تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Summary

وراثيا المرمزة Ca^{2 +} المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في الموقع كيف Ca^{2 +} تصوير تتم. إلى أقصى حد ممكن لاستعادة البيانات من هذه التسجيلات، مطلوب تحليل Ca^{2 +} إشارات مناسبة. البروتوكولات في هذه الورقة تيسير التحديد الكمي ل Ca^{2 +} إشارات سجلت في الموقع باستخدام رسم الخرائط الزمانية المكانية والتحليل القائم على الجسيمات.

Abstract

Ca^{2 +} تصوير الخلايا المعزولة أو أنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة وكثيراً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca^{2 +} إشارات. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات حول الأحداث الأساسية. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca^{2 +} إشارات مثل تواتر ومدة، ونشر، والسرعة والسعة قد توفر بعض المعلومات البيولوجية اللازمة للإشارات داخل الخلايا. عالية الاستبانة Ca^{2 +} التصوير عادة النتائج في الحصول على ملفات البيانات الكبيرة التي تستغرق وقتاً طويلاً للعملية من حيث ترجمة المعلومات التصوير إلى بيانات قابلة للقياس الكمي، وهذه العملية يمكن أن تكون عرضه للخطأ البشري والتحيز. تحليل Ca^{2 +} الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة تعسفاً للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). وهذا النهج يتجاهل الكثير من المعلومات الهامة إرسال الإشارات الواردة في فوف. وهكذا، من أجل تحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الدقة التي تم الحصول عليها مع Ca^{2 +}الأصباغ أو أوبتوجينيتيك Ca^{2 +} التحليل المكاني والزماني التصوير، والمناسبة من Ca^{2 +} الإشارات مطلوب. وسيصف البروتوكولات المبينة في هذه الورقة كيف يمكن الحصول على حجم كبير من البيانات من Ca^{2 +} تصوير تسجيلات لتيسير تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca^{2 +} الإشارات المسجلة من الخلايا باستخدام مزيج من خريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca^{2 +} الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca^{2 +} إشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (ICC)، استخدام جيسيس.

Introduction

Ca^{2 +} هو رسول داخل الخلايا في كل مكان التي تسيطر على مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، مثل العضلات انكماش^1،2،³من الأيض، خلية انتشار^{3،4، 5}، والحث على إطلاق سراح العصبي في الأعصاب الطرفية^6،7، وتفعيل النسخ العوامل في النواة. ⁷ داخل الخلية Ca^{2 +} إشارات غالباً ما تتخذ شكل ارتفاعات عابرة في كاليفورنيا سيتوسوليك^{2 +}، وهذه يمكن أن تكون عفوية أو تنشأ من التحفيز مؤثر تبعاً لنوع الخلية⁸. المكانية، الزمانية وكثافة معلمات المضمنة إلى Ca^{2 +} إشارات مثل التردد والمدة، ونشر، والسرعة والسعة ويمكن توفير المعلومات البيولوجية المطلوبة ل التنبيه داخل الخلايا^{5، 7 , 9}-هيولى Ca^{2 +} إشارات يمكن أن تنجم عن تدفق Ca^{2 +} من الفضاء خارج الخلية أو عن طريق Ca^{2 +} الإصدار من هيولى (ER) عبر قنوات Ca^{2 +} الإصدار مثل مستقبلات ريانوديني (ريرس) ومستقبلات اينوزيتول-ثلاثي-الفوسفات (IP₃Rs)¹⁰. ريرس والملكية الفكرية₃روبية قد تسهم على حد سواء لتوليد إشارات Ca^{2 +} ويمكن أن يؤدي فتح هذه القنوات، الذي جنبا إلى جنب مع مختلف Ca^{2 +} تدفق آليات منسقة في عدد ضخم من Ca^{2 +} يشير إلى أنماط أن تتشكل بالأرقام وفتح احتمال Ca^{2 +} قنوات تدفق، التعبير الشخصية من Ca^{2 +} الإفراج عن القنوات، القرب بين Ca^{2 +} تدفق والإفراج عن القنوات، والتعبير والتوزيع من كاليفورنيا^{2 +} البروتينات امتصاص والنتوء. Ca^{2 +} إشارات قد تتخذ شكل موحد، طويلة الأمد، ذبذبات عالية الكثافة العالمية التي قد تستمر لعدة ثوان أو دقائق حتى، نشر داخل الخلايا وبين الخلايا Ca^{2 +} الأمواج التي قد تعبر المسافات داخل الخلايا ما يزيد على 100 ميكرومتر^10،11،،من^1213،14،،من¹⁵¹⁶، أو المزيد من الأحداث موجزة، ومكانيا مترجمة مثل Ca^{2 +} الشرر و Ca^{2 +} نفث التي تحدث على عشرات الجداول الزمنية ميلي ثانية واحدة، وانتشار أقل من 5 ميكرومتر^17،،^،من^1819،20.

مجهر فلوري قد استخدمت على نطاق واسع لرصد Ca^{2 +} الإشارات في الخلايا المعزولة ومثقف وفي أنسجة سليمة. وتقليدياً، هذه التجارب انطوت على استخدام الفلورية Ca^{2 +} المؤشرات، راتيوميتريك والأصباغ غير راتيوميتريك مثل Fura2 أو Fluo3/4 أو Rhod2، من بين آخرين ^21،،من²²²³. هذه المؤشرات قد صممت لتكون نفاذية أغشية الخلايا وثم أصبحوا محاصرين في الخلايا بالانقسام من جماعة إستر عبر esterases الذاتية. ملزمة من Ca^{2 +} لمؤشرات ترابط عالية تسبب التغييرات في الأسفار عندما كانت مضاءة الخلايا والأنسجة بالمناسبة الأطوال الموجية للضوء. استخدام الخلية نفاذية Ca^{2 +} مؤشرات تتعزز فهمنا من Ca^{2 +} إشارات في الخلايا الحية ويسمح القرار المكانية والتحديد الكمي لهذه الإشارات التي لم يكن من الممكن بالمعايرة Ca^{2 +} إشارات من خلال وسائل أخرى، مثل الكهربية. ومع ذلك، قد Ca^{2 +} المؤشرات التقليدية العديد من القيود، مثل فوتوبليتشينج التي تحدث على مدى فترات ممتدة من تسجيل²⁴. في حين أحدث Ca^{2 +} مؤشر الأصباغ مثل Cal520/590 قد تحسنت كثيرا إشارة إلى نسب الضوضاء والقدرة على اكتشاف المحلية Ca^{2 +} إشارات²⁵، قضايا مع فوتوبليتشينج يمكن لا تزال مصدر قلق لبعض المحققين ^2627،،28. فوتوبليتشينج متسرعة كما يقيد التكبير، المعدل للحصول على الصور، والقرار التي يمكن استخدامها للتسجيلات، كما تتطلب زيادة قوة موضوعية ومعدلات أعلى للحصول على الصور زادت كثافة الضوء الإثارة التي يزيد من فوتوبليتشينج.

هذه القيود التقليدية Ca^{2 +} مؤشر الأصباغ تتفاقم عند تسجيل Ca^{2 +} إشارات في الموقع، على سبيل المثال عند تسجيل داخل الخلية Ca^{2 +} إشارات من أنسجة سليمة. بسبب المشاكل المذكورة أعلاه، التصور Ca^{2 +} إشارات في الموقع باستخدام الخلية نفاذية Ca^{2 +} مؤشرات تم محدودة إلى تضخم منخفضة الطاقة وتخفيض المعدلات لالتقاط الصور، ويقيد قدرة المحققين لتسجيل و تحديد Ca^{2 +} إشارات سوبسيلولار المقيدة زمنياً أو مكانياً. وبالتالي، كان من الصعب التقاط وتحليلها، ونقدر تعقيد المكانية والزمانية Ca^{2 +} الإشارات، التي يمكن أن تكون هامة في توليد الاستجابات البيولوجية المطلوبة، كما هو مبين أعلاه. تحليل Ca^{2 +} الإشارات من الخلايا في الموقع يعتمد عادة على قياسات كثافة بسيطة من مناطق مختارة للفائدة (ROI) ضمن مجال رؤية (FOV). يمكن تحيز الاختيار التعسفي لعدد وحجم وموضع رويس، تعتمد على أهواء الباحث، شدة النتائج المتحصل عليها. كذلك التحيز المتأصل بتحليل العائد على الاستثمار، هذا النهج يتجاهل الكثير من أهمية مما يشير إلى المعلومات التي تتضمنها فوف، كدينامية Ca^{2 +} الأحداث داخل تعسفاً المختار يتم تحديد العائد على الاستثمار للتحليل. وعلاوة على ذلك، فشل تحليل رويس لتقديم معلومات عن الخصائص المكانية من Ca^{2 +} إشارات لاحظ. على سبيل المثال، قد لا يكون ممكناً للتمييز بين ارتفاع Ca^{2 +} الناتجة نشر Ca^{2 +} موجه وكاليفورنيا مترجمة عالية^{2 +} الإفراج عن الحدث من تبويبات Ca^{2 +} إشارات داخل العائد على الاستثمار.

ظهور المرمزة وراثيا Ca^{2 +} المؤشرات (جيسيس) قد تغيرت تغيرا جذريا في كيف يمكن أن يكون Ca^{2 +} تصوير المؤداة في الموقع^29،30،،من^3132،33 . وهناك العديد من المزايا لاستخدام جيسيس أكثر الأصباغ. وربما الأكثر أهمية هو أن التعبير عن جيتشي يمكن أن يؤديها بطريقة محددة في خلية، مما يقلل من تلوث الخلفية غير المرغوب فيها من الخلايا لا فائدة. ميزة أخرى جيسيس فوق Ca^{2 +} المؤشرات التقليدية أن فوتوبليتشينج انخفاض (كما الأسفار والتبعية فوتوبليتشينج فقط يحدث عندما الخلايا تكون نشطة)، بالمقارنة مع عينات محملة بصبغة، لا سيما في عالية التكبير، والمعدلات العالية للصورة التقاط³⁴. وهكذا، التصوير مع جيسيس، مثل سلسلة جكامب من أجهزة استشعار أوبتوجينيتيك، يتيح للمحققين القدرة على تسجيل موجز، المترجمة دون الخلوية Ca^{2 +} إشارات في الموقع والتحقيق Ca^{2 +} الإشارات في الخلايا داخل بهم بيئات الأصلي الذي لم يكن ممكناً سابقا. لتحقيق أقصى قدر من استرداد المعلومات من هذه التسجيلات عالية الاستبانة، التحليل المكاني والزماني المناسب من Ca^{2 +} الإشارات مطلوب. تجدر الإشارة إلى أنه بينما يمكن أن توفر جيسيس بعض مزايا واضحة، قد كشفت الدراسات الأخيرة أن Ca^{2 +} تصوير يمكن أن يتم بنجاح من إعداد كبيرة من السكان من مختلف الطبقات الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية في وقت واحد باستخدام التقليدية Ca^{2 +} المؤشرات التي لا يتم ترميز وراثيا في الحيوان³⁵. هذا النهج المستخدمة immunohistochemistry المخصصة بعد الكشف عن عدة فئات مختلفة من الخلايا العصبية يطلقون النار على الترددات العالية في رشقات نارية متزامنة، وتجنب احتمال أنه قد يكون تدخل التعديلات الوراثية للحيوان مع الفسيولوجية سلوك المحقق يسعى إلى فهم^35،36.

تيسير البروتوكولات المبينة في هذه الورقة تحليل أكثر اكتمالا والتحديد الكمي ل Ca^{2 +} إشارات مسجل من الخلايا في الموقع باستخدام مزيج من الخريطة الزمانية المكانية (STM)-استناداً إلى التحليل والتحليل القائم على الجسيمات. كما وصف البروتوكولات كيف مختلف أنماط Ca^{2 +} الإشارات الملحوظة في خلية مختلفة يمكن تحليل السكان في الموقع المناسب. للتوضيح، الطريقة التي ستدرس Ca^{2 +} الإشارات في عدد سكان متخصصة من الخلايا في الأمعاء الدقيقة، الخلايا فراغي من كيال (المحكمة الجنائية الدولية). المحكمة الجنائية الدولية هي خلايا متخصصة في الجهاز الهضمي (غي) أن المعرض الحيوية داخل الخلايا Ca^{2 +} إشارات، كما تصور استخدام الفئران معربا عن جكامبس^37،،من^{3839،40، ،}من ⁴¹⁴². Ca^{2 +} العابرين في المحكمة الجنائية الدولية المرتبطة بالتنشيط من Ca^{2 +}-تنشيط قنوات (المشفرة بواسطة Ano1) التي تعتبر مهمة في تنظيم استثارة العضلات الملساء المعوية الخلايا (سمكس)^{43، Cl– ،}من ⁴⁴⁴⁵. وهكذا، دراسة Ca^{2 +} إشارات في المحكمة الجنائية الدولية أمر أساسي لفهم حركية الأمعاء. الأمعاء موريني يقدم مثالاً ممتازا لهذه التظاهرة، كما أن هناك فئتين من المحكمة الجنائية الدولية أن تكون مفصولة تشريحيا ويمكن تصور بشكل مستقل: أنا) المحكمة الجنائية الدولية الموجودة في المنطقة الواقعة بين العضلات الملساء الطولية والدائرية طبقات، المحيطة الضفيرة myenteric (المحكمة الجنائية الدولية-بي). هذه الخلايا تعمل كخلايا تنظيم ضربات القلب، وتوليد النشاط الكهربائي المعروف بموجات بطيئة^46،47،،من⁴⁸⁴⁹؛ ثانيا) المحكمة الجنائية الدولية أيضا تقع بين ضفيرة غنية بالمحطات الطرفية للخلايا العصبية الحركية (الضفيرة العضلية العميقة، وبالتالي المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث). هذه الخلايا تعمل كوسطاء ردود على كبيرة الحركية المعوية^37،39،،من⁴⁰⁵⁰. بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تختلف شكلياً Ca^{2 +} إشارات سلوكهم تختلف جذريا على إنجاز المهام المحددة. المحكمة الجنائية الدولية-بلدي النجمية في الشكل وتشكل شبكة خلايا المترابطة عن طريق الفجوة تقاطعات^51،52. Ca^{2 +} إشارات في بيان المحكمة الجنائية الدولية-بلدي مختصرة ومترجمة مكانياً Ca^{2 +} الإفراج عن الأحداث التي تقع في مواقع متعددة بشكل متزامن من خلال شبكة بي-المحكمة الجنائية الدولية كتصور داخل فوف (تصويرها مع هدف X 60)³⁸. ويتم تنظيم هذه الإشارات غير متزامن وقتيا في الثانية 1 التكتلات التي، عندما جدولت معا، تصل إلى ارتفاع خلوية s 1 صافي في Ca^{2 +}. هذه الإشارات نشر خلية إلى خلية داخل الشبكة المحكمة الجنائية الدولية وذلك تنظيم Ca^{2 +} إشارات، وتولد من المواقع الفرعية الخلوية، في أنسجة واسعة Ca^{2 +} موجه. تجميع الزمانية والجمع من Ca^{2 +} إشارات في سمي المحكمة الجنائية الدولية-بلدي Ca^{2 +} مجموعات عابرة (ريادية)³⁸. تحدث ريادية إيقاعي (مماثلة تماما مثل المدد الزمنية وفترات مماثلة بين ريادية) 30 مرة في الدقيقة في الماوس. على العكس من ذلك، المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث محور الدوران على شكل خلايا، بعض العمليات الثانوية، التي توزع بين سمكس والعمليات العصبية دوالي ولا بشكل مستقل شبكة^،من⁵¹⁵². بيد أن المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تشكل تقاطعات الفجوة مع سمكس، وتعمل داخل هذا سينسيتيوم أكبر، المعروف باسم سينسيتيوم المسبار⁵³. Ca^{2 +} إشارات تحدث في مواقع متعددة على امتداد أطوال الخلايا، ولكن لم يتم العالق هذه العابرين أو وقتيا متفاوت المسافات، كما لوحظ في المحكمة الجنائية الدولية-بلدي³⁷. Ca^{2 +} إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث تحدث بطريقة عشوائية، مع كثافات متغيرة والمدد الزمنية والمكانية الخصائص. البروتوكولات أدناه، باستخدام مثال Ca^{2 +} إشارات في بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث، وصف تقنيات تحليل إشارات معقدة في أنواع معينة من الخلايا في الموقع. نحن تستخدم النظام ف لوكس Cre إيندوسيبلي للتعبير عن GCaMP6f حصرا في المحكمة الجنائية الدولية، بعد حمل تفعيل Recombinase لجنة المساواة العرقية (Cre) مدفوعا مروج المحكمة الجنائية الدولية محددة (مجموعة أدوات).

Protocol

وكانت جميع الحيوانات المستخدمة والبروتوكولات المضطلع بها في هذه الدراسة وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وافق جميع الإجراءات المؤسسية استخدام الحيوان ورعاية اللجنة في جامعة نيفادا، رينو.

1-جيل فئران KitGCaMP6f

1. عبر Ai95 (RCL-GCaMP6f)-د (الفئران GCaMP6f) ومجموعة ج^{+ لجنة المساواة العرقية-ERT2} (Cre طقم الفئران) لإنشاء المحكمة الجنائية الدولية محددة GCaMP6f وإذ تعرب عن الحيوانات (الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6f).
   ملاحظة: واستخدمت GCaMP6f بسبب كفاءتها المبلغ عنها في التقارير المترجمة، موجزة داخل الخلية Ca^{2 +} إشارات في الموقع والمجراه في⁵⁴.
2. حقن الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6f مع تاموكسيفين في الإعمار من 6 – 8 أسابيع للحث على تفعيل لجنة المساواة العرقية ريكومبيناسي والتعبير GCaMP6f اللاحقة في المحكمة الجنائية الدولية (الشكل 1).
   1. لإنشاء حل تاموكسيفين، يحل 80 ملغ تاموكسيفين (انظر الجدول للمواد) في 800 ميكروليتر من الإيثانول (انظر الجدول للمواد) ومبومو ودوامه لمدة 20 دقيقة.
   2. إضافة 3.2 مل زيت القرطم (عام) لإنشاء حلول 20 ملغ/مل وثم sonicate لمدة 30 دقيقة قبل الحقن.
   3. حقن الفئران (الحقن داخل؛ الملكية الفكرية) مع 0.1 مل من محلول تاموكسيفين (2 ملغ تاموكسيفين) لمدة ثلاثة أيام متتالية. تأكيد التعبير GCaMP6f بالتنميط واستخدام الفئران بعد الحقن الأول 10 أيام.
      1. النمط الوراثي الفئران بقطع قطعة صغيرة من الإذن من كل الحيوانات. ثم استخدم أسلوب العامل البارع⁵⁵ لعزل الحمض النووي الجينوم التي تفرخ مقاطع الإذن عند 95 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في 75 مل من هيدروكسيد الصوديوم وتحييد ثم قبل 75 مل تريس المخزن المؤقت. استخدام PCR القياسية لتحديد النمط الوراثي من كل الحيوان، 2 مل من الحمض النووي في رد فعل 20 مل مع GCaMP6f الإشعال محددة⁵⁶. تشغيل 10 مل منتج بكر على 2% [اغروس] هلام لتحديد نوع البرية (297 bp) والمسخ (~ 450 bp) العصابات.

2-إعداد الأنسجة Ca^{2 +} تصوير

1. تخدير الفئران باستنشاق مع إيسوفلوراني (4%، انظر الجدول للمواد) في هود التهوية والتضحية ثم بخلع عنق الرحم.
2. استخدام مقص حاد فتح البطن للفئران، إزالة الأمعاء ووضعه في المسابقة كريبس بيكربونات الحل (كربوفانتسي). فتح الأمعاء على طول الحدود المساريقي العلوي ويغسل أي محتويات إينترالومينال مع كربوفانتسي. استخدام تشريح حاد، إزالة طبقات الغشاء المخاطي والغشاء المخاطي الفرعية.
   ملاحظة: الحل كربوفانتسي بالتشكيل التالي (مم): 118.5 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، كاكل₂ 2.5، مجكل₂ 1.2، ناكو₃ 23.8، 1.2 خ₂ص₄ ، 11.0 سكر العنب. يحتوي هذا الحل على pH قدرة 7.4 في 37 درجة مئوية عند bubbled بالتوازن مع 95% O₂-5% CO₂.
3. استخدام دبابيس صغيرة، دبوس أنسجة الأمعاء الدقيقة لقاعدة لوحدة التخزين 5 مل، طبق المغلفة سيلجارد قطرها 60 ملم مع طبقة العضلات الملساء الدائرية مواجهة. نتخلل الإعداد مع الحل كربوفانتسي المعالجون في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل التجريب الموازنة.
4. بعد هذه الفترة الموازنة، نفذ في الموقع Ca^{2 +} تصوير الصغيرة الأمعاء بلدي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (تم اقتناء الصور في هذا البروتوكول مع مجهر [كنفوكل] مزودة بقرص غزل). نظراً لفوائد جيسيس الموصوفة أعلاه، تستخدم صور عالية الدقة الوقت الفاصل بين (> 30 إطارا في الثانية، في الثانية الواحدة) جنبا إلى جنب مع أهداف عالية القوة (60 – 100 x) للحصول على أفلام من Ca^{2 +} إشارات حيوية في المحكمة الجنائية الدولية.
   ملاحظة: للحد من حركة الأنسجة، تطبيق نيكارديبيني (0.1 – 1 ميكرومتر) خلال التسجيلات كما هو موضح سابقا^37،،من^3839،،من⁴⁰⁴¹.
5. تميز بي-المحكمة الجنائية الدولية والمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في الأمعاء الدقيقة باستخدام مواقعها التشريحية المختلفة، ومورفولوجيا والقاعدية Ca^{2 +} أنماط النشاط.
   1. موقع المحكمة الجنائية الدولية-بلدي على مستوى ضفيرة مينتيريك، بين طبقات العضلات الملساء الطولية والدائرية للامعاء الدقيقة. وهم النجمية الشكل، تشكيل شبكة اتصال (الشكل 3A). نشر ريادية (المذكورة أعلاه) من خلال الشبكة من المحكمة الجنائية الدولية-بلدي حدثاً عادياً من دورات ~ 30 لكل دقيقة.
   2. على العكس من ذلك، قم بتحديد موقع المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في طائرة واحدة على صعيد الضفيرة العضلية العميقة، ما بين طبقة العضلات الملساء الدائرية والضفيرة سوبموكوسال. المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث لا تشكل شبكة، وهي محور الدوران على شكل الخلايا (الشكل 2A) أن يحمل أية أحداث نشر العادية، وبدلاً من ذلك إطلاق النار العشوائية، المترجمة Ca^{2 +} العابرين داخل الخلايا.
6. بغض النظر عن اقتناء البرمجيات المستخدمة، وحفظ الأفلام ككومة من الصور TIFF.

3-تحليل العشوائية Ca^{2 +} إشارات في المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام رسم الخرائط الزمانية (STM)

1. تحليل المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث باستخدام رسم الخرائط الزمانية مع مزيج من البرمجيات ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية، مجاناً للتحميل في http://imagej.nih.jov/ij) وبرامج مخصصة الصنع (فولوميتري، الإصدار G8d، GWH، قابلة للتشغيل على نظام التشغيل Mac OS، اتصل grant.hennig@ هنيغ منحة med.uvm.edu فيما يتعلق الاستفسارات للحصول على فولوميتري واستخدامها)
   ملاحظة: كما يتوفر نهج بديل لتحليل هذه الخرائط الزمانية مع ImageJ وحدها تماما في أقسام لاحقة (بداية في الخطوة 3، 9).
2. فتح فولوميتري واستخدام نقرات الماوس الأيمن لفتح المجلدات التي تحتوي على ملفات الأفلام. غادر انقر على ملف الفيلم ليتم تحليلها لفتحه في فولوميتري (يجب أن يكون بتنسيق TIFF غير مضغوط). بمجرد فتح، فسترد الفيلم داخل إطار الأزرق تحدها (نافذة الفيلم) التي سوف تشمل مساحة كبيرة من الشاشة الأيسر. سوف تحتوي على الجانب الأيسر من الشاشة إطار مؤامرة (العلوي 4/5ths) وإطار آثار (أقل 1/5^th).
3. ضبط أبعاد الفيلم بضغط SHIFT باستمرار وفي نفس الوقت التمرير حتى مع زر الماوس الأوسط (MMB، يقلل من حجم) أو التمرير لأسفل مع MMB (زيادة الحجم). بدء أو إيقاف التشغيل بالضغط على 'ألف'؛ يمكن ضبط سرعة التشغيل بالضغط الأعلى وأسفل مفاتيح الأسهم.
4. لإنشاء الوحدات التدريبية الموحدة استخدام فولوميتري، رسم العائد على الاستثمار أكثر من خلية كاملة بضغط SHIFT باستمرار أثناء النقر والسحب بزر الماوس الأيسر. ضبط اتجاه العائد على الاستثمار بالتمرير مع MMB في الزوايا من العائد على الاستثمار. عندما يكون العائد على الاستثمار في مكان فوق الخلية يتم تحليلها (الشكل 2A)، استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'STMs دوروا – ستميافج > إكسروو' وغادر انقر لإنشاء تحقيق الاستقرار والانتساب لنشاط الخلية في "إطار مؤامرة" (وهناك أيضا خيار لتحديد ' ستمكسافج > يرو ث '، واحد الذي يتم تحديد سوف يعتمد على ما إذا كان اتجاه الخلية هو أكثر توافقاً مع x أو المحور y، على سبيل المثال الخلية إبراز الشكل 2A هو أكثر الموجه على المحور y').
5. غادر انقر على تحقيق الاستقرار والانتساب في "إطار مؤامرة" واضغط 'P' طرح متوسط الضوضاء واضغط 'ح' زيادة تباين تحقيق الاستقرار والانتساب. حفظ في تحقيق الاستقرار والانتساب عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif.' وغادر ثم النقر فوق حفظ كملف TIFF.
6. سوف تنفذ ما تبقى تحليل للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث في إيماجيج. إيماجيج يتكون من عنصرين رئيسيين هما، شريط أدوات مع موقع ثابت على أعلى الشاشة وواجهة مستخدم الهاتف المحمول. باستخدام إيماجيج، افتح ملف TIFF تحقيق الاستقرار والانتساب للمحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث Ca^{2 +} النشاط (فتح ملف شريط أدوات الصورة J).
7. فتح إنشاء فولوميتري تحقيق الاستقرار والانتساب، التي سيكون لها وقت الموجه عمودياً. إيماجيج سيتم فتحه تلقائياً ملفات TIFF ك RGB أو الصور 16-بت. لتحسين جودة الصورة، غادر انقر 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج. التمرير في الخيار الأول 'نوع' للكشف عن القائمة المنسدلة قائمة تنسيقات الصور المختلفة، انتقل أكثر من 32-بت '، وغادر انقر لتغيير.
8. جعل في تحقيق الاستقرار والانتساب للقراءة مع الزمن من اليسار إلى اليمين، غادر انقر على شريط الأدوات إيماجيج على المسار التالي: 'الصورة-تحويل استدارة إلى اليسار درجة 90'. من الممكن أيضا لإنشاء STMs في الموقع المرجع المصدق ca^{2 +} النشاط باستخدام لينيسكانس مع إيماجيج وحدها دون فولوميتري، وهذا هو مفصل أدناه.
   ملاحظة: حالما يتم إنشاء STMs أنهم يتم تحليل بنفس الطريقة بغض النظر عن الذي تم استخدام البرمجيات لتوليد لهم. لتخطي هذا الأسلوب البديل لخلق STMs في إيماجيج، قم بالتخطي إلى الخطوة 3.19.
9. لإنشاء STMs مع إيماجيج، فتح كومة ملفات TIFF التي تقوم بإنشاء تسجيل نشاط^{2 +} Ca المحكمة الجنائية الدولية-برنامج إدارة الكوارث (فتح ملف شريط أدوات إيماجيج). إيماجيج سيتم فتحه تلقائياً ملفات TIFF ك RGB أو الصور 16-بت. لتحسين جودة الصورة، غادر انقر 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج. التمرير في الخيار الأول 'نوع' للكشف عن القائمة المنسدلة قائمة تنسيقات الصور المختلفة، انتقل أكثر من 32-بت '، وغادر انقر لتغيير.
10. ينبغي الآن طرح ضجيج الخلفية (الناجمة عن الضوضاء الكاميرا أو صف السيارات) من الفيلم. غادر انقر فوق الدالة '"مستطيل التحديد"' في واجهة إيماجيج ورسم العائد على الاستثمار (بترك النقر والسحب إلى الحجم المطلوب والشكل) أكثر من الأسفار خلفية للفيلم.
11. بعد تحديد العائد على الاستثمار، غادر انقر على 'تحليل' في شريط الأدوات إيماجيج، ومن ثم غادر انقر فوق 'الرسم البياني' من القائمة المنسدلة الناتجة. ثم يظهر مربع منبثق تستفسر عن قيم مجموعة البيكسل لحساب؛ وقد إيماجيج قيم دوروا المختارة حتى اليسار انقر 'موافق'.
12. بعد النقر فوق 'موافق'، سيظهر مربع منبثق جديد الذي يحتوي على الرسم بياني تبين توزيع قيم بكسل ضجيج الخلفية داخل العائد على الاستثمار. يحيط علما بمتوسط القيمة المدرجة أدناه على الرسم البياني ثم قم بإغلاق مربع منبثق.
13. انقر فوق العودة إلى الفيلم 32-بت وحدد فوف كامل بترك النقر فوق 'تحرير' على شريط الأدوات إيماجيج، والتمرير إلى 'اختيار' وغادر النقر فوق "تحديد الكل" من القائمة المنسدلة وكشف.
14. غادر انقر فوق 'عملية' على شريط الأدوات إيماجيج، قم بالتمرير إلى 'الرياضيات' وغادر انقر فوق 'طرح' من القائمة المنسدلة كشفت.
15. سوف يظهر مربع منبثق بحيث يمكن إدخال قيمة لطرح من فوف. أدخل القيمة يعني اكتسبت من الرسم البياني في الخطوة 3، 12 أعلاه وانقر فوق 'موافق'. ثم سوف يطلب إيماجيج لمعالجة كافة الإطارات في مكدس TIFF (وليس فقط إطار واحد الفيلم حاليا في). انقر فوق 'نعم'.
16. بعد النقر فوق 'نعم'، سيتم إيقاف الفيلم الأسود. لتصحيح هذه المشكلة، غادر انقر فوق 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج والتمرير عبر 'ضبط'. غادر انقر على الخيار الأول كشف عن 'السطوع/التباين' (ب وج). وهذا سيجلب يطفو على السطح مربع حيث يمكن تعديل جوانب مختلفة من السطوع والتباين. غادر انقر على الخيار 'السيارات' مرة واحدة للكشف عن زيادة نوعية في الفيلم. اترك هذا ب & ج البوب مربع مفتوح للاستخدام في المستقبل.
17. لإنشاء linescan، أولاً حق انقر على أداة التحديد الخط في واجهة إيماجيج للكشف عن الخيارات المتعلقة بخطوط مختلفة؛ غادر انقر على '"خط مجزأة"' اختياره من القائمة. مع تحديد أداة '"خط مجزأة"'، غادر النقر فوق استخدام واحد لرسم خط على طول محور المحكمة الجنائية الدولية الفردية-برنامج إدارة الكوارث في منتصف. سيتم إصلاح كل واحدة فوق الأيسر فوق السطر في هذه النقطة بالذات، والخط يمكن ثم بحرية نقل مزيد من أي زاوية المنشود. عند الانتهاء من السطر، ضعف اليسار انقر لإصلاح الخط في مكان.
18. غادر انقر فوق 'صورة' على شريط الأدوات إيماجيج والتمرير عبر 'رزمة' واليسار انقر على الخيار 'ريسليسي'. سوف يظهر مربع منبثقة؛ غادر انقر على خيار 'تدوير 90 درجة'، وهذا سيتم توجيه linescan من اليسار إلى اليمين حتى أنه يمكن معايرة وقراءة ضد الوقت على المحور س، مع مساحة على المحور ص. انقر فوق 'موافق' لإنشاء في تحقيق الاستقرار والانتساب.
19. سيتم إنشاء كثافة تحقيق الاستقرار والانتساب على اللون رمادي مع كثافة عالية Ca^{2 +} إشارات سيظهر كدرجات متفاوتة من الأبيض، وقبالة رمادي أبيض أو فاتح اعتماداً على قوتها. عادة، على النقيض linescan تم إنشاؤه سوف تحتاج إلى تحسين. القيام بذلك بواسطة النقر فوق 'السيارات' على البوب ب & ج مربع.
20. كثافة الأسفار linescan يرد على تحقيق الاستقرار والانتساب في قيم بكسل التعسفي. من أجل دقة قياس السعة لكاليفورنيا^{2 +} إشارات من تحقيق الاستقرار والانتساب، قيم الأسفار "تحقيق الاستقرار والانتساب" (F) الآن بحاجة إلى تطبيع. استخدام الدالة '"مستطيل التحديد"' في واجهة إيماجيج، رسم العائد على الاستثمار في منطقة تحقيق الاستقرار والانتساب الذي يعرض منطقة موحدة الأكثر والأقل كثافة من الأسفار (و₀).
21. كرر الخطوات التي اتخذت في 3.11-3.12 للحصول على قيمة متوسط (و₀) كثافة داخل دوروا المحددة ومن ثم حدد في تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة بترك النقر فوق 'تحرير-التحديد-حدد"جميع"' من شريط الأدوات إيماجيج.
22. غادر انقر فوق 'عملية' على شريط الأدوات إيماجيج، انتقل إلى 'الرياضيات'؛ غادر انقر فوق 'تقسيم' كشف أحد الخيارات. في مربع منبثق اللاحقة، أدخل القيمة الوسطية (و₀) التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.21. عند قسمة تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة (و₀) سوف تتحول تحقيق الاستقرار والانتساب الأسود؛ تصحيح هذا عن طريق النقر فوق 'السيارات' على ب & ج يطفو على السطح مربع. الآن معايرة linescan على السعة، بكثافة الأسفار معبراً و/و₀.
23. سيتم عرض تحقيق الاستقرار والانتساب حاليا عدد الإطارات في مكدس TIFF على المحور السيني وعدد وحدات البكسل التي تمثل طول الخلية على المحور ص. من أجل التحديد الكمي للمعلومات المكانية والزمانية من Ca^{2 +} إشارات، معايرة تحقيق الاستقرار والانتساب للمكان والزمان. غادر انقر فوق 'صورة' في شريط الأدوات إيماجيج وغادر انقر فوق 'خصائص'. سيظهر مربع منبثق. ضمن هذا الإطار، قم بإدخال القيم المناسبة لمعايرة تماما في تحقيق الاستقرار والانتساب.
24. '"بكسل"عرض'، أدخل طول الوقت الذي يستغرقه لالتقاط إطار واحد في ثوان. للحصول على أمثلة، في الثانية 5، قم بإدخال قيمة 0.2، لإدخال 50 إطارا في الثانية قيمة 0.02، ل 33 FPS أدخل قيمة 0.033، إلخ. ل '"بكسل ارتفاع"'، أدخل كم ميكرون كل بكسل يمثل (سيعتمد على الهدف المستخدمة ويستخدم لاقتناء كاميرا). يتم ترك 'عمق فوكسل' في 1 قبل النقر فوق 'موافق'. أية معلمات أخرى تحتاج إلى تعديل في داخل الإطار.
    ملاحظة: بعد النقر فوق 'موافق'، سوف معايرة تحقيق الاستقرار والانتساب كاملة السعة والمساحة والوقت. سوف أعرب عن السعة على تحقيق الاستقرار والانتساب و/و_0، الوقت على المحور السيني سيعبر عنها في ثوان، وسوف أعرب عن الفضاء على المحور الصادي في ميكرومتر (الشكل 2). Ca^{2 +} الأحداث على تحقيق الاستقرار والانتساب وأصبحت الآن جاهزة قياس، وتحقيق الاستقرار والانتساب معايرة كما يمكن حفظها كصورة TIFF واحدة تحليلها في وقت لاحق.
25. وقد إيماجيج عددا من بني في جدول البحث لون مشفرة (طرفيات المستعملين المحليين) التي يمكن استخدامها للون رمز تحقيق الاستقرار والانتساب. تطبيق بنيت في طرفية بترك النقر فوق على شريط الأدوات إيماجيج على المسار '"جداول"بحث الصورة' واختر طرفية لتطبيق. يمكن أيضا استيراد العرف طرفيات المستعملين المحليين إلى تحقيق الاستقرار والانتساب بترك النقر فوق على شريط إيماجيج على طريق 'ملف-استيراد-طرفية' ثم تحديد طرفية المستعملين المحليين للاستيراد. فعلى سبيل المثال كان STM هو مبين في الشكل 2 طرفية المستعملين المحليين مخصص 'كوبباليتي' (كوينز جامعة بلفاست، المملكة المتحدة) مطبقة عليه، إلى رمز الألوان الحارة (الأحمر والبرتقالي) مناطق ذات كثافة Ca^{2 +} الأسفار والألوان الباردة (الأسود، الأزرق) كمناطق منخفضة Ca^{2 +} الأسفار.
26. لإدراج قضيب معايرة سعة للإشارة إلى نطاق ستريك ممثلة بألوان مختلفة، غادر انقر فوق 'تحليل' من شريط الأدوات إيماجيج، قم بالتمرير إلى 'أدوات'، وحدد 'معايرة شريط' من القائمة وكشف. يتم إعطاء خيارات الحجم والتكبير/التصغير، نطاق والموقف على تحقيق الاستقرار والانتساب لشريط المعايرة؛ ضبط هذه الإعدادات كما هو مطلوب ثم انقر فوق 'موافق'. لاحظ أنه عندما يتم إدراج شريط المعايرة، يخلق ImageJ الموحدة جديدة التي تحتوي عليه، ترك النسخة الأصلية دون شريط المعايرة سليمة ومنفصلة.
    ملاحظة: إذا كان المربع 'تراكب' هو قليلاً عند إدراج شريط المعايرة، لن يتم إنشاء تحقيق الاستقرار والانتساب جديد.
27. غادر انقر لبدء تحليل Ca^{2 +} أحداث فردية على محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. بالبداية غادر النقر على تحقيق الاستقرار والانتساب، رسم خط أفقي مستقيم من خلال مركز Ca^{2 +} حدث مواز للمحور السيني (ضد الزمن). إكمال السطر بترك النقر مرة ثانية (الشكل 2D).
28. انقر فوق 'تحليل' على شريط الأدوات إيماجيج واليسار انقر على '"الأرض الشخصية"'. سوف يظهر مربع جديد مع التشكيل الجانبي مؤامرة Ca^{2 +} الحدث (الشكل 2E).
    ملاحظة: الخيار 'قائمة' داخل هذا المربع سيقوم بإنشاء قائمة قيم س وص للمؤامرة التي تم إنشاؤها، والتي يمكن نسخها إلى برنامج جدول بيانات لإنشاء آثار إذا رغبت في ذلك.
29. لقياس السعة Ca^{2 +} الحدث تمثل في التشكيل الجانبي للأرض، غادر انقر فوق محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. ثم رسم خط عمودي من خط الأساس للتشكيل الجانبي للأرض إلى ذروة Ca^{2 +} الحدث؛ طول السطر (كما هو موضح في واجهة إيماجيج) سيمثل السعة للحدث معبراً عنها ΔF/و₀ (الشكل 2E).
30. استخدام قيمة السعة المكتسبة، مدة Ca^{2 +} الحدث يمكن أن يقاس برسم خط مستقيم عبر عرض الحدث عند نقطة السعة 50% كحد أقصى (المدة الكاملة في نصف السعة القصوى، فدهم) أو المدة الكاملة للحدث ويمكن قياس إذا رغبت في ذلك (الشكل 2E).
    ملاحظة: المجربون وسوف تحتاج إلى تصميم معيار محدد لمستوى العتبة صالحة Ca^{2 +} الأحداث في هذه التسجيلات. في تجاربنا، اعتبرت Ca^{2 +} الأحداث يجري صالحة للتحليل إذا كان لها السعة > 15% الحدث السعة القصوى في المقطع عنصر تحكم التسجيل. ومع ذلك، ستتوقف هذه العتبات في أنسجة محددة والخلايا قيد الدراسة وهي فقط التعسفي التوجيهية التي تتطلب التحسين المحددة لكل نوع من الأنسجة والخلايا.
31. رسم خط على طول أوبستروكي أو downstroke من Ca^{2 +} حدث مؤامرة التشكيل الجانبي، بمعدل ارتفاع أو سقوط يمكن أن يحسب تبعاً لذلك. بعد أن يتم رسم الخط، يمكن نقل رأس مؤشر الماوس إلى النقطة حيث يبدأ السطر وينتهي. عندما يكون المؤشر ثابتة على هذه النقاط، سيتم عرض x, y إحداثيات لهذا الموقع في الجانب الأيسر السفلي من واجهة إيماجيج. وهكذا، من خلال الحصول على x, قيم y حيث يبدأ السطر (س₁، ص₁) وينتهي (س₂، ص₂)، ويمكن حساب معدل الارتفاع أو الانخفاض (ΔF/s) كميل الخط، ص₂ -ص₁ /س-₂ ×₁ (الشكل 2 واو ).
32. بغية حساب نشر أو الحيز المكاني Ca^{2 +} حدث، بقي فوق على محدد '"خط مستقيم"' على واجهة إيماجيج. ثم رسم خط مستقيم عمودي على طول Ca^{2 +} الحدث على طول المحور الصادي. طول السطر (كما هو موضح في واجهة إيماجيج) سوف يمثل انتشار المكاني للحدث معبراً ميكرومتر (الشكل 2).
33. تحديد سرعة نشر Ca^{2 +} حدث برسم خط على طول الجبهة نشر الحدث وحساب منحدر الخط. يمكن إجراء ذلك يدوياً بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 3، 32، بواسطة تحديد x، قيم y حيث يبدأ السطر (س₁، ص₁) وينتهي (س₂، ص₂)؛ سيتم عرض هذه القيم في الجانب الأيسر السفلي من الواجهة ImageJ عندما يقع مؤشر الماوس على تحقيق الاستقرار والانتساب.
34. بناء على مجموعة المعلمات المطلوبة Ca^{2 +} الحدث التقدير الكمي وتجمع هذه القيم في المتوسط لتوليد قيم المتوسط الحسابي لكل معلمة على أساس الخلية الواحدة؛ وبدلاً من ذلك، وضع كل من القيم الخام في توزيع الرسم بياني لإظهار مداها (الشكل 2 ح).

4-تحديد مقدار ريادية في الجسيمات باستخدام المحكمة الجنائية الدولية-بلدي على أساس تحليل

1. قبل تحليل الأفلام في فولوميتري مع بتكلس، سوف تحتاج إلى معايرة المكانية والزمانية للفيلم سيتم إدراجه في اسم الملف. تحرير كافة الملفات يتم تحليلها في فولوميتري لاحتواء ضمن العنوان عدد الثواني التي يساوي كل إطار وأيضا فصل عدد ميكرون التي يساوي كل بكسل بشرطة واحدة، مع قيم المغطى في أقواس مربعة. على سبيل المثال، يجب أن يكون فيلم المكتسبة في الثانية 33 مع هدف 60 x (512 × 512) [0.22 – 0.033] إدراج اسم الملف الخاص به.
2. فتح فولوميتري واستخدام نقرات الماوس الأيمن لفتح المجلدات التي تحتوي على ملفات الأفلام. غادر انقر على ملف الفيلم ليتم تحليلها لفتحه في فولوميتري (الشكل 3 ألف، يجب أن يكون بتنسيق TIFF غير مضغوط).
3. من أجل حساب دقة Ca^{2 +} إشارات من فوف كامل، سيخضع الفيلم أولاً التمايز وتجانس لإزالة خلفية التدخل (الضوضاء الكاميرا، صف السيارات إلخ) وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. في "إطار الفيلم"، انقر على الحق إحضار قائمة واستخدام نقرات حق الوصول 'STK تصفية-التفريق بين'، انقر على الحق مرة أخرى لإدخال قيمة للتفريق، اضغط ENTER، وانقر فوق اليسار لتطبيق (لأفلام المكتسبة في الثانية 33 قيمة 2 (∆t = ± 66-70 مللي ثانية) يعمل بشكل جيد، يتم زيادة القيمة كمعدل الزيادات التقاط الصورة).
   ملاحظة: التمايز في هذا السياق سوف يقلل كثافة المناطق من التسجيل (بكسل) التي تظهر أي نشاط حيوي على مدى عدد الإطارات المحددة. وهكذا، إذا تم إدخال قيمة '2'، ويتم تحليل كل بكسل في كل إطار من التسجيل وإذا ضمن هذا الإطار يوجد أي تغيير حيوي في الإطار الأسفار 1 بكسل قبل والإطار 1 بعد، سوف تطرح الكثافة داخل تلك بكسل من التسجيل. وهكذا، يتم إزالة الضوضاء الخلفية غير الدينامية وهو زيادة إشارة إلى الضوضاء.
4. سلسة الفيلم متمايزة بتطبيق عامل تصفية ضبابي. انقر على الحق في "إطار الفيلم" إلى إحضار قائمة واستخدام نقرات حق الوصول 'STK غاوس تصفية"كرنل"'، انقر على الحق مرة أخرى لإدراج قيمة (استخدم دائماً عدد فردي، للأفلام التي اكتسبت في الثانية 33، قيمة 5 يعمل بشكل جيد، 1.5 x 1.5 ميكرومتر ، الانحراف المعياري 1.0) إدخال قيمة، اضغط ENTER، وانقر فوق اليسار لتطبيق (الشكل 3B).
5. البدء في إنشاء بتكلس بأول تحديد مدة الفيلم الذي يشمل فترة هادئة (20 – 40 إطارات) متبوعاً بحدوث لجنة مكافحة الإرهاب وأيضا 20 – 40 الإطارات بعد لجنة مكافحة الإرهاب. للقيام بذلك، التمرير خلال الفيلم باستخدام في MMB للتمرير من اليسار إلى اليمين على شريط أصفر.
6. مع التحديد الذي تم إجراؤه، الحق نقرات الاستخدام في "إطار الفيلم" الوصول إلى 'STK مكتب خدمات المشاريع--بتكلينفو س المنحدر' وغادر انقر فوق تطبيق. هذه الدالة يتم تشغيل روتين تحليل شركة الاتصالات الباكستانية تدريجيا سلالم العتبة من أقصى شدتها إلى حدة الأدنى. وهذا سيتم عرض رسومياً في "إطار مؤامرة" كقطعة ضوضاء، وأيضا في "إطار آثار" كآثار الملونة الثلاث، مع التتبع الخضراء تبين عدد بتكلس، التتبع الحمراء عرض متوسط حجم شركة الاتصالات الباكستانية، وتتبع الأزرق تبين كثافة مطلقة العتبة.
   ملاحظة: يتم احتساب عدد ومتوسط حجم بتكلس على كل عتبة تلقائياً وثم يتم تطبيق عتبة شبه يدوي باستخدام الكثافة فيه الساعة التي متوسط حجم بتكلس يبدأ في الانخفاض، الذي يحدث عند نقطة انعطاف للتتبع الحمراء في إطار تتبع (3D الشكل، أي بسبب الإعداد الكبيرة من الضوضاء محدود مكانياً بتكلس تقليل حجم متوسط بتكلس).
7. ضمن "إطار المؤامرة"، اضغط 'ح' إلى رصيد الرسم البياني مؤامرة سيظهر من الضجيج شركة الاتصالات الباكستانية. دورة من خلال أنظمة الألوان بالضغط على '[' حتى الخلفية البيضاء الملونة مع آثار الملونة في الأعلى.
8. اضغط 'و' إحضار أداة قياس واليسار انقر على الأرض عند التقاطع حيث تحول القطع الملونة على الجانب الأيمن. وهذا سيمثل خط عمودي واحد في شريط التمرير "النافذة آثار" أدناه.
9. ضمن "إطار التتبع"، قم بالتمرير لليسار MMB إلى اليمين من نقطة انعطاف للتتبع الحمراء حتى الخط العمودي البيضاء المعلمة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 10، والتأكد من أن تتبع الأزرق محدداً بالحق النقر عليه، قراءة قبالة 'يافج' التي سيتم عرضها في تي أنه خفض الجانب الأيسر من "إطار التعقب". قم بإلغاء التحديد بالضغط MMB مرة واحدة داخل "الإطار آثار".
10. ضمن "إطار الفيلم"، اضغط على 'ج' لإحضار عجلة ألوان، ثم أن الصحافة ' لضبط عتبة. الآن سيظهر بتكلس صالح الأحمر في "إطار فيلم" (الشكل 3)، وتلك التي تشبع سوف تكون بيضاء. إزالة المناطق البيضاء بالتمرير حتى مع زر الماوس الأيسر.
11. قم بالتمرير لأعلى أو لأسفل مع MMB لضبط القيمة العددية الأصفر في عجلة اللون، وضبط هذه القيمة إلى قيمة يافج مأخوذة من الخطوة 4، 11. سيقوم هذا بتعيين كل شيء باللون الأحمر كنشطة Ca^{2 +} عابر شركة الاتصالات الباكستانية في نقطة العتبة المحددة. لحفظ هذا ملف كملف جسيمات استناداً إلى تنسيق، استخدام الحق نقرات للوصول إلى 'STK 3D-حفظ بتكلس 0' واليسار ثم انقر فوق حفظ الملف.
12. قم بإنهاء فولوميتري وإعادة فتحه. فتح ملف شركة الاتصالات الباكستانية (ملف.gpf) التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.13. في هذا النوع من الملفات، يتم حفظ كافة النشطة Ca^{2 +} العابرين كشركة الاتصالات الباكستانية أزرق موحد (رقم 3E). كما شركة الاتصالات الباكستانية كل كيان فردية الخاصة به معرف ومنطقة ومحيط إحداثيات، إعلام الدولة (انظر أدناه) ومصفوفات النتائج، تبسيط تحليل الخصائص الزمانية بتكلس، أو بين بتكلس.
13. للبدء بتحليل بتكلس، إزالة أي ضجيج المتبقية في شركة الاتصالات الباكستانية (بتكلس غير صالح الصغيرة التي تم إنشاؤها عندما يتم إنشاء ملف.gpf) باستخدام نقرات الحق في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية"ستكوبس العلم بتكلس > دقيقة = 70' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا الإجراء سوف العلم بتكلس أكبر من 6 ميكرون² (~ قطرها > 2µm) وسوف فولوميتري تعيينها إلى اختيار 'العلم 1'. عند اكتمال هذا، بتكلس التي أعلى من هذا الحد (1 علامة) ستظهر كلون أرجواني فاتح في "إطار الفيلم"، بينما سيظل بتكلس أي عتبة لونها أزرق قاعدة (3F الشكل).
14. إنشاء عروض تقديمية خريطة الحرارة من نشاط شركة الاتصالات الباكستانية باستخدام النقرات الصحيحة في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"العلم"ستكوبس-ستاتماب شركة الاتصالات الباكستانية ='. جانب الحق النقر على هذا المسار النهائي، يمكن إدخالها بإحالة علم تحليل. وهكذا، إذا الراغبة في تحديد مقدار بتكلس تم تعيينها إلى العلامة 1، أدخل ببساطة '1' واضغط ENTER واليسار ثم انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء خريطة حرارة بتكلس الإجمالي لطول التسجيل، مع ألوان مختلفة تمثل التواجد (%) في جميع أنحاء التسجيل (الشكل 3، ألوان دافئة تشير إلى حدوث زيادة في هذا الموقع).
15. حفظ خرائط الحرارة عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif.' وغادر ثم النقر فوق حفظ كملف TIFF.
16. تحديد حجم نشاط شركة الاتصالات الباكستانية باستخدام نقرات الحق في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية التدبير-بتكلستاتس STK ='، بالحق النقر على هذا المسار النهائي، يمكن إدخالها بإحالة علم تحليل. وهكذا، إذا الراغبة في تحديد مقدار بتكلس تم تعيينها إلى العلامة 1، أدخل ببساطة '1' واضغط ENTER واليسار ثم انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء سلسلة من آثار في "إطار تتبع".
17. فولوميتري سيتم بشكل افتراضي ركب آثار شركة الاتصالات الباكستانية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 17 فوق بعضها البعض. تفصل بينهما استخدام الحق النقر في "إطار تتبع" الوصول إلى 'محاذاة منفصلة"تتبع"' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا وسوف تكشف عن آثار شركة الاتصالات الباكستانية أربعة مختلفة أن التحديد الكمي للمرجع المصدق Ca^{2 +} نشاط شركة الاتصالات الباكستانية في فيلم عرض شركة الاتصالات الباكستانية المنطقة (الخضراء) وشركة الاتصالات الباكستانية العد (أحمر) وحجم شركة الاتصالات الباكستانية (سماوي) وشركة الاتصالات الباكستانية حجم الانحراف المعياري (الأزرق) تآمروا ضد الزمن (الشكل 3 ح).
18. قد يتم حفظ هذه الآثار كملف نصي التي يمكن استيرادها إلى برنامج جداول بيانات لمزيد من التحليل. لإنقاذ آثار، اضغط SHIFT باستمرار واستخدام النقرات الحق في "إطار تتبع" الوصول إلى 'تفريغ Assorted"دوروا"كنص' وغادر انقر لحفظ الملف. ثم يتم جمع هذه المعلومات والموضح في رسوم بيانية أو تمثيلات رسومية أخرى مناسبة (الشكل 3 ح).
19. لنظره الأولى لوقوع بتكلس (أي، إلقاء نظرة على إطلاق مواقع)، نظراً لهذه بتكلس الأولى بإحالة علم مختلفة. لعزل أفضل إطلاق مواقع التي تحدث داخل الشبكة، فقط تلك بتكلس التي لا تتداخل مع أي جزيئات في الإطار السابق ولكن التداخل مع جزيئات في ms 70 القادم يعتبر إطلاق مواقع.
20. لتطبيق هذه العتبة، الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية F1-سلوك"إينيتسيتيس"> F = 3' واليسار انقر فوق تطبيق. سيقوم هذا بتعيين بدء بتكلس ك 'العلم 3'، والآن سوف تظهر بتكلس التي تفي بهذه المعايير كلون جير أخضر في الفيلم (الشكل 4 أ).
21. فولوميتري كما يتيح القدرة على قياس وارسم عدد مواقع إطلاق شركة الاتصالات الباكستانية في إعطاء FOV، فضلا عن التآمر احتمال إطلاق النار أثناء لجنة مكافحة الإرهاب. لتحليل هذه المعلمات، إنشاء مخطط حرارة لبدء بتكلس (3 علامة) كما هو موضح في الخطوة 4، 16 (الشكل 4 باء).
22. غادر انقر فوق في "إطار مؤامرة" وثم اضغط 'C' لإحضار عجلة الألوان والصحافة أن ' إلى الحد الأدنى. خريطة الحرارة بدء إرادة بتكلس ثم تشغيل الرمادي والأبيض. إزالة جميع البيض بالتمرير حتى مع زر الماوس الأيسر وعتبة بتكلس في خريطة الحرارة حيث أن بتكلس صالحة فقط مشمولة في الرمادي (ضبط عتبة بالتمرير صعودا وهبوطاً مع MMB).
23. استخدام الحق النقرات على الخريطة الحرارة في "إطار مؤامرة" الوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب بتكلس-يجد بتكلس 70' وغادر انقر فوق تطبيق. سيقوم هذا بتعيين جميع بتكلس الرمادية في الخريطة التي تزيد عن 70 بكسل² في المساحة المخصصة كبدء منفصلة لوناً مميزاً شركة الاتصالات الباكستانية أو شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق الموقع (الشكل 4).
24. ارسم النشاط لكل من هذه المواقع إطلاق النار ضد الوقت بالنقر على الحق في شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق خريطة والوصول إلى 'تحقيق الاستقرار والانتساب بتكلس--إنشاء"شركة الاتصالات الباكستانية"رويس' وغادر النقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء صورة جديدة في "إطار الفيلم" مع جميع منفصلة ملونة شركة الاتصالات الباكستانية إطلاق المواقع التي يتم عرضها مع دوروا حولها.
25. استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية"التدبير-بتكلبيكسرويبم > = 1' وغادر انقر فوق تطبيق. وسيحدد هذا رويس كافة في "إطار الفيلم" الذي يحتوي على واحد على الأقل من شركة الاتصالات الباكستانية وسوف ارسم كل نشاط داخل هذه رويس في "إطار آثار". بشكل افتراضي، سيتم فرضه هذه الآثار على بعضها البعض. الفصل بينهما، الحق بالنقر فوق استخدام في "إطار تتبع" الوصول إلى 'محاذاة منفصلة"تتبع"' وغادر انقر فوق تطبيق. لإنقاذ آثار، اضغط SHIFT باستمرار واستخدام النقرات الحق في "إطار تتبع" الوصول إلى 'تفريغ Assorted"دوروا"كنص' وغادر انقر لحفظ الملف.
26. كما يمكن رسم نشاط كل موقع إطلاق النار كمخطط تواجد. للقيام بذلك، استخدام حق النقرات في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية بينولا"دوروا التدبير = 10' وغادر انقر فوق تطبيق. سيؤدي هذا إلى إنشاء قطعة من جميع مواقع إطلاق النار ضد الزمن في "إطار مؤامرة". سيتم عرض كل موقع إطلاق النار ككيان منفصل ملونة، كل بمفردها 'لين' وهذه المؤامرات التي تناظر Ca^{2 +} بتكلس الشروع خلال ريادية (الشكل 4، هاء) حفظ هذه الخرائط الحدوث عن طريق الحق النقر عليها للوصول إلى ' تحقيق الاستقرار والانتساب تحميل حفظ-حفظ STM ك tif. ' ثم غادر بالنقر فوق حفظ كملف TIFF.
27. لتقدير احتمال إطلاق النار على كل موقع إطلاق النار أثناء لجنة مكافحة الإرهاب، الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" للوصول إلى '"شركة الاتصالات الباكستانية هو"السلوك-مارك = 1' وغادر انقر فوق تطبيق. هذا سوف تحديد كل الإطارات في الفيلم التي تحتوي على بتكلس فوق العتبة وهذه سيتم وضع علامة في الجزء السفلي من "إطار الفيلم" كخطوط زرقاء رأسية.
28. إظهار ريادية التجميع السريع لإطلاق النار غير متزامنة من عدة مواقع إطلاق النار داخل فوف مع ~ 1 s الفجوات بين كل دورة من دورات اللجنة. يتم استخدام هذا الانتظام وفجوة طويلة من لا بتكلس النشطة بين ريادية لزيادة تعريف لجنة مكافحة الإرهاب للتحليل.
29. استخدام الحق النقر في "إطار الفيلم" للوصول إلى 'الفجوة"هو"كتلة سلوك شركة الاتصالات الباكستانية < ='، واستخدام حق انقر على النقطة الأخيرة لإدخال رقم. هذا الأمر سيتم تجميع إطارات شركة الاتصالات الباكستانية النشطة المحددة في الخطوة 4، 28 إلى كتل وكتل تستند إلى عدد الإطارات التي تفصل بتكلس النشطة. للتسجيلات من 33 إطارا في الثانية على سبيل المثال، قيمة 10 يعمل بشكل جيد. إذا بتكلس النشطة أقل من 10 إطارات أربا (330 مللي ثانية) يتم تجميعها في كتلة واحدة للتحليل (الكتل ثم تظهر كمستطيلات الوردي عبر خطوط زرقاء عمودي في الجزء السفلي من "إطار الفيلم"، مع كل مستطيل وردي الآن تشير إلى لجنة مكافحة الإرهاب).
30. الحق النقر فوق استخدام في "إطار الفيلم" الوصول إلى 'شركة الاتصالات الباكستانية التدبير-شركة الاتصالات الباكستانية"الحدث غالباً"'. سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف نصي التي يمكن استيرادها إلى برنامج جدول بيانات. وسيوفر هذا الملف النصي كميات هائلة من البيانات على الطبيعة للشروع في المواقع التي تم تعريفها من الخطوات 4.16 – 4.23 ومساهمتها إلى ريادية.
    ملاحظة: ملف النص سوف تظهر عدد مواقع البدء (يشار إليها على أنها 'المجالات')، حجم الموقع بكسل وميكرو²، الاحتمال لكل موقع بدء إطلاق النار أما مرة واحدة أو عدة مرات خلال كل لجنة مكافحة الإرهاب (يعطي كنسبة مئوية)، أن متوسط مدة وحجم بتكلس التي تحدث في ذلك الشروع في الموقع والعدد من دورات لجنة مكافحة الإرهاب (كما هو معرف في الخطوة 4.23) والنسبة المئوية لمواقع إطلاق النيران التي أطلقت خلال كل دورة من دورات اللجنة. يتم جمع هذه المعلومات والموضح في رسوم بيانية أو تمثيلات رسومية أخرى مناسبة (4F الشكل).

النتائج

استخدام الفئران كيت-لجنة المساواة العرقية-GCaMP6F (الشكل 1)، دينامية Ca^{2 +} إشارات السلوكيات للمحكمة الجنائية الدولية في الجهاز الهضمي يمكن تصويرها في الموقع. مع الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن الحصول على صور عالية الاستبانة لفئات معينة من السكان للمحكمة الج...

Discussion

Ca^{2 +} تصوير لأنواع محددة من الخلايا داخل أنسجة سليمة أو في شبكات الخلايا غالباً ما تكشف عن أنماط معقدة من Ca^{2 +} العابرين. ويتطلب هذا النشاط تحليلات متأنية ومتعمقة، والتقدير الكمي لالتقاط قدر ممكن من المعلومات عن الأحداث الكامنة والحركية لهذه الأحداث. تحقيق الاستقرار والانتساب وتح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6