时空映射和粒子分析技术在细胞内 ca2 +原位信令定量中的应用

摘要

基因编码^{的 ca 2 +}指标 (geci) 从根本上改变了原位 ca^{2 +}成像的执行方式。为了最大限度地从此类记录中恢复数据, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当分析。本文的规程利用时空映射和粒子分析, 便于对现场记录的 ca^{2 +}信号进行量化。

摘要

ca^{2 +}完整组织中分离细胞或特定类型细胞的成像通常揭示 ca^{2 +}信号的复杂模式。这项活动需要仔细和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的基础事件信息。ca^{2 +}信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可能提供细胞内信号所需的一些生物信息。高分辨率 ca^{2 +}成像通常会导致获取大型数据文件, 这些文件在将成像信息转换为可量化的数据方面非常耗时, 并且此过程容易受到人为错误和偏差的影响。对来自原位细胞的 ca^{2 +}信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 内任意选择的感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息。因此, 为了最大限度地从使用 ca^{2 +}染料或光遗传学 ca^{2 +}成像获得的高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当的空间和时间分析。本文概述的协议将描述如何从 ca^{2 +}成像记录中获得大量数据, 以促进更完整地分析和量化从细胞中记录的 ca^{2 +}信号, 该信号使用基于时空图 (stm) 的分析和基于粒子的分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca^{2 +}信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca^{2 +}信号在一个专门的群体的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc), 使用 gecis。

引言

ca2⁺是一种无处不在的细胞内信使, 它控制着广泛的细胞过程, 如肌肉收缩^1,2, 代谢³, 细胞增殖^3,4,5、^刺激神经末梢的神经递质释放 6^,7, 激活细胞核内的转录因子。⁷细胞内 ca^{2 +}信号通常采取的形式, 在细胞质 ca^{2 +}的瞬态升高, 这些可能是自发的或产生的激动剂刺激取决于^{细胞类型 8}。ca^{2 +}信号固有的空间、时间和强度参数, 如频率、持续时间、传播、速度和振幅, 可以提供细胞内信号5所需的生物信息^.7.,9. 细胞质^{ca 2 +}信号可能是由于细胞外空间中的 ca^{2 +}的涌入, 也可能是通过 ca 2⁺释放通道 (er) 从内质网 (er) 中释放的 a^{2 +}释放 (er), 如 ryanodine 受体(ryr) 和肌醇-三磷酸盐受体 (ip 3r)¹⁰。ryr 和 ip_3r都可能有助于 ca^{2 +}信号的生成, 这些通道的协调开放, 再加上各种 ca^{2 +}流入机制, 可能会产生无数的 ca^{2 +}信号模式由 ca^{2 +}流入通道的数量和开放概率、ca^{2 +}释放通道的表达谱、ca^{2 +}流入和释放通道之间的接近度以及 ca 2 的表达式和分布所塑造的.⁺再摄取和挤出蛋白。ca^{2 +}信号的形式可能是均匀、持久、高强度的全球振荡, 可能持续几秒钟甚至几分钟, 传播细胞内和细胞内的 ca 2⁺波, 这些波可能跨越细胞内的距离超过 100μm^10、11、12、^13、14、¹⁵、¹⁶或更简短的空间本地化事件, 如 ca^{2 +}火花和 ca^{2 +}喷口发生在几十毫秒的时间尺度上, 传播小于 5μm^{17、18、19、20}。

荧光显微镜已被广泛用于监测 ca^{2 +}信号在分离和培养的细胞和完整的组织。传统上, 这些实验涉及使用荧光 ca^{2 +}指示器、比率和非比率染料, 如 fura2、fluo 或 rhod2 等^{, 以及21、22、23}。这些指标被设计成可渗透到细胞膜, 然后通过内源性酯酶被酯组的裂解困在细胞中。当细胞和组织被适当波长的光照射时, ca^{2 +}与高亲和力指标的结合会导致荧光的变化。细胞渗透性 ca^{2 +}指标的使用极大地增进了我们对活细胞中 ca^{2 +}信号的理解, 并允许通过检测 ca^{2 +}信号来实现这些信号的空间分辨率和量化通过其他手段, 如电生理。但是, 传统的 ca^{2 +}指标有几个限制, 例如在较长的记录周期^内发生的光漂白24。虽然较新的 ca^{2 +}指示染料 (如 cal520/ad990) 大大提高了信噪比和检测局部 ca^{2 +}信号²⁵的能力, 但光漂白问题仍然是一些研究人员^{关注的问题26,27,28}。缓慢的光漂白还限制了可用于录制的放大倍率、图像采集速率和分辨率, 因为增加的目标功率和更高的图像采集速率需要增加激发光强度, 而增加光漂白。

传统 ca^{2 +}指示染料的这些局限性在现场记录 ca^{2 +}信号时 (例如, 在记录来自完整组织的细胞内 ca^{2 +}信号时) 会加剧。由于上述问题, 使用细胞渗透 ca 2 + 指示器^就地显示 ca^{2 +}信号仅限于低功耗放大倍率和降低图像捕获率, 限制了调查人员记录和记录图像的能力。量化时间或空间上受限的亚细胞 ca^{2 +}信号。因此, 很难捕获、分析和欣赏 ca^{2 +}信号的空间和时间复杂性, 这在生成所需的生物响应时非常重要, 如上文所述。对来自原位细胞的 ca^{2 +}信号的分析通常依赖于来自视场 (fov) 范围内选定感兴趣区域 (roi) 的简单强度测量。任意选择 roi 的数量、大小和位置, 取决于研究人员的一时冲动, 会严重偏向所获得的结果。除了投资回报率分析的固有偏差外, 这种方法忽略了 fov 中包含的许多重要信令信息, 因为选择任意选择的 roi 中的动态 ca^{2 +}事件进行分析。此外, 对 roi 的分析未能提供有关所观察到的 ca^{2 +}信号的空间特性的信息。例如, 可能无法区分由传播的 ca 2⁺波引起的 ca^{2 +}的上升和高度本地化的 ca^{2 +}释放事件与 roi 内 ca^{2 +}信号的表格。

基因编码 ca^{2 +}指标 (gecis) 的出现从根本上改变了 ca^{2 +}成像在^{现场进行29、30、31、32、33的}方式.与染料相比, 使用 geci 有几个优点。也许最重要的是, geci 的表达可以以细胞特定的方式进行, 从而减少不感兴趣的细胞不必要的背景污染。与传统的 ca^{2 +}指标相比, geci 的另一个优点是光漂白减少 (因为与染色样品相比, 只有在细胞处于活动状态时才会出现荧光和随之而产生的光漂白), 尤其是在高的情况下放大倍率和高图像捕获率³⁴。因此, 利用 gecis 成像, 例如 gcam 系列光成因传感器, 使研究人员能够在现场记录简短的、局部的亚细胞 ca^{2 +}信号, 并在其细胞内研究 ca^{2 +}信号。以前无法实现的本机环境。为了最大限度地从这种高分辨率记录中恢复信息, 需要对 ca^{2 +}信号进行适当的空间和时间分析。需要注意的是, 虽然 geci 可以提供一些明显的优势, 但最近的研究表明, ca^{2 +}成像可以成功地从不同神经化学类的神经元的大量人群中成功地使用传统的ca^{2 +}指标, 不是基因编码到动物³⁵。这种方法使用后组织化, 以揭示多个不同类别的神经元在同步爆发中在高频放电, 并避免了对动物的基因改造可能干扰生理的可能性调查人员试图理解^35,36的行为。

本文概述的方案有助于更完整地分析和量化 ca 2 + 信号记录从细胞就地使用相结合的时空^{图 (} stm) 基于分析和粒子分析。这些协议还描述了如何在不同的细胞群中就地观察到的 ca^{2 +}信号的不同模式进行适当的分析。为了说明, 该方法将检查 ca^{2 +}信号在一个专门的人群的细胞在小肠, 间质细胞的 cajal (icc)。icc 是胃肠道 (gi) 中的特殊细胞, 表现出动态的细胞内 ca^{2 +}信号, 可视化使用小鼠表达 gcam^37,38,³⁹,^{40, 41,42}。ca^{2 +}瞬态连接到激活 ca^{2 +}激活 cl^通道(由ano1编码), 这对于调节肠道平滑肌细胞 (smc)⁴³的兴奋性非常重要^{, 44,45}。因此, 在 icc 中研究 ca^{2 +}信号是理解肠道运动的基础。小鼠小肠为这次演示提供了一个很好的例子, 因为有两类 icc 是解剖分离的, 可以独立地可视化: i) icc 位于圆形和纵向平滑肌之间的区域层, 周围的肠系膜神经丛 (icc-my)。这些细胞作为起搏器细胞, 并产生被称为慢波^46,47,48,49的电活动^;ii) icc 也位于一个神经丛中, 具有丰富的运动神经元 (深肌神经丛, 因此 icc-dmp) 的终端。这些细胞是对肠道运动神经传递的反应的介质 37^,39,40,50。icc-my 和 icc-dmp 在形态上是不同的, 它们^{的 ca 2 +}信令行为在完成其特定任务时具有根本的差异。icc-my 被星状, 并通过间隙^{连接 51, 52 形成}一个相互连接的单元网络。icc-my 中的 ca^{2 +}信号为简短且空间本地化的 ca^{2 +}释放事件, 通过 icc-my 网络异步发生在多个站点上, 在 fov (以60x 目标进行成像)^中可视化。这些异步信号被临时组织成1秒的集群, 如果一起制表, 相当于 ca2 + 中净 1^的细胞上升。这些信号在 icc 网络内从细胞传播, 从而将从亚细胞位点生成的 ca^{2 +}信号组织到组织宽 ca^{2 +}波中。icc-my 中 ca^{2 +}信号的时间聚类和求和被称为 ca^{2 +}瞬态聚类 (ctc)³⁸。ctc 有节奏地发生 (例如, 在小鼠体内每分钟发生30次类似的持续时间和类似的 ctc 之间的时间)。相反, icc-dmp 是纺锤形细胞, 有的具有二次处理, 分布在 smc 和静脉曲张神经过程之间, 并不独立形成网络^51,52。然而, icc-dmp 形成与 smc 的缝隙连接, 并在这个更大的合胞体 (称为 sip 合胞⁵³) 中发挥作用。ca^{2 +}信号发生在细胞长度沿线的多个点, 但这些瞬态并不被夹带或暂时聚集, 正如在 icc-my^{37 中}观察到的那样。icc-dmp 中的 ca^{2 +}信号以随机方式发生, 具有不同的强度、持续时间和空间特征。下面的协议, 使用 icc-my 和 icc-dmp 中的 ca^{2 +}信令示例, 描述了在特定类型的原位细胞中分析复杂信号的技术。我们利用诱导 cre-lox p 系统在 icc 中专门表达 gmp6f, 在诱导由 icc 特定启动子 (kit) 驱动的 Cre-Lox 酶 (cre) 激活后。

研究方案

本研究中使用的所有动物和执行的协议都符合国家实验室动物护理和使用健康研究所的规定。所有程序都得到了里诺内华达大学动物使用和护理机构委员会的批准。

1. kitgamp6f 小鼠的产生

1. cross ai95 (rcl-gmp6f)-d (gmp6f 小鼠) 和 c-kit^{+ cre-ert2} (kit-cree) 生成 icc 特定 gmp6f 表示动物 (kit-cre-gmp6-小鼠)。
   请注意:GCaMP6f 的使用是由于其报告的效率, 在局部, 短暂的细胞内 ca^{2 +}信号在现场和体内⁵⁴。
2. 在6-8周的年龄向 kit-cre-gmm6f 小鼠注射他莫西芬, 以诱导 cc 中的 cre 重组酶激活和随后的 gmp6f 表达 (图 1)。
   1. 要产生他莫西芬溶液, 在一个试剂盒和一个漩涡中溶解80毫克的他莫西芬 (见材料表) 在800μl 的乙醇中 (见材料表), 每次20分钟。
   2. 加入3.2 毫升的红花油 (通用), 以创建 20 mg/ml 的溶液, 然后在注射前30分钟进行声纳处理。
   3. 注射小鼠 (腹腔内注射;ip) 用0.1 毫升的他莫西芬溶液 (2 毫克他莫西芬) 连续三天。通过基因分型确认 GCaMP6f 表达, 并在首次注射10天后使用小鼠。
      1. 基因型小鼠通过从每只动物身上剪下一小块耳朵。然后, 利用 hotshot 方法⁵⁵在95°c 孵育耳夹在 naoh 的75ml 中孵育 60分钟, 然后用 75 ml 的 tris 缓冲液中和, 进行基因组 dna 分离。使用标准 pcr 来确定每种动物的基因型, 2 毫升的 dna 与 GCaMP6f 特异性引物^在20 毫升反应中的基因型。在2% 琼脂糖凝胶上运行10毫升 pcr 产物, 以确定野生类型 (297 bp) 和突变带 (~ 450 bp)。

2. ca^{2 +}成像组织的准备

1. 用异氟醚 (4%, 见材料表) 在通风罩中麻醉小鼠, 然后通过颈椎脱位进行牺牲。
2. 使用锋利的剪刀打开小鼠的腹部, 取出小肠, 放置在克瑞格-林格碳酸氢盐溶液 (krb)。沿肠系膜边界打开小肠, 并用 krb 冲洗所有腔内物质。使用尖锐的解剖, 去除粘膜和粘膜下的层。
   请注意:krb 溶液的组成如下 (mm): ncl 11.5、kcl 4.7、ccl 2 2.5、mgcl 2 1.2、 nhco₃ 23.8、kh₂po 4 1.2、dextrose 11.0. 当在37°c 时, 当与95% 的 o2-2–5% 的 co2 平衡时, 该溶液的 ph值为7.4。
3. 使用小引脚, 将小肠组织固定在5毫升体积的底部, 直径60毫米的 sylgard 涂层盘, 圆形平滑肌层朝上。在37°c 条件下, 用加热的 krb 溶液完美地制备, 在实验前1小时的平衡期内进行。
4. 在这一平衡期之后, 使用共聚焦显微镜对小肠 icc-my 和 icc-dmp 进行原位 ca 2⁺成像 (本方案中的图像是用装有纺丝盘的共聚焦显微镜获得的)。由于上述 geci 的优点, 请使用高分辨率延时图像 (& gt;30 帧/秒, fps) 与高功率目标 (60–100x) 相结合, 在 icc 中获取动态 ca^{2 +}信号的电影。
   请注意:为了减少组织运动, 请在记录过程中应用尼卡地平 (0.1μm), 如前面所述^{的 37、38、39、40、41.}
5. 利用不同的解剖位置、形态和基础 ca² + 活性模式, 区分小肠中的 icc-my 和 icc-dmp。
   1. 定位 icc-my 在肠系膜神经丛的水平, 在小肠的圆形和纵向平滑肌层之间。它们呈星状, 形成一个连接的网络 (图 3 a)。ctc (如上所述) 通过 icc-my 网络传播, 正常发生约30分钟的循环。
   2. 相反, 将 icc-dmp 定位在深层肌肉丛水平的单个平面上, 位于圆形平滑肌层和粘膜下神经丛之间。icc-dmp 不形成网络, 是纺锤形细胞 (图 2a), 不显示常规传播事件, 而是火灾随机、局部细胞内 ca^{2 +}瞬态。
6. 无论使用何种采集软件, 都可以将影片保存为 tiff 图像堆栈。

3. 利用时空映射 (stm) 分析 icc-dmp 中的随机 ca^{2 +}信号

1. 使用 imagej 软件 (nih, 美国, 免费下载 http://imagej.nih.jov/ij) 和定制软件 (volumetry, g8d 版, gwh, 在 mac os 上可操作, 请联系 grant hennig grant. hennig @关于电压测量访问和使用的查询的 med.uvm.edu)
   请注意:后面的部分 (从第3.9 步开始) 中还提供了仅使用 imagej 来完全分析这些时空地图的另一种方法。
2. 打开 "音量法", 然后使用鼠标右键单击以打开包含电影文件的文件夹。左键单击要分析的影片文件, 以 "体积法" (必须采用未压缩的 tiff 格式) 将其打开。一旦打开, 电影将包含在一个蓝边窗口 (电影窗口), 将包括一个很大的区域的右侧屏幕。屏幕的左侧将包含 "绘图" 窗口 (上图) 和 "痕迹" 窗口 (较低).
3. 通过按住 shift 并同时使用鼠标中键 (mmb, 减小大小) 向上滚动或使用 mmb 向下滚动 (增加大小) 来调整影片的尺寸。按 "a" 启动或停止播放;播放速度可以通过按向上和向下箭头键来调整。
4. 要使用 volumetry 创建 stm, 请在单击并拖动鼠标左键时按住 shift, 从而在整个单元格上绘制 roi。通过在 roi 的各个角落使用 mmb 滚动来调整 roi 的方向。当 roi 在要分析的单元格上就位时 (图 2a), 使用 "电影窗口" 中的右键单击可访问 "roi stm:stmiavg > xrow", 然后单击鼠标左键在 "绘图" 窗口中创建单元格活动的 stm (还可以选择 "stmxvg > yro" 选项w ', 选择哪一个将取决于单元格的方向是否与 x 轴或 y 轴更加对齐, 例如,突出显示的图 2 a在 y 轴上的单元格更定向 ')。
5. 左键单击 "绘图" 窗口中的 stm, 然后按 "p" 减去平均背景噪声, 然后按 "h" 以增加 stm 的对比度。通过右键单击它来访问 "stm 加载保存-将 stm 另存为. tif", 然后左键单击以保存为 tiff 来保存 stm。
6. icc-dmp 的其余部分将在 imagej 中进行。imagej 由两个主要组件组成, 一个工具栏在显示器顶部有固定的位置, 一个是移动用户界面。使用 imagej, 打开 icc-dmp ca 2⁺活动的 stm tiff 文件 (在图像 j 工具栏上打开文件)。
7. 打开音量测量创建的 stm, 它将具有垂直方向的时间。imagej 将自动以 rgb 或16位图像的形式打开 tiff 文件。要提高图像质量, 请在 imagej 工具栏中左键单击 "图像"。在第一个选项 "type" 上滚动以显示各种图像格式的下拉菜单, 滚动 "32位", 然后单击鼠标左键进行更改。
8. 要使 stm 从左到右可读时间, 请单击 imagej 工具栏上的以下路径: "图像转换-向左旋转 90度"。也可以创建原位 ca^{2 +}活动的 stm 使用线性与 imagej 单独没有 volumetry, 这是详细的下面。
   请注意:创建 stm 后, 无论使用哪种软件生成它们, 都会以相同的方式对其进行分析。若要跳过在 imagej 中创建 stm 的此替代方法, 请跳到步骤3.19。
9. 要使用 imagej 创建 stm, 请打开组成 icc-dmp ca 2⁺活动记录的 tiff 文件堆栈 (在 imagej 工具栏上打开文件)。imagej 将自动以 rgb 或16位图像的形式打开 tiff 文件。要提高图像质量, 请在 imagej 工具栏中左键单击 "图像"。在第一个选项 "type" 上滚动以显示各种图像格式的下拉菜单, 滚动 "32位", 然后单击鼠标左键进行更改。
10. 背景噪声 (由自动荧光或相机噪声引起) 现在应从影片中减去。在 imagej 界面中左键单击 "矩形选择" 功能, 并在影片的背景荧光上绘制 roi (通过左键单击并拖动到所需的大小和形状)。
11. 选择 roi 后, 在 imagej 工具栏中左键单击 "分析", 然后从生成的下拉菜单中左键单击 "直方图"。然后, 将出现一个弹出框, 询问要计算的像素范围值;imagej 具有预先选择的 roi 值, 因此左键单击 "确定"。
12. 单击 "确定" 后, 将出现一个包含直方图的新弹出框, 显示 roi 中背景的像素噪声的值分布。记下直方图下方列出的平均值, 然后关闭弹出框。
13. 单击 "32位影片", 然后通过左键单击 imagej 工具栏上的 "编辑", 滚动到 "选择", 然后从显示的下拉菜单中单击 "全选", 选择整个 fov。
14. 左键单击 imagej 工具栏上的 "处理", 滚动到 "数学", 然后从显示的下拉菜单中向左单击 "减去"。
15. 将出现一个弹出框, 其中可以插入要从 fov 中减去的值。在上面的步骤3.12 中输入从直方图中获取的平均值, 然后单击 "确定"。然后, imagej 将要求处理 tiff 堆栈中的所有帧 (而不仅仅是影片当前所在的单个帧)。点击 "是"。
16. 点击 "是" 后, 电影将变为黑色。要更正此问题, 请左键单击 imagej 工具栏中的 "图像", 然后滚动 "调整"。左键单击 "光明对比度" (b & c) 的第一个选项。这将带来一个弹出框, 亮度和对比度的各个方面可能会被修改。左键单击 "自动" 选项一次, 以显示电影中增加的质量。让这个 b & c 弹出框打开, 供将来使用。
17. 要创建线形, 首先右键单击 imagej 界面中的换行工具, 以显示不同行的选项;左键单击 "分段线", 从列表中选择它。选择 "分段线" 工具后, 使用左单次单击沿单个 icc-dmp 的中轴绘制一条线。每次左键单击都会在该特定点固定线, 然后可以在任何所需的角度进一步自由移动线条。行完成后, 双击左键以固定行。
18. 左键单击 imagej 工具栏上的 "图像", 滚动 "堆栈", 然后单击 "恢复" 选项。将出现一个弹出框;左键单击 "旋转 90度" 选项, 这将从左到右方向线块, 以便它可以在 x 轴上根据时间进行校准和读取, 在 y 轴上有空间。单击 "确定" 创建 stm。
19. stm 的强度将在灰度上创建, 高强度^{ca 2 +}信号显示为不同程度的白色、白色或浅灰色, 具体取决于它们的强度。通常情况下, 创建的线数的对比度需要改进。通过单击 "自动" 在 b & c 弹出框中执行此操作。
20. 在任意像素值的 stm 上给出了线数荧光的强度。为了准确地测量 stm 发出的 ca^{2 +}信号的振幅, 现在需要对 stm (f) 的荧光值进行归一化。使用 imagej 界面中的 "矩形选择" 功能, 在 stm 的某个区域上绘制 roi, 该区域显示最均匀和最不强烈的荧光区域 (f₀)。
21. 重复在3.11-3.12 中执行的步骤, 以获取所选 roi 中强度的平均值 (f₀₎, 然后通过左键单击 imagej 工具栏中的 "编辑选择选择全部" 来选择整个 stm。
22. 左键单击 imagej 工具栏上的 "处理", 然后滚动到 "数学";左键单击 "划分" 从显示的选项。在随后的弹出框中, 输入从步骤3.21 获得的平均值 (f₀₎。当整个 stm 除以 (f₀) 时, stm 将变为黑色;点击 b & c 弹出框中的 "自动" 来纠正此问题。线轴现在被校准为振幅, 荧光强度表示为 f只能 ff₀。
23. stm 当前将显示 x 轴上 tiff 堆栈中的帧数以及表示 y 轴上单元格长度的像素数。为了量化 ca^{2 +}信号中的时间和空间信息, 请校准空间和时间的 stm。左键单击 imagej 工具栏中的 "图像", 然后单击 "属性"。将出现一个弹出框。在此窗口中, 输入适当的值以完全校准 stm。
24. 对于 "像素宽度", 输入以秒为单位捕获单个帧所需的时间长度。例如, 在 5 fps 处, 输入值 0.2, 为 50 fps 输入值 0.02, 为 33 fps 输入0.033 的值等。对于 "像素高度", 输入每个像素代表多少微米 (将取决于所使用的目标和用于采集的相机)。在单击 "确定" 之前, "voxel 深度" 保持在1。窗口内不需要调整其他参数。
    请注意:单击 "确定" 后, stm 将完全校准振幅、空间和时间。stm 上的振幅将表示为 f只能为 f只能 0 , x 轴上的时间将以秒为单位表示, y 轴上的空间将以μm (图 2b) 表示。stm 上的 ca^{2 +}事件现在已准备好进行测量, 校准的 stm 也可以保存为单个 tiff 图像, 以便以后进行分析。
25. imagej 有许多内置的彩色编码查找表 (lut), 可用于对 stm 进行编码。通过左键单击路径 "图像查找表" 上的 imagej 工具栏应用内置的 lut, 然后选择要应用的 lut。自定义的 lut 也可以通过左键单击路径 "文件导入-lut" 上的 imagej 工具栏, 然后选择要导入的 lut, 导入到 stm 中。例如, 图 2c中显示的 stm 已将定制的 lut "quballete" (英国贝尔法斯特皇后大学) 应用于它, 将暖色 (红色、橙色) 编码为强烈的 ca^{2 +}荧光区域和冷色 (黑色、蓝色) 区域为低 ca^{2 + 区域}荧光。
26. 要插入振幅校准栏以指示各种颜色所表示的振幅范围, 请从 imagej 工具栏左键单击 "分析", 滚动到 "工具", 然后从显示的菜单中选择 "校准栏"。给出了校准条 stm 上的大小、缩放、范围和位置的选项;根据需要调整这些设置, 然后单击 "确定"。请注意, 插入校准栏时, imagej 会创建一个包含校准栏的新 stm, 使原始版本保持不变并分离。
    请注意:如果在插入校准栏时勾选了 "叠加" 框, 则不会生成新的 stm。
27. 要开始分析单个 ca^{2 +}事件, 请单击 imagej 界面上的 "直线" 选择器。通过最初的左键单击 stm, 绘制一条直线, 穿过与 x 轴平行的 ca^{2 +}事件的中心 (相对于时间)。通过第二次左键单击完成行 (图 2d)。
28. 点击 imagej 工具栏上的 "分析", 然后左键单击 "绘图配置文件"。一个新的框将出现 ca^{2 +}事件的绘图配置文件 (图 2e)。
    请注意:此框中的 "列表" 选项将生成生成的绘图的 xy 值的列表, 如果需要, 可以将其复制到电子表格程序中, 以创建跟踪。
29. 要测量绘图配置文件中表示的 ca^{2 +}事件的振幅, 请左键单击 imagej 界面上的 "直线" 选择器。然后, 绘制一条从绘图轮廓基线到 ca^{2 +}事件峰值的垂直线;行的长度 (如 imagej 接口所示) 将表示事件的振幅, 表示为 f/f₀ (图 2e)。
30. 使用获得的振幅值, 可以通过在最大振幅为 50% (最大振幅为一半的完整持续时间, fdhm) 或事件的整个持续时间点绘制一条穿过事件宽度的直线来测量 ca^{2 +}事件的持续时间可以根据需要进行测量 (图 2e)。
    请注意:实验者将需要为这些录音中的有效 ca^{2 +}事件的阈值设计特定的标准。在我们的实验中, ca^{2 +}事件被指定为有效的分析, 如果它的振幅是 & gt;15% 的最大振幅事件在记录的控制部分。然而, 这些阈值将取决于正在研究的特定组织和细胞, 只是任意的指南, 需要对每一种类型的组织和细胞进行具体的优化。
31. 通过沿 ca^{2 +}事件图形轮廓的上冲程或向下冲程绘制一条线, 可以相应地计算上升或下降的速率。绘制线条后, 可以将鼠标光标移动到线条开始和结束的位置。当光标固定在这些点上时, 此位置的 x、y 坐标将显示在 imagej 接口的左下角。因此, 通过获取线开始 (x 1 , y₁) 和结束 (x₂,_y2) 的 x, y 值, 可以将上升或下降率 (fn) 计算为线的斜率, y 2-y 1/x_{2-x 1} ( 图2f).
32. 为了计算 ca^{2 +}事件的传播或空间传播, 请在 imagej 接口上的 "直线" 选择器上单击鼠标左键单击。然后, 沿 y 轴沿 ca^{2 +}事件的长度绘制一条直线。行的长度 (如 imagej 接口所示) 将表示以μm 表示的事件的空间扩展 (图 2g)。
33. 通过沿传播事件的前面绘制一条线并计算该线的斜率来确定传播 ca^{2 +}事件的速度。这可以以步骤3.32 中所述的类似方式手动执行, 方法是确定行开始 (x 1, y 1) 和结束 (x₂, y₂) 的 x,_{y 值;}当鼠标光标位于 stm 上时, 这些值将显示在 imagej 界面的左下角。
34. 在收集 ca^{2 +}事件量化所需的参数后, 将这些值平均值池起来, 在每个单元的基础上为每个参数生成平均值;或者, 将所有原始值放置在分布直方图中, 以显示它们的范围 (图 2h)。

4. 基于粒子分析的 icc-my ctc 的量化

1. 在使用 ptcls 分析 volumetry 中的影片之前, 需要将影片的空间和时间校准插入到文件名中。编辑要在 volumetry 中分析的所有文件, 以在标题中包含每个帧等于的秒数以及每个像素等于用一个破折号分隔的微米数, 并将值封装在方括号中。例如, 在具有60x 目标 (512 x 512) 的 33 fps 上获得的影片应将 [0.22–0.02] 插入其文件名中。
2. 打开 "音量法", 然后使用鼠标右键单击以打开包含电影文件的文件夹。左键单击要分析的影片文件, 以 "体积法" 打开它 (图 3 a 必须采用未压缩的 tiff 格式)。
3. 为了准确计算来自整个 fov 的 ca^{2 +}信号, 影片将首先进行分化和平滑, 以消除背景干扰 (相机噪声、自动荧光等), 并提高信噪比。在电影窗口中, 右键单击以显示菜单并使用右键单击访问 "stk 筛选器差异化", 再次右键单击以输入要区分的值, 按 enter, 然后单击鼠标左键应用 (对于以 33 fps 获得的电影, 其值为 2 (t= ±66-70 毫秒), 效果很好, 随着图像捕获速率的增加, 该值也会增加)。
   请注意:在此上下文中的差异将减少在指定帧数上没有动态活动的记录区域 (像素) 的强度。因此, 如果插入 "2" 值, 则会分析录制的每个帧中的每个像素, 如果在该帧中之前和之后的像素荧光1帧没有动态变化, 则这些像素内的强度将从录制中减去。因此, 消除了非动态背景噪声, 增加了噪声信号。
4. 通过应用高斯滤波器平滑差异化影片。右键单击 "电影窗口", 打开菜单, 然后使用右键单击访问 "stk 滤波器-高斯 krnl", 再次右键单击以插入一个值 (始终使用奇数, 对于在 33 fps 获取的电影, 5 的值效果很好, 1.5 x 1.5μm, stddev 1.0) 输入一个值, 按 enter, 然后左键单击以应用 (图 3b)。
5. 首先选择电影的一个周期 (20-40 帧), 然后是 ctc 的出现, ctc 之后的20-40 帧, 开始创建 ptcl。为此, 请使用 mmb 在黄色栏上从左到右滚动, 从而在影片中滚动。
6. 进行选择后, 在电影窗口中使用右键单击可访问 "stk 操作–坡道 ds ptclinfo", 然后单击鼠标左键进行应用。此函数运行 ptcl 分析例程, 逐步将阈值从最大强度提高到最小强度。这将以图形方式显示在绘图窗口中, 作为噪声的图形, 也显示在 "跟踪窗口" 中, 显示为三个彩色痕迹, 绿色轨迹显示 ptcl 的数量, 红色的痕迹显示 ptcl 的平均大小, 蓝色的痕迹显示绝对强度阈 值。
   注: 每个阈值上的 ptcl 的数量和平均大小将自动计算, 然后使用 ptcll 的平均大小开始下降的强度应用半手动阈值, 该强度发生在红色轨迹的拐点。跟踪窗口 (图 3d, 即由于大量空间受限的噪声 ptcl 降低了 ptcls 的平均大小)。
7. 在 "绘图" 窗口中, 按 "h" 以直方图平衡 ptcl 噪声的图形。通过按 "[" 来循环浏览配色方案, 直到背景颜色为白色, 顶部有彩色痕迹。
8. 按 "f" 弹出测量工具, 然后在彩色图形移动到右侧的交叉点上单击图。这将在下面的 "跟踪" 窗口的滚动条中标记一条垂直线。
9. 在 "跟踪" 窗口中, 从红色跟踪的拐点从左到右滚动 mmb, 直到步骤4.10 中创建的标记的白色垂直线, 并确保通过右键单击选择蓝色轨迹, 读出将在 t 中显示的 "yavg"他的左下角的左角的痕迹窗口。通过在 "跟踪" 窗口内按一次 mmb 来取消选择。
10. 在电影窗口内, 按 "c" 弹出一个颜色轮, 然后按 "d" 调整阈值。有效的 ptcl 现在将在电影窗口中显示为红色 (图 3c), 饱和的 ptcl 将显示为白色。使用鼠标左键向上滚动, 删除白色区域。
11. 使用 mmb 向上或向下滚动以调整色轮中的黄色数值, 将此值调整为步骤4.11 中的 yavg 值。这将在确定的阈值点上将所有内容指定为红色的活动 ca^{2 +}瞬态 ptcl。要将其另存为基于坐标的粒子文件, 请使用右键单击可访问 "stk 3d 保存 ptcls 0", 然后左键单击以保存该文件。
12. 退出音量测量并重新打开。打开步骤4.13 中创建的 ptcl 文件 (. gpf 文件)。在此文件类型中, 所有活动 ca^{2 +}瞬态都保存为统一的蓝色 ptcl (图 3e)。由于每个 ptcl 都是具有自己的 id、面积和周长坐标、状态标志 (见下文) 和结果数组的单个实体, 因此简化了对 ptcl 的时空特征或 ptcl 之间的时空特征的分析。
13. 要开始 ptcls 分析, 请使用电影窗口中的右键单击以访问 "ptcls stops-标志" 和 "左键单击以应用", 删除任何剩余的 ptcls 噪声 (生成. gpf 文件时创建的小无效 ptcls)。此操作将标记大于 6μm 2 (~ 直径 > 2μm), 电压测量将指定它们为 "flag 1" 选择。完成此操作后, 超过此阈值 (flag 1) 的 ptcl 将在影片窗口中显示为浅紫色, 而阈值以下的任何 ptcls 都将保持其基本蓝色 (图 3f)。
14. 通过在电影窗口中使用右键单击来访问 "ptcl STKops-StatMap 标志 =", 创建 ptcl 活动的热图表示形式。通过右键单击此最终路径, 可以输入要分析的标志分配。因此, 如果要量化分配给 flag1 的 ptcl, 只需输入 "1", 按 enter, 然后左键单击即可应用。这将生成一个热图, 显示整个录制长度的总 ptcl, 在整个录制过程中出现不同的颜色 (%) (图 3g, 暖色表示在该位置发生的次数增加)。
15. 通过右键单击热图来访问 "stm 加载保存-将 stm 保存为. tif", 然后左键单击以保存为 tiff。
16. 通过在电影窗口中使用右键单击来访问 "ptcl 测量 stk =" 来量化 ptcl 活动, 通过右键单击此最终路径, 可以输入要分析的标志分配。因此, 如果要量化分配给 flag1 的 ptcl, 只需输入 "1", 按 enter, 然后左键单击即可应用。这将在跟踪窗口中生成一系列跟踪。
17. 默认情况下, 电压测量将在步骤4.17 中生成的 ptcl 轨迹叠加在一起。使用 "跟踪" 窗口中的右键单击将它们分开, 以访问 "对齐分离跟踪", 并单击鼠标左键应用。这将揭示四种不同的 ptcl 痕迹, 这些痕迹量化了电影中的 ca^{2 +} ptcl 活性, 显示 ptcl 面积 (绿色)、ptcl 计数 (红色)、ptcl 大小 (青色) 和 ptcl 大小标准偏差 (蓝色) 绘制的时间 (图 3h)。
18. 这些跟踪可以保存为文本文件, 可以将其导入到电子表格程序中进行进一步分析。若要保存跟踪, 请按住 shift 并在跟踪窗口中使用右键单击以访问 "将 roi 作为文本排序", 然后单击鼠标左键保存文件。然后收集这些信息, 并以直方图或其他适当的图形表示形式进行说明 (图 3h)。
19. 为了观察 ptcl 的初始发生 (即查看发射地点), 这些初始 ptcl 被赋予了不同的标志分配。为了更好地隔离网络内发生的发射点, 只有那些没有与上一帧中的任何粒子重叠但与接下来70毫秒中的粒子重叠的 ptcl 才被视为发射点。
20. 若要应用此阈值, 请使用电影窗口中的右键单击以访问 "ptcl 行为-f1 InitSites>F=3", 然后单击鼠标左键进行应用。这将将启动 ptcls 指定为 "flag 3", 满足此条件的 ptcls 现在将在影片中显示为石灰绿色 (图 4 a)。
21. 体积测量还提供了在给定的 fov 中量化和绘制 ptcl 射击地点数量的能力, 以及在 ctc 期间绘制其射击概率的能力。若要分析这些参数, 请创建启动 ptcls (flag 3) 的热图, 如步骤 4.16 (图 4b) 所述。
22. 在 "绘图" 窗口中左键单击, 然后按 "c" 弹出一个颜色轮, 然后按 "d" 到阈值。启动 ptcls 的热图将变成灰色和白色。通过使用鼠标左键向上滚动并阈值热图中的 ptcl 来删除所有白色, 以便只有有效的 ptcl 被灰色覆盖 (通过使用 mmb 向上和向下滚动来调整阈值)。
23. 在 "绘图" 窗口中的热贴图上右键单击可访问 "stm PTCLs-Find 100 ptcls 70", 然后单击鼠标左键进行应用。这将指定地图中大小大于70像素²的所有灰色 ptcl 作为单独的彩色编码起始 ptcl 或 ptcl 发射场分配 (图 4c)。
24. 通过右键单击 ptcl 射击贴图并访问 "stm ptcls-create ptcl rois" 并进行左键单击来查看每个射击站点的活动。这将在电影窗口中生成一个新图像, 其中显示所有单独的彩色 ptcl 射击站点, 其周围有 roi。
25. 在电影窗口中使用右键单击可访问 "ptcl 测量-PTCLpixROIBM>=1", 然后单击 "以应用"。这将标识影片窗口中至少包含一个 ptcl 的所有 roi, 并将在 "跟踪" 窗口中绘制这些 roi 中的所有活动。默认情况下, 这些跟踪将相互叠加。若要分隔它们, 请在 "跟踪" 窗口中使用右键单击以访问 "对齐分隔的跟踪", 然后单击鼠标左键应用。若要保存跟踪, 请按住 shift 并在跟踪窗口中使用右键单击以访问 "将 roi 作为文本排序", 然后单击鼠标左键保存文件。
26. 每个射击地点的活动也可以绘制为发生图。为此, 请在电影窗口中使用右键单击以访问 "ptcl 测量-rop 钢琴 10", 然后单击鼠标左键进行应用。这将生成一个图形的所有射击地点相对于时间在绘图窗口。每个射击站点将显示为一个单独的彩色实体, 每个在其自己的 "车道" 中, 这些图对应于 ctc 期间启动的 ca^{2 +} ptcl (图 4d, e) 通过右键单击它们来访问 "stm" 保存这些发生地图加载保存-将 stm 保存为. tif ", 然后左键单击以保存为 tiff。
27. 要量化在 ctc 期间在每个射击现场射击的概率, 请使用电影窗口中的右键单击以访问 "ptcl 行为-标记 is = 1", 然后单击鼠标左键应用。这将标识影片中包含超过阈值的 ptcl 的所有帧, 这些帧将在影片窗口的底部标记为垂直蓝线。
28. ctc 表现为 fov 内多个发射点的异步发射的快速聚集, 每个 ctc 周期之间的间隙约为1。ctc 之间无活性 ptcl 的这种规律性和长期间隔被用来进一步定义用于分析的 ctc。
29. 在电影窗口中使用右键单击可访问 "ptcl 行为块 is gap < =", 并使用右键单击最后一点输入数字。此命令将步骤4.28 中标识的活动 ptcl 帧分组为块和块, 这些块基于分隔活动 ptcl 的帧数。例如, 对于 33 fps 的录制, 10个值效果很好。如果活动 ptcls 相距小于10帧 (330 毫秒), 则会将其分组为单个块进行分析 (然后将这些块显示为电影窗口底部垂直蓝色线条上的粉红色矩形, 现在每个粉红色矩形都指示 ctc)。
30. 在电影窗口中使用右键单击可访问 "ptcl 测量-ptcl 事件 prob"。这将生成一个可导入到电子表格程序中的文本文件。此文本文件将提供大量数据, 说明从步骤4.16-4.23 中定义的启动站点的性质及其对 ctc 的贡献。
    请注意:文本文件将显示起始站点的数量 (称为 "域")、站点的大小 (以像素为单位和μm²)、每个启动站点在每个 ctc 期间发射一次或多次的概率 (给定%)、平均持续时间和大小发生在该起爆点的 ptcl、ctc 周期的数量 (如步骤4.23 所定义) 以及在每个 ctc 周期中发射的射击地点的百分比。这些信息以直方图或其他适当的图形表示形式收集和说明 (图 4f)。

结果

利用 kit-cre-gmcmp6f 小鼠 (图 1), 可以对 icc 在胃肠道中的动态 ca^{2 +}信号行为进行原位成像。通过共聚焦显微镜, 可以在不污染来自 icc 其他种群的信号的情况下获得 icc 特定种群的高分辨率图像, 但在解剖上不同的焦点平面上 (图 2a)^37,39,40,

讨论

ca^{2 +}对完整组织内或细胞网络内特定类型细胞的成像通常揭示 ca^{2 +}瞬态的复杂模式。这项活动需要认真和深入的分析和量化, 以获取尽可能多的关于这些事件的基本事件和动力学的信息。stm 和 ptcl 分析提供了一个机会, 最大限度地增加了从这种类型的录音中获得的定量数据的数量。

icc-dmp 的窄纺锤形形态使其非常适合从上述 stm 中获得的 stm 分析。但是, 此分析?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6