש לפי המלצות היצרנים. לאחסון, סדרת מחלקים לתוך צינורות סטרילי כדי להפחית מחזורי הפשרת הקפאת ולשמור ב-20 ° c או כמומלץ.
      הערה: הרכב בידול מדיום לשימוש בשלבי בידול שונים מתואר בטבלה 2 ובשלבים הבאים.
   2. כדי להכין את מדיום בידול, תחילה להפשיר את מולקולות קטנות קפוא ו/או גורמי גדילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להוציא את הכמות הדרושה של המדיום הבסיסי. אחרון, להכין את התקשורת בידול סופי על ידי הוספת מולקולות קטנות שצוינו וגורמי גדילה למדיום הבסיסי בריכוזים המתאימים (שולחן 2).
      הערה: מדיום בידול מוכן לשימוש באופן אידיאלי באותו יום; אחרת ניתן לאחסנו ב -4 ° c ולהשתמש בו תוך שלושה ימים.
   3. באמצעות טיפ פיפטה, לערבב את בינוניות בידול מספר פעמים כדי להבטיח תוספי תזונה מופץ באופן הומוגנטי לפני הוספת המדיום לתאים (למשל, להוסיף 1 מ ל של בידול בינונית לכל טוב של הצלחת 12-טוב.)

2. זרע hPSCs על צלחות בצפיפות מוגדרת לבידול

1. תאי הפרווה התרבות פלסטיק שישמשו לזריעה עם hPSCs.
   1. הפשרת המטריצה (למשל, Geltrex) ב -4 ° c בלילה לפני יום השימוש.
   2. למחרת, לדלל את מטריקס 1:100 על ידי הוספת 500 μL של המטריצה לתוך 50 מ ל של בינונית הנשר השונה של העיט שונה למחצה (DMEM)/F12. מאחר והמטריקס הוא הידרוג'ל שאינו מתכלה בחשיפה לטמפרטורת החדר, כשאתה עובד עם המטריקס, תמיד שומר על הצינורות והמדיה של המטריקס בקרח.
   3. הערה: המטריצה התפרקה 1:100 ב Dמאמ/F12 ניתן לאחסן ב 4 ° צ' אבל יש להשתמש בתוך 2 חודשים.
   4. כדי לחלוק לוחית תרבות עם המטריצה, פיפטה את המטריצה המדוללת למספר הדרוש של בארות באמצעות כמות מספקת בלבד של פתרון מטריצה כדי לכסות את פני השטח של הבאר (למשל, להוסיף 0.5 mL של מטריצה אחד טוב של הצלחת 12-טוב או 1 מ ל אחד טוב של 6- צלחת הבאר). במידת הצורך, טלטל את הצלחת בעדינות כדי לוודא שפתרון המטריצה כיסה במלואה את החלק התחתון של הבאר.
   5. השאירו את הצלחת מצופה המטריקס בחממה 37 ° c לפחות 60 דקות. בטמפרטורה זו, המטריקס מדבר ליצירת. סרט דק בתחתית הבאר
   6. הערה: לוחות מצופה מטריקס ניתן לשמור בחממה 37 ° c ובשימוש בתוך 3 ימים כל עוד המטריצה לא התייבש.
   7. לאחר שהוא מגיע לזריעת הבארות עם hPSCs.
2. הפסעות וזריעת צלחות מצופות באמצעות hPSCsNOTE: סוכן הדיסוציאציה מכיל אנזימים המשתפשים תאים וחשוב להשאיר את hPSCs בסוכן הדיסוציאציה במשך זמן קצר ככל האפשר.
   1. כדי הזרע מצופה מטריקס לוחות התרבות עם hPSCs לפני בידול, לגדול מובחן hPSCs כדי > 70% שליטה מסחרית הזמינים mTeSR1 בינונית (לוח חומרים) על פי פרוטוקול של היצרן. זה קריטי למעבר hPSCs לפני שהם הופכים מלאה לחלוטין, כמו hPSCs עשוי להבדיל באופן ספונטני במפגש הגבוה.
      הערה: hPSCs חייב להיות karyotyped כדי להבטיח כי אין חריגות כרומוזום לפני השימוש בהם עבור ניסויים. HPSCs המשמש את הפרוטוקול בידול היו שמרו במדיה mTeSR1 ו החוצה כגושים עם EDTA כדי למזער את החריגות karyotypic. Karyotypically כלל-hPSCs חריגים לא צריך לשמש לבידול, כפי שהם עשויים להתרבות באופן חריג במהירות; לפיכך, הצפיפות התאית המומלצת כאן אינה מתאימה לתאים בדרך כלל-חריגים.
   2. כדי זרע hPSCs עבור בידול, מתנאת mTeSR1 מן ברובו-confluent לוחית התרבויות ולהוסיף מסחרית לקנות סוכן דיסוציאציה (טבלת חומרים) כדי לנתק את hPSCs, באמצעות סוכן דיסוציאציה מספיק רק כדי לכסות את פני השטח של ה טוב או תבשיל שבו התאים גדלים (למשל, להוסיף 0.5 mL של סוכן הדיסוציאציה לכל טוב של הצלחת 12-באר, 1 מ"ל לכל טוב של 6-טוב צלחת או 3 מ"ל לכל 10 ס מ צלחת).
   3. דגירה hPSCs בסוכן הדיסוציאציה ב 37 ° c עבור 5 דקות או עד כמה מושבות להתחיל להתנתק. הקש בעדינות על החלק התחתון של הבאר/הלוח מספר פעמים; לאחר מספר דקות של דיסוציאציה, רוב מושבות hPSC צריך לבוא בחופשיות ההשעיה.
   4. כדי להוציא hPSCs הנתק מהצלחת, להוסיף 2 מ ל/טוב של Dמאמ/F12 אם עובד עם צלחת 6-הבאר (או 1 mL/גם אם עובד עם צלחת 12-באר) כדי לדלל את סוכן הדיסוציאציה. השתמש בפיפטה באורך 5 מ ל בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשטוף את כל התאים מהמשטח של הבאר; לאסוף מושעה תאים בודדים בשפופרת חרוט 50 mL. לשטוף את הצלחת פעם שנייה עם אותו נפח של Dמאמ/F12 כדי להבטיח שחזור של כל hPSCs.
   5. כדי 50 mL חרוט מכיל את התאים, להוסיף Dמאמ/F12 כדי לדלל את הנפח המקורי של סוכן הדיסוציאציה על ידי 1:5-1:10 (למשל, אם הנפח המקורי של סוכן הדיסוציאציה היה 1 מ ל, להתאים את הנפח הכולל של הבולם הנייד 10 mL עם DMEM/F12 לדלל סוכן הדיסוציאציה בשעה 1:10)
   6. צנטריפוגה את hPSCs שנאסף ב-50 mL שפופרת חרוט ב 350 x g עבור 3 דקות ב 4 ° צ' כדי תאים גלולה.
   7. בזמן מחכה התאים כדי גלולה, מhPSCS מטריצה מן הצלחת שבה הזרע יהיה שנזרע. הבא, להוסיף כמויות מספיקות של mTesR1 בתוספת 1 μM של מסחרית השיגה thiazovivin (מעכבי רוק תרופתי) כדי הנמען בארות לכסות אותם (למשל, להוסיף 0.5 mL mTeSR1 לכל טוב של הצלחת 12-טוב או 1 mL של mTeSR1 לכל טוב של צלחת 6-באר).
      הערה: Thiazovivin בריכוז נמוך כלול בשלב זה כדי לשפר את ההישרדות התא היחיד ומכאן את צפיפות הזריעה הבאה של hPSCs.
   8. לאחר תפרידו hPSCs, בזהירות מזהם את supernatant, עוזב את הhPSCs בתחתית הצינור החרוט. Supernatant מכיל סוכן דיסוציאציה אשר לעכב את הדבקה הבאים של hPSCs ולכן, חשוב לבשל את הרוב הגדול של supernatant לפני שתמשיך.
   9. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית בmTeSR1 עם 1 μM של thiazovivin. עם p1000 tte, בעדינות קצוצות 2-3 פעמים כדי להשעות באופן שווה את הגלולה לתא לתוך השעיה תא יחיד. לא מעל-triturate את הגלולה התא כמו כוח מכני מוגזם נזק hPSCs ולהוביל להישרדות התא המסכן.
   10. לאחר השעיית מחדש של hPSCs, הפיפטה מיד 10 μL של ההשעיה לתוך המטמטר ולספור את מספר התאים. חשוב להתאים את התאים לספירה מהר ככל האפשר, כמו כוח הכבידה יוביל hPSCs באופן טבעי להתיישב לתוך החלק התחתון של שפופרת 50 mL, אשר יהיה לבלבל ספירת תאים מדויקת.
   11. להתאים את עוצמת הקול של hPSCs מחדש עם thiazovivin-שיושלם mTeSR1 כדי להשיג את הריכוז הרצוי התא לציפוי. לדוגמה, לאחר התאמת עוצמת הקול של hPSCs מחדש, להוסיף 0.5 mL של השעיית התא לתאים 160000-250000 הזרע לתוך כל טוב של הצלחת 12-באר, ובכך להשיג נפח כולל של 1 mL בכל באר (0.5 mL של מדיה נוספה היטב בשלב 2.2.7). אם נעשה שימוש בבארות גדולות או קטנות יותר, שינוי קנה מידה של מספרי תאים/אמצעי אחסון מדיה למעלה או למטה בהתאם.
       הערה: חשוב לזרע hPSCs על צפיפות התא שצוין. מדי-confluent hPSCs לא להבדיל ביעילות תחת-confluent hPSCs לא ישרוד היטב במהלך בידול.
   12. טלטל את הצלחת בתבנית צולבת (משמאל, לאחר מכן ימינה; קדימה, ואז אחורה) מספר פעמים כדי לוודא שתאים מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת/טוב. אל מערבולת את הצלחת בתנועה מעגלית, כמו התאים יהיה ליישב במרכז הצלחת/טוב. בדרך כלל, hPSCs יתחיל לדבוק פני השטח של הבאר בתוך ~ 3-30 min. אפשר לתאים לצמוח לפחות 24 שעות לפני התחלת בידול.

3. הבידול של hPSCs לתוך תאים אנדועורי והכבד ושלתי

1. לאחר hPSCs מצופה לפחות 24 שעות (כמתואר בשלב 2.2.12), לפני שתמשיך עם בידול, לבדוק את המבנה של התאים תחת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, עם דגש ספציפי על קוטר וצפיפות של מושבות hPSC מצופה.
   הערה: באופן אידיאלי, הגושים צריכים להיות מרווחים בקלות ובגודל המתאים וצפיפות בכל רחבי הבאר לפני שלב 3.2. גדול (כ > 400 μm) או מושבות קטנות (כ < 200 μm) של hPSCs אינם שמישים לבידול (איור 4). אותות הבדלה לא יפעלו באופן שווה ברחבי המושבות hPSC גדולים, המובילים לבידול לא יעיל. מושבות כי הם קטנים מדי לא לשרוד היטב במהלך 3 הימים הראשונים של הבידול hPSC בפרוטוקול זה בידול. אם הצפיפות של hPSCs הזרע נכון, מושבות hPSC לעתים קרובות טופס "גשרים" של תאים ביניהם לבין המפגש הכולל יהיה ~ 30-50% לפני הוספת יום 1 בידול בינוני (איור 4).
2. אם גדלי המושבה הם אידיאליים בשלב 3.1, המשך ליום 1 של בידול, אשר כרוך בבידול של hPSCs לתוך פס פרימיטיבי קדמי (APS).
3. להכין יום 1 APS בידול בינוני על ידי ערבוב כל ריאגנטים המתואר בטבלה 2 באמצעות Cdm 2 (טבלה 1 וסעיף 1.2) כמדיום הבסיס. Pipet לערבב מספר פעמים כדי להבטיח אפילו הפצה של הרכיבים במדיה.
4. מנושף כדי להסיר את thiazovivin שיושלם mTeSR1 מן hPSCs מצופה ולשטוף בקצרה hPSCs עם מדיה IMDM. אין לשטוף עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) במקום IMDM, כמו PBS חסר יוני סידן (Ca^{2 +}) ולכן הוא רעיל hPSCs; זה יהיה לשבש את מורפולוגיה התא.
5. לאחר שטיפת IMDM קצרה, להוסיף יום 1 בינוני hPSCs. הקלט את הזמן והמקום תאים בחזרה לחממה 37 ° c
6. המשך בשלבי הבידול הבאים על-ידי הכנת (טבלה 2) והוספת המדיום בידול בהתאמה לתאים בימים המתאימים (במרווחים של 24 שעות) של בידול סביב אותו הזמן של היום (איור 1). החלף עם מדיה טרייה מדי יום, גם אם ימים רצופים של בידול להשתמש באותו מדיה בידול. בין שינויי מדיה, שטוף תאים פעם אחת עם מדיית IMDM כדי להסיר תאים מתים ושארית של רכיבים בינוניים קודמים.
7. כמו בידול מתקדם מעבר לשלב ניצן הכבד, מספרי התאים להגדיל ולכן, להוסיף מדיה יותר לכל הטוב של הצלחת כדי להבטיח את כמות גורמי בידול וחומרים מזינים לא מגביל. לדוגמה, להוסיף 1 mL בידול בינוני לכל טוב של 12-ובכן בתחילה בימים 1 עד 6 של בידול אבל להוסיף 1.5-2 מ ל של מדיה בידול הבאים בימים מאוחרים יותר של בידול (ימים 7 עד 18 של בידול).

4. אפיון תאים אנדועורי והכבד ושלתי על ידי כתמים חיסוני

1. הכנת מאגר חוסם: 10% חמור סרום + 0.1% טריטון X100 ב מלוחים באגירה של פוספט (DPBS).
2. הכן מאגר כתמים: 1% הנסיוב החמור + 0.1% טריטון X100 ב DPBS.
3. מרוב מדיום מתאים. בצלחת של 12 ומטה
4. להוסיף 4% פאראפורמלדהיד (ב DPBS) עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן תאים ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS.
5. הוסף מאגר חסימה עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לחסום ולחלחל לתאים הקבועים.
6. מדלל את הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן העיקרי מדולל במאגר מכתים. (ראה טבלת חומרים לדילול של נוגדנים).
7. הכתם את התאים לילה ב 4 ° c.
8. לשטוף תאים שלוש פעמים עם 0.1% טריטון X100 ב DPBS.
9. הוסף כתם נוגדן משני במאגר מכתים עבור 1 h בטמפרטורת החדר. (ראה טבלת חומרים לדילול נוגדנים משניים.)
10. הסר את הנוגדן המשני והוסף DAPI עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע כתמים גרעיניים.
11. לשטוף פעמיים עם 0.1% טריטון X100 ב-DPBS כדי להסיר נוגדן עודף DPBS.
12. התנהלות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית עם Zeiss משקיף D1. לחילופין, תוכלו לאחסן את צלחת החנות ב -4 מעלות צלזיוס עד לביצוע ההדמיה. לקבלת תוצאות צפויות, ראה איור 3.

5. אפיון של הכבד ושלתי על ידי תא המופעל פלואורסצנטית-מיון (FACS) ניתוח

הערה: השתמש FACS כדי בדיוק לכמת את אחוז AFP + הבדיל תאים LB הצצים ביום 6 של בידול. בצע את אותם צעדים כדי לכמת את אחוז ה-ALB + מובחנים hepatocytes ביום 18 של בידול.

1. המשלים נוגדן אנטי AFP.
2. להוסיף R-phycoerythrin כדי נוגדן נגד AFP בריכוז של (0.55 μg/μL) באמצעות ערכת הקונקוארירין R-phyco, (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ודא שהנוגדנים מטוהרים ומחדש במאגרים שאינם מכילים amines. ודא כי כמות הנוגדן המשמש תגובת תיוג חייב להיות פחות מהסכום של PE (כלומר, 60 μg של נוגדן עם 100 μg של PE). בניין מסכן של נוגדנים עלול. להוביל לתוצאות לא אמינות
3. הוסף 1 μL של צירוף משנה עבור 10 μL של נוגדן שניתן לתייג. מערבבים בעדינות.
4. הסר את שילוב ה-R-PE (100 μL) ופיפטה את התערובת שלעיל ישירות לחומר ה-R-PE.
5. הניחו את הכובע בחזרה והשאירו את המבחנה עומדת במקום 3 בחושך בטמפרטורת החדר.
6. לאחר הדגירה עבור 3 שעות או יותר, להוסיף 1 μL של כמובן מגיב עבור 10 μL של נוגדנים בשימוש. ניתן להשתמש במשלים לאחר 30 דקות.
7. החנות נוגדן מצומדת ב -4 ° c.
8. לשטוף הבדיל או מובחן hPSCs ב 6-היטב בפורמט עם Dמאמ/F12.
9. התייחס בקצרה עם סוכן הדיסוציאציה (1 mL/גם בצלחת 6-באר) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עד שהתאים מתנתק. הקציר והכתם הן מובחן hPSC והבדיל בתאי הכבד תאים זהים ולנתח במקביל באותו ניסוי כדי להבטיח ספציפיות של כתמי נוגדנים.
10. הקש בעדינות על צלחת פטרי כדי לנתק תאים. השתמש בפיפטה p1000 כדי לנתק את התאים מהצלחת ולאסוף תאים בשפופרת חרוט 50 mL. ודא שהתאים מנותקים בעיקר לפני שתמשיך בשלב הבא. לאחר מכן, לשטוף בארות פעמיים יותר עם מאגר 1xDPBS לאסוף תאים שיורית.
11. בצינור החרוט 50mL, לדלל את הסוכן הדיסוציאציה ב ~ 5 כרכים של מאגר DPBS 1x. Triturate בקפדנות 3-4 פעמים עם p1000 הצינורות כדי להבטיח את כל התאים הם הנתק לתוך תאים בודדים.
    הערה: הכרחי ליצור תאים בודדים לפני הצנטריפוגה או הגושים, לאחר מכן לא ניתן לנתק בקלות. עם זאת, לא מעל triturate זה עלול לגרום נזק לשלמות התא. ספור את מספר התאים והשתמש בחלק המומלץ של תאים ליחס הנוגדן, שכבר עבר אופטימיזציה עבור רקע מינימלי וזיהוי אותות מרביים.
12. צינורית צנטריפוגה המכילה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
13. מרוב דאגה לא להפריע. לגלולה הסלולרית
14. השהה מחדש את כדורית התאים באופן יסודי במאגר קיבוע/סלסול כדי ליצור השעיה תא בודד ולתקן על הקרח ב -4 ° c עבור 20 דקות. הערה כדי להעביר לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL. יתר על כן, שימוש של 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה בשלב זה מאפשר את הגלולה תא להפקיד בצורת V-בפינה של הצינור, מזעור אובדן התאים במהלך שוטף.
15. לשטוף כל גלולה עם 1.8 mL של סלסול/לשטוף מאגר פעמיים. השהה מחדש את כדורית התאים באופן יסודי ב סלסול/לשטוף מאגר על ידי פיפטה ערבוב 6 פעמים עם p1000. אז, צנטריפוגה, להסיר supernatant ולחזור על תהליך השטיפה עם 1.8 mL של סלסול/לשטוף מאגר.
16. השהה מחדש את כדורית התאים בתוך סלסול/לשטוף מאגר כך יהיה 100 μL/כתם בודד ולאחר מכן להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
    הערה: זה הכרחי ליצור השעיה תא בודד בשלב זה לפני כתמים נוגדן. אגרגטים של תאים לא יהיה מוכתם וכך יהיה לבלבל את ניתוח FACS. יתר על כן, שימוש של 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה בשלב זה מאפשר את הגלולה תא להפקיד בצורת V-בפינה של הצינור, מזעור אובדן התאים במהלך שוטף.
17. לאחר השעיית תאים מחדש במאגר ה-FACS, מחלקים אותם לצינורות בודדים מ-mL (הן מכתמים בלתי מוכתמים והן מדגימות נוגדנים מוכתמות).
18. כתם עם anti-AFP-PE 0.33 μL לכל 150,000 תאים עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לדוגמה, עבור כתם בודד 100 μL, כתם כדלקמן: 0.33 μL של a-AFP PE ו 100 μL של מאגר סלסול/לשטוף. להשעות את התאים עם p200 היטב כדי להבטיח אפילו כתמים.
    הערה: רק פיפטה-מערבבים ולא מערבולת כי זה עשוי להפחית את יציבות החלבון.
19. לשטוף, להשעות מחדש את התאים פעמיים ב 1-2 mL של סלסול/לשטוף מאגר (1.9 mL/בודדים כתם) ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לשטוף תאים עם לא פחות מ 1-2 mL של פרם/לשטוף מאגר כדי להבטיח כביסה מספקת.
    הערה: רק פיפטה לערבב ולא מערבולת כי זה עשוי להפחית את יציבות החלבון. לאחר תפרידו, מטפי את supernatant בקפידה כדי למנוע מתאים לבטל לינה ולהסיר כמו supernatant הרבה ככל האפשר כדי למזער את הנוגדן לבצע-over ולהבטיח שטיפת מלאה יותר.
20. השהה מחדש כל גלולה שטף ב 300 μl של סלסול/לשטוף מאגר ומסננים אותו דרך מסנן 100 יקרומטר לתוך צינור facs כדי להתאמץ גושים גדולים של תאים לפני ניתוח facs.
21. לנתח את התאים בזרם האריה FACS הזרימה cy, בערוץ PE. לנתח מינימום של 10,000 אירועים עבור כל כתם בודד, ואירועים ניתוח על ידי המוסריות של FSC-A/מדינת-מדינת-באמצעות ניתוח, בחר את תא הסינגטים על-ידי בדיקה על FSC-W/FSC-H ולאחר מכן מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-וואט-W.

תוצאות

לאחר 24 שעות של בידול APS, המושבות בדרך כלל לאמץ מורפולוגיה שונה מאשר מושבות מובחן במקביל עם אובדן של גבול בהיר כי בדרך כלל להקיף המושבות hPSC. מורפולוגית, בתאי פס פרימיטיבי בדרך כלל יש גבולות משונן והם התפשטה יותר ופחות קומפקטי מ hPSCs-זה מעורר המעבר אפיתל-to-mesenchal כמו בתאי הפיצוץ...

Discussion

שיטה זו מאפשרת את הדור של אוכלוסיות מועשר של ושלתי הכבד ניצן, ולאחר מכן התאים של hepatocyte, מ hPSCs. היכולת ליצור אוכלוסיות מועשר של תאי כבד אנושיים חשובה לניצול מעשי של תאים כאלה. השיטות הקודמות להפקת hepatocytes מ hPSCs הניבו אוכלוסיות תאים טמא המכיל הן הכבד והן תאים שאינם בכבד, על השתלת לתוך מכרסמים, הנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2 μm pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco or Millipore	Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Knockout serum replacement	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	P8136
Transferrin	Sigma-Aldrich	10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R&D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R&D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Human BMP4	R&D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R&D	295-OM
Dexamethasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Cayman chemicals	16457
Human recombinant Insulin	Sigma-Aldrich	11061-68-0