세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

요약

유전자 인코딩된 Ca^{2 +} 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아^{2 +} 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아^{2 +} 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

초록

캘리포니아^{2 +} 이미징 격리 된 셀 또는 그대로 조직 내의 세포의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 신호의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도 진폭 등 본질적인 세포내 신호 전달에 필요한 몇 가지 생물 학적 정보를 제공할 수 있습니다. 고해상도 캘리포니아^{2 +} 시간이 걸릴 정량 데이터 이미징 정보 번역의 관점에서 프로세스 및이 프로세스는 큰 데이터 파일의 인수에 결과 일반적으로 이미징 인간의 오류와 편견에 감염 될 수 있습니다. 캘리포니아^{2 +} 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 시야 (FOV) 내의 관심 (ROI)의 임의로 선택한 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 이 이렇게 많은 FOV에 포함 된 중요 한 신호 정보를 무시 합니다. 따라서, 캘리포니아^{2 +}염료 또는 optogenetic Ca^{2 +} 얻은 같은 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 이미징, 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca^{2 +} 신호는 필요 합니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜 어떻게 대용량 데이터의 더 완전 한 분석 및 캘리포니아^{2 +} 신호의 조합을 사용 하 여 셀에서 기록의 정량화를 촉진 하기 위하여 캘리포니아^{2 +} 영상 녹음에서 얻어질 수 있다 설명 spatiotemporal 지도 (STM)-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아^{2 +} 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca^{2 +} 중간 셀의 Cajal (ICC), GECIs를 사용 하 여 작은 창 자에 있는 세포의 특수 인구에 신호.

서문

캘리포니아^{2 +} 는 다양 한 근육 수축^1,2, 신진 대사³, 셀 확산^3,4, 등의 세포 프로세스를 제어 하는 유비 쿼터 스 세포내 메신저 ⁵, 신경 터미널^6,7, 신경 전달 물질 방출의 자극과 활성화 전사의 핵에 있는 요인. ⁷ 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 종종 cytosolic 캘리포니아^{2 +}, 과도 고도의 형태를 걸릴 및 이러한 자발적인 수 수 또는 셀 유형⁸따라 주 작동 근 자극에서 발생 한다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도, 진폭 등 본질적인 세포내 신호^5, 에 필요한 생물 정보를 제공할 수 있습니다. ^{7 , 9}. 세포질 캘리포니아^{2 +} 신호는 캘리포니아^{2 +} 릴리스 채널 ryanodine 수용 체 등을 통해 캘리포니아^{2 +} 또는 캘리포니아^{2 +} 릴리스 바인딩과 그물 (응급실)에서 세포 외 공간에서의 유입에서 발생할 수 있습니다 (RyRs)과 이노 시 톨-트라이-인산 염 수용 체 (IP₃Rs)¹⁰. RyRs 및 IP₃Rs 두 캘리포니아^{2 +} 신호 발생에 기여할 수 있으며 다양 한 Ca^{2 +} 유입 메커니즘 결합이 채널의 공동된 여 캘리포니아^{2 +} 신호 패턴의 무수 한 발생할 수 있습니다. 그 숫자에 의해 형성 및 확률 캘리포니아^{2 +} 유입 채널, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 릴리스, 그리고 식 채널과 Ca^{2의 근접에 캘리포니아2 + 릴리스 채널의 식의 프로필을 열고 +} 단백질을 재흡수 및 압출. 캘리포니아^{2 +} 신호 형태의 유니폼, 오래 지속, 강도 높은 글로벌 진동 전파 세포내와 세포 Ca^{2 +} 파 세포내 거리 교차 수 있습니다. 몇 초 또는 분, 마지막 수 있습니다. 걸릴 수 있습니다. 100 µ m^{10,11,12,13,,1415,16}또는 캘리포니아 2 +^{와 같은 더 간단한, 공간적 지역화 된 이벤트} 불꽃 및 캘리포니아^{2 +} 퍼프 미만 5 µ m^17,18,,1920확산 수십 밀리초 timescales에 발생 하는.

형광 현미경 검사 법은 모니터링할 Ca^{2 +} 신호 분리 및 배양 세포에 그대로 조직에서 널리 사용 되었습니다. 전통적으로,이 실험 형광 캘리포니아^{2 +} 지표, 비율의 사용 및 비 비율 염료 Fura2, Fluo3/4 등 Rhod2, 다른 사람의 사이에서 ^21,,2223. 이러한 표시기는 세포 막에 융 화 되 고 다음 생 esterases 통해 에스테 르 그룹의 분열에 의해 세포에 갇혀 될 하도록 설계 되었습니다. 캘리포니아^{2 +} 높은 선호도 지표의 바인딩 세포와 조직 적합 한 파장의 빛에 의해 조명 되었다 형광에 변경 발생 합니다. 세포 투과성 캘리포니아^{2 +} 지표를 사용 하 여 크게 캘리포니아^{2 +} 살아있는 세포에서 신호 및 공간 해상도 Ca^{2 +} 신호 시 금에 의해 불가능 했던이 신호의 정량화를 허용의 우리의 이해를 향상 통해 전기 생리학 등 다른 의미 합니다. 그러나, 전통적인 캘리포니아^{2 +} 지표 확장된 녹음 기간²⁴이상 발생 하는 photobleaching 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 새로운 Ca^{2 +} 표시기 염료와 같은 Cal520/590는 크게 향상 된 신호 소음 비율 및 로컬 Ca^{2 +} 신호²⁵를 감지 하는 능력을, 하는 동안 photobleaching 문제 일부 조사 ^{에 대 한 우려가 남아 수 있습니다. 26,,2728}. 깎아지른 듯한 photobleaching 또한 확대, 이미지 수집, 속도 제한 및 해상도 증가 객관적인 전력 및 이미지 수집의 요구 대로 녹음에 사용할 수 있는 여기 빛의 강도 증가 하는 photobleaching을 증가합니다.

전통적인 캘리포니아^{2 +} 표시기 염료는 캘리포니아^{2 +} 신호 제자리를 기록할 때 더욱 악화의 이러한 제한, 예를 들어 때 녹음 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 그대로 조직에서. 위의 문제로 인해 한 세포 침투성 캘리포니아^{2 +} 지표를 사용 하 여 제자리에 캘리포니아^{2 +} 신호 낮은 전력 확대에 국한 되었으며 이미지 캡처, 기록 조사 관의 능력 제한의 속도 감소 하 고 일시적으로 또는 공간적으로 제한 된 subcellular 캘리포니아^{2 +} 신호 계량. 따라서, 그것은 어려운 캡처, 분석, 및 캘리포니아^{2 +} 신호, 위에서 설명한 대로 원하는 생물학 응답의 생성에 중요 한 될 수 있는 공간 및 시간 복잡 감사 되었습니다. 캘리포니아^{2 +} 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 관심 (ROI) 한 시야 (FOV) 내의 선택된 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 수, 크기 및 ROIs, 연구원의 변덕에 의존의 위치 임의 선택 결과 편견 심각 수 있습니다. 고유한 바이어스 ROI 분석, 뿐만 아니라이 이렇게 무시 많은 중요 한 신호 정보는 임의로 선택한 내 동적 캘리포니아^{2 +} 이벤트로는 FOV에 포함 된 투자 수익 분석을 위해 선택 됩니다. 또한, 분석 ROIs의 Ca^{2 +} 신호 관찰의 공간적 특성에 대 한 정보를 제공 하기 위해 실패 합니다. 예, 그것은 가능 하지 않을지도 상승 캘리포니아^{2 +} 는 전파 발생 사이 구별 하 캘리포니아^{2 +} 파와는 매우 지역화 된 Ca^{2 +} 릴리스 캘리포니아^{2 +} 신호는 투자 수익의 도표가에서 이벤트.

유전자 인코딩된 Ca^{2 +} 지표 (GECIs)의 출현은 근본적으로 어떻게 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행 현장에^{29,30,,3132,33 수 변경} . 염료에 GECIs를 사용 하 여 여러 가지 이점이 있다. 가장 중요 한는 아마 GECI의 표현 하지 관심의 세포에서 원치 않는 배경 오염 감소 셀 특정 방식으로 수행할 수 있습니다 이다. 전통적인 캘리포니아^{2 +} 지표 GECIs의 또 다른 장점은입니다 그 photobleaching 감소 (형광 및 consequentially photobleaching만 발생 때 세포는 활성), 특히 높은에서 염료 로드 표본에 비해 이미지의 확대 및 높은³⁴캡처. 따라서, 브리핑, 지역화 된 하위 세포질 캘리포니아^{2 +} 제자리에서 신호 GCaMP 시리즈 optogenetic 센서, 월급 조사 기록 하는 기능 같은 GECIs와 이미징 및 조사 캘리포니아^{2 +} 셀 내에서 신호 들 이전 가능한 되지 않은 환경에 대 한 네이티브입니다. 이러한 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca^{2 +} 신호는 필요 합니다. 그것은 그 GECIs 일부 취소 이점을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 최근 연구 계시 했다 캘리포니아^{2 +} 이미징 성공적으로 동시에 사용 하 여 기존의 신경의 다른 neurochemical 클래스의 큰 인구에서 수행할 수 있습니다 주목 해야한다 캘리포니아^{2 +} 지표 유전자 동물³⁵로 인코딩된 하지. 이 이렇게는 동기화 된 버스트, 높은 주파수에서 발생 하는 신경의 여러 다른 클래스 공개 포스트 hoc immunohistochemistry를 사용 하 고 동물에 유전 수정 수 있다 방해 하는 생리 적 잠재력을 피했습니다 행동 조사^35,36을 이해 하고자 한다.

더 완전 한 분석을 촉진 하는이 문서에서 설명 하는 프로토콜 및 캘리포니아^{2 +} 의 정량화 신호 세포 spatiotemporal 지도 (STM)의 조합을 사용 하 여 현장에서 기록-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아^{2 +} 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca^{2 +} 중간 셀 Cajal (ICC)의 작은 창 자에서 셀의 특수 인구에 신호. ICC는 전시 동적 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호, GCaMPs^{38,,3739,40, 표현 하는 마우스를 사용 하 여 시각화 하는 위장 (GI) 지역에 전문된 셀 41,42}. 캘리포니아^{2 +} 과도 ICC에 캘리포니아^{2 +}의 활성화로 연결-활성화 Cl^- 장 평활 근 세포 (SMCs)^{43의 흥분을 조절에 중요 한 채널 ( Ano1인코딩) 44,45}. 따라서, 캘리포니아^{2 +} ICC에 시그널링의 연구 창 자 운동 성 이해에 기본적 이다. 해부학 분리 되 고 독립적으로 구상 될 수 있다 ICC의 두 클래스는 murine 소장이이 데모에 대 한 훌륭한 예를 제공 합니다: 난) ICC 원형 및 경도 평활 근 사이의 영역에 있는 레이어, myenteric 총을 둘러싼 (ICC 내). 이러한 셀 맥 박 조정기 세포 역할 및 느린 파도^46,47,,4849;로 알려진 전기 활동 생성 ii) ICC 모터 신경 (깊은 근육 신경 총, 따라서 ICC DMP)의 터미널에 풍부한 총 들도 있습니다. 이 세포는 장 모터 neurotransmission^37,39,,4050응답의 중재자 역할을 합니다. ICC-내 ICC DMP 형태학 상으로 다른, 그리고 그들의 캘리포니아^{2 +} 신호 동작 차이가 근본적으로 그들의 특정 작업을 수행. ICC-내 방사상 모양에서 그리고 간격 접속점^51,52를 통해 상호 연결 된 세포의 네트워크를 형성. 캘리포니아^{2 +} ICC 내 매니페스트에 짧고 공간 지역화 된 Ca^{2 +} 출시 이벤트로 FOV (60 X 목적으로 몇 군데)³⁸내 시각으로 ICC 내 네트워크를 통해 비동기적으로 여러 사이트에서 발생 하는 신호. 이러한 비동기 신호는 일시적으로 구성 되며 1 초는 클러스터 때 함께 표로, 금액 순 1 s 세포 증가 캘리포니아^{2 +}. 이러한 신호 ICC 네트워크 내에서 셀을 셀을 전파 하 고 따라서 구성 Ca^{2 +} 신호, 조직 넓은 캘리포니아^{2 +} 파로 하위 휴대 전화 사이트에서 생성 된. 일시적인 클러스터링 및 캘리포니아^{2 +} 의 변론에 신호를 ICC 내 불렸다 Ca^{2 +} 과도 클러스터 (CTCs)³⁸. CTCs 발생 리듬 (예: 매우 비슷한 기간과 유사한 기간 CTCs 사이) 마우스에서 분당 30 회. 반대로, ICC DMP 스핀 들 모양의 세포, 보조 프로세스, SMCs와 정 신경 프로세스 간의 배포 하 고 독립적으로 하지 않는 일부 네트워크^51,52형성. 그러나 ICC-DMP와 SMCs, 간격 접속점 형성, 그리고 SIP syncytium⁵³로 알려진이 큰 syncytium 내에서 작동. 캘리포니아^{2 +} 신호 셀의 길이 따라 여러 사이트에서 발생 하지만 이러한 과도 개입 하거나 일시적으로 클러스터, ICC 내³⁷에서 관찰 하지. 캘리포니아^{2 +} 신호 ICC DMP에 변수 강도, 기간 및 공간 특성 확률적 방식으로 발생합니다. 캘리포니아^{2 +} ICC 내에 신호의 예제를 사용 하 여 아래 프로토콜 및 ICC-DMP, 특정 유형의 셀 현장에서 복잡 한 신호를 분석 하는 기법을 설명. 우리는 Cre Recombinase (Cre) ICC 특정 발기인 (키트)에 의해 구동의 활성화를 유도 한 후 ICC에 독점적으로 GCaMP6f을 표현 하는 유도할 수 있는 Cre Lox p 시스템 활용.

프로토콜

사용 하는 모든 동물 및 본이 연구에서 실시 하는 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국가 기관에 따라 했다. 모든 절차는 기관 동물 사용 관리 네바다, Reno의 대학에 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. KitGCaMP6f 마우스의 세대

1. Ai95 크로스 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f 마우스)와 c-키트^{+ Cre ERT2} ICC 특정 GCaMP6f 표현 동물 (마우스 키트-Cre-GCaMP6f)을 생성 하 (키트-Cre 쥐).
   참고: GCaMP6f 지역화 보고에 보고 된 효율성 때문에 사용 되었다, 간단한 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 현장에서 그리고 vivo에서⁵⁴.
2. 6-8 주 유도 Cre Recombinase 활성화 및 ICC (그림 1)에 후속 GCaMP6f 식의 나가에 tamoxifen과 키트-Cre-GCaMP6f 쥐를 주사.
   1. Tamoxifen 솔루션을 만들려면 분해 Tamoxifen의 80 mg ( 재료의 표참조) 에탄올의 800 μ에 ( 재료의 표참조) 베트에 20 분 동안 소용돌이.
   2. 잇 꽃 기름 20 mg/mL의 솔루션을 만들고 다음 주입 전에 30 분 동안 sonicate (일반)의 3.2 mL를 추가 합니다.
   3. 주사 쥐 (복 주입; IP) 3 일에 대 한 tamoxifen 솔루션 (2 mg tamoxifen)의 0.1 mL와 함께. GCaMP6f 식 유전형에 의해 확인 하 고 마우스를 사용 하 여 첫 번째 주사 후 10 일.
      1. 작은 조각의 각 동물에서 귀를 클리핑 하 여 유전자 형 마우스. 다음, 귀 클립 NaOH의 75 mL에 60 분 동안 95 ° C에서 배양 하 고 다음 Tris 버퍼의 75 mL로 중화 하 여 게놈 DNA 격리에 대 한⁵⁵ 인가요 메서드 사용 합니다. 표준 PCR를 사용 하 여 각 동물, GCaMP6f 특정 뇌관⁵⁶와 20 mL 반응에서 DNA의 2 mL의 유전자 형을 결정. 야생 타입을 결정 하는 2 %agarose 젤에 PCR 제품의 10 mL를 실행 (297 bp) 및 돌연변이 (~ 450 bp) 밴드.

2. Ca^{2 +} 이미징에 대 한 조직의 준비

1. Isoflurane와 흡입에 의해 마우스 anaesthetize (4%, 재료의 표참조) 통풍된 후드와 자 궁 경부 전위에 의해 다음 희생.
2. 날카로운가 위 열기를 사용 하 여 마우스의 복 소장을 제거 하 고 Krebs 벨소리 중 탄산염 솔루션 (기계)에. Mesenteric 국경에 따라서 작은 창 열고 기계와 intraluminal 내용이 씻어. 날카로운 해를 사용 하 여 점 막과 점 막 하위 레이어를 제거 합니다.
   참고: 기계 솔루션에는 다음과 같은 구성 (mM): 118.5 NaCl, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23.8, KH₂포₄ 1.2, 우선 당 11.0. 이 솔루션에서 37 ° C 95% O₂-5% CO₂평형 버블링 때 pH 7.4의 있다.
3. 작은 핀을 사용 하 여, 핀 위로 향하도록 원형 평활 근 층을 가진 60 m m 직경 Sylgard 코팅 접시 5 mL 볼륨의 기지에 작은 창 자 조직. 재래식 기간 실험 하기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 예 열 기계 솔루션 준비 perfuse
4. 현장에서 캘리포니아^{2 +} 의 이미징 수행이 평형 기간 뒤 장 ICC 내 및 ICC-DMP confocal 현미경 검사 법 (이 프로토콜에서 이미지 회전 디스크를 장착 하는 confocal 현미경과 인수 했다)를 사용 하 여. 위에서 설명한 GECIs의 혜택 때문에 고해상도 시간 경과 이미지 사용 (> FPS, 초당 30 프레임) 영화 ICC에 동적 캘리포니아^{2 +} 신호를 취득 하 고 전력 목표 (60-100 x)와 함께.
   참고: 조직 움직임을 줄이기 위해, nicardipine 적용 (0.1-1 μ M) 앞에서 설명한^{37,,3839,,4041}녹음 하는 동안.
5. 구별 ICC 내 및 ICC-DMP 그들의 다른 해 부 위치, 형태 및 기저 Ca^{2 +} 활동 패턴을 사용 하 여 작은 창 자에서.
   1. 찾습니다 작은 창 자의 원형 및 경도 평활 근 층 사이 myenteric 총의 수준에서 ICC 내. 그들은 방사상 모양, 형성 하는 연결 된 네트워크 (그림 3A)입니다. CTCs (위에서 설명한) 분 당 ~ 30 사이클의 정기적으로 발생 된 ICC 나의 네트워크를 통해 전파 합니다.
   2. 반대로, 원형 평활 근 층 및 submucosal 총 사이 깊은 근육 신경 총의 수준에서 단일 면에 ICC-DMP를 찾습니다. ICC-DMP는 네트워크를 형성 하지 않습니다 그리고 일반 전파 이벤트를 전시 하 고 대신 확률론, 지역화 된 세포내 캘리포니아^{2 +} 과도 발사 하는 스핀 들 모양의 셀 (그림 2A).
6. 수집 소프트웨어 활용에 TIFF 이미지의 스택으로 영화를 저장 합니다.

3. ICC-DMP Spatio 시간적 매핑 (STM)을 사용 하 여에서 확률적 캘리포니아^{2 +} 신호 분석

1. ICC-DMP ImageJ 소프트웨어 (NIH, 미국, 무료 http://imagej.nih.jov/ij에서 다운로드) 및 사용자 정의 만든된 소프트웨어 (Volumetry, 버전 G8d, GWH, 맥 OS에서 작동 문의 그랜트 Hennig grant.hennig@의 조합으로 spatio 시간적 매핑을 사용 하 여 분석 med.uvm.edu에 대해 Volumetry 액세스 및 사용 문의)
   참고: ImageJ 혼자 spatio 시간적이 지도 완전히 분석 하는 양자 택일 접근 나중 섹션 (단계 3.9에서 시작)에 제공 됩니다.
2. Volumetry를 열고 오른쪽 마우스 클릭을 사용 하 여 영화 파일이 들어 있는 폴더를 엽니다. 영화 파일 (압축 되지 않은 TIFF 형식 이어야) Volumetry에서 열 분석을 클릭 왼쪽. 일단, 영화 창 내에서 파란색 경계 (영화 창) 오른쪽 화면의 큰 부분을 포함 것 포함 될 것입니다. 스크린의 왼쪽 (상단 4/5ths) 플롯 창 및 추적 창 (더 낮은 1/5^일) 포함 됩니다.
3. Shift 키를 누른 동시에 마우스 가운데 버튼 (휠, 크기 감소)와 스크롤 또는 스크롤 휠 (크기를 증가)와 동영상의 크기를 조정 합니다. 시작 또는 'A';를 눌러 재생을 중지 누르면 위쪽 및 아래쪽 화살표 키 재생의 속도 조정할 수 있습니다.
4. Volumetry를 사용 하 여 STM을 만들려면 클릭 하 고 마우스 왼쪽된 버튼 드래그 하는 동안 SHIFT를 눌러 전체 셀을 통해 ROI을 그립니다. 와 함께 투자 수익의 코너에서 휠 스크롤 하 여 투자 수익의 방향을 조정 합니다. 때 투자 수익 분석 셀 위에 자리에는 (그림 2A), 사용 액세스 하려면 동영상 창에서 클릭 하 고 마우스 오른쪽 ' ROI STMs-STMyAvg > xRow' 그림 창에서 세포 활동의 STM을 만들려고 왼쪽 클릭 (선택 하는 옵션이 있다 ' STMxAvg > yRo w ', 셀의 방향을 더 x와 부합 여부에 따라 달라 집니다 어떤 하나를 선택 하거나 셀 강조 그림 2A 예 y 축, y 축에 더 지향 은').
5. 왼쪽 그림 창에서 STM을 'P'를 눌러 평균 배경 잡음을 빼기 고 'H'는 STM의 명암을 증가를 누르십시오. 마우스 오른쪽을 클릭 하 고 액세스 하는 ' STM 부하 저장-저장 STM.tif로 ' 그것에 왼쪽 TIFF로 저장 하 여는 STM를 저장 합니다.
6. ICC-DMP의 분석의 나머지 ImageJ에서 수행 될 것 이다. ImageJ는 두 가지 주요 구성 요소, 모니터 및 모바일 사용자 인터페이스 상단 고정 위치 도구 모음으로 구성 됩니다. ImageJ를 사용 하 여 ICC DMP 캘리포니아^{2 +} 활동 (이미지 J 도구 모음에서 파일 오픈)의 STM TIFF 파일을 엽니다.
7. 열기는 Volumetry 시간을 수직으로 지향 STM 만들었습니다. ImageJ는 RGB 또는 16 비트 이미지를 TIFF 파일 자동으로 열립니다. 이미지 품질 향상, ImageJ 도구 모음에서 '이미지'를 클릭 왼쪽. 첫 번째 옵션에 스크롤 ' '다양 한 이미지 포맷의 메뉴 드롭 다운을, 위로 스크롤 ' 32 비트', 입력 하 고 변경을 클릭 왼쪽.
8. STM를 오른쪽에서 왼쪽으로 읽을 수 있도록, 다음 경로에 ImageJ 도구 모음에서 클릭 왼쪽: ' 이미지 변환 회전 90도 왼쪽 '. 그것은 또한 원래의 장소에 캘리포니아^{2 +} Volumetry와이 없이 혼자 ImageJ로 linescans를 사용 하 여 활동은 아래 상세의 STMs 만들 수 있습니다.
   참고: 된 STMs 만들어지면 그들은 관계 없이 소프트웨어 그들을 생성 하는 사용 되었다 같은 방식으로 분석 된다. 이 대체 만드는 방법에 대해 STMs에 ImageJ를 건너뛰려면 3.19 단계로 건너뜁니다.
9. ImageJ로 STMs를 만들려면, ICC DMP 캘리포니아^{2 +} 활동 (ImageJ 도구 모음에서 파일-열기) 기록 구성 하는 TIFF 파일의 스택을 엽니다. ImageJ는 RGB 또는 16 비트 이미지를 TIFF 파일 자동으로 열립니다. 이미지 품질 향상, ImageJ 도구 모음에서 '이미지'를 클릭 왼쪽. 첫 번째 옵션에 스크롤 ' '다양 한 이미지 포맷의 메뉴 드롭 다운을, 위로 스크롤 ' 32 비트', 입력 하 고 변경을 클릭 왼쪽.
10. 배경 잡음 (자동 형광 또는 카메라 소음에서 발생) 이제 영화에서 공제 한다. ImageJ 인터페이스에 ' 사각형 선택 ' 기능을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭 하 고 영화의 배경 형광에 (왼쪽 클릭 하 여 원하는 크기와 모양으로) ROI를 그립니다.
11. 투자 수익을 선택한 후 ImageJ 도구 모음에서 '분석'에 클릭 왼쪽 하 고 나타나는 드롭다운 메뉴에서 '히스토그램' 클릭 왼쪽. 팝업 상자 계산; 픽셀 범위 값에 대 한 미심쩍은 나타납니다. ImageJ는 'OK' ROI 미리 그래서 왼쪽된 클릭의 가치 있다.
12. '확인'을 클릭 하면, 새로운 팝업 상자는 히스토그램을 포함 하는 투자 수익 내 배경의 픽셀 소음에 대 한 값의 분포를 보여 주는 표시 됩니다. 평균 값은 막대 그래프 아래에 나열 된의 한 다음 팝업 상자를 닫습니다.
13. 32-비트 영화를 다시 클릭 하 고 전체 FOV 왼쪽 클릭 하 여 선택 ImageJ 도구 모음, 스크롤을 '선택', 그리고 ' 모두 선택 ' 클릭 왼쪽에 있는 ' 수정' 밝혀 드롭 다운 메뉴에서.
14. ImageJ 도구 모음에서 '과정'을 클릭 왼쪽 '수학'으로 스크롤한 왼쪽 밝혀 드롭다운 메뉴에서 '빼기'를 클릭 합니다.
15. 팝업 상자가 FOV에서 뺄 값을 삽입할 수 있습니다 표시 됩니다. 3.12 위의 단계에서 히스토그램에서 획득 한 평균 값을 입력 하 고 '확인'을 클릭 합니다. ImageJ TIFF 스택의 모든 프레임을 처리 하는 데 다음 묻습니다 (그리고 아니라 단일 프레임 영화 현재에). '예'를 클릭 합니다.
16. '예'를 클릭 하면, 영화는 검은 돌 것 이다. 이 해결 하기 위해 왼쪽 클릭 '이미지'에 ImageJ 도구 모음과 스크롤 '조정'을 통해. 왼쪽 ' 밝기/대비 ' (B & C)에 대 한 밝혀 첫 번째 옵션을 클릭 합니다. 이 상자를 밝기 및 대비의 다양 한 측면을 수정할 수 있는 팝업을 키울 것 이다. 한 번 영화에서 증가 품질을 '자동' 옵션을 클릭 왼쪽. 열어두고이 B & C 팝업 상자를 차후 사용을 위해.
17. 한 라인을 만들려면, 먼저 마우스 오른쪽 클릭 다른 라인;에 대 한 옵션을 ImageJ 인터페이스에서 라인 선택 도구 왼쪽 선에' 세그먼트' 목록에서 선택을 클릭 합니다. ' 세그먼트 라인 ' 도구가 선택 된 사용 단일 개별 ICC DMP의 중앙 축 선을 그리려면 클릭 왼쪽. 각 단일 왼쪽된 클릭 그 특정 시점에서 라인을 고정 시킬 것 이다 고 선 다음 이동 될 수 있다 자유롭게 원하는 각도에서 더. 라인 완료 되 면 두 자리에 라인을 해결 하기 위해 클릭 왼쪽.
18. '스택'에 ImageJ 도구 모음 및 스크롤에 '이미지'를 클릭 왼쪽 하 고 왼쪽 '업그레이드용' 옵션을 클릭. 팝업 상자가 나타납니다. 왼쪽 '회전 90도 ' 옵션을 클릭, 보정 하 고 공간을 y 축에는 x 축에 시간에 대 한 읽을 수 있도록이 오른쪽에서 왼쪽 라인을 찾으시는 것입니다. 만들는 STM을 ' 확인'을 클릭 합니다.
19. STM의 강도 강도 높은 캘리포니아^{2 +} 신호 그들의 강도 따라 흰색 또는 밝은 회색에서 흰색의 다양 한도로 표시는 스케일에 만들어질 것입니다. 일반적으로, 만든된 라인의 대비는 개선 필요 합니다. B & C 팝에 ' 자동' 상자를 클릭 하 여 이렇게 합니다.
20. 라인의 형광의 강도 임의의 픽셀 값에 STM에 제공 됩니다. Ca의 진폭을 정확 하 게 측정 하기 위하여^{2 +} 신호 STM, 형광 값의 STM (F) 지금에서 정규화 될 필요가 있다. ImageJ 인터페이스에 ' 사각형 선택 ' 기능을 사용 하 여, 가장 균일 하 고 가장 강렬한 형광 (F₀)의 영역을 표시 하는 STM의 영역에 ROI를 그립니다.
21. 선택한 투자 수익 내 강도의 평균 값 (F₀) 3.11-3.12에서 찍은 단계를 반복 하 고 왼쪽 클릭 하 여 ' 편집-선택-선택 모든 ' ImageJ 도구 모음에서 전체 STM을 선택 합니다.
22. ImageJ 도구 모음 및 스크롤 '수학'; '프로세스'를 클릭 왼쪽 왼쪽 클릭 '분할' 밝혀 옵션에서. 다음 팝업 상자에서 단계 3.21에서에서 얻은 평균 값 (F₀)을 입력 합니다. (F₀)에 나누어 전체 STM에는 STM 검은; 바뀝니다. B & C 팝업 상자에 '자동'을 클릭 하 여이 수정 합니다. 라인 지금 F/F₀으로 표현 하는 형광의 강도 가진 진폭에 대 한 보정 됩니다.
23. x 축에 TIFF 스택 프레임 수와 y 축에 셀의 길이 나타내는 픽셀의 수에 현재는 STM 표시 됩니다. 캘리포니아^{2 +} 신호에서 시간적, 공간적 정보를 계량 하기 위해 시간과 공간에 대 한 STM 보정. ImageJ 도구 모음에서 '이미지'를 클릭 왼쪽 하 고 '속성'을 클릭 왼쪽. 팝업 상자가 나타납니다. 이 창에서 완벽 하 게 보정 된 STM을 적절 한 값을 입력 합니다.
24. ' 픽셀 폭 '에 대 한 초에 단일 프레임을 캡처하는 데 걸리는 시간 길이 입력 합니다. 예를 들어, 5 fps 50 FPS 입력 값이 0.02, 33 FPS 0.033 등의 값을 입력에 대 한 0.2, 값을 입력 합니다. ' 픽셀 높이 ' (사용 목적과 취득에 사용 하는 카메라에 따라 것입니다) 각 픽셀 나타냅니다 몇 미크론을 입력 합니다. ' 복 깊이 ' '확인'을 클릭 하기 전에 1에 남아 있습니다. 다른 매개 변수는 창 내에서 조정 될 필요가 있다.
    참고: '확인'을 클릭 하면,는 STM은 진폭, 공간 및 시간에 대 한 완벽 하 게 측정 될 것 이다. F/F_0, 시간을 x 축에 초에 표현 될 것 이다 하 고 y 축에 공간 μ m (그림 2B)에 표현 될 것 이다 진폭은 STM에 표현 될 것 이다. 캘리포니아^{2 +} 이벤트는 STM에 이제 준비가 측정, 보정된 STM 또한 나중에 분석 하는 단일 TIFF 이미지로 저장할 수 있습니다.
25. ImageJ는 컬러 코드는 STM 하는 데 사용할 수 있습니다 색상 코딩 룩 업 테이블 (Lut)에 내장 된의 수가 있다. LUT에 내장 왼쪽 경로 ' 이미지 조회 테이블 '에 ImageJ 도구 모음에서 클릭 하 여 적용 하 고 적용 하는 LUT를 선택. 사용자 정의 만든 Lut 왼쪽 경로 ' 파일-가져오기-LUT'에 ImageJ 도구 모음에서 클릭 하 여 가져올 LUT는 STM에 가져올 수 있습니다. 예를 들어 그림 2C 에 표시 된 STM 강렬한 캘리포니아^{2 +} 형광 및 낮은 Ca^{2 +의 영역으로 차가운 색상 (블랙, 블루)의 영역으로 사용자 지정 LUT 'QUBPallete' (퀸 즈 대학교 벨파스트, 영국), 코드 따뜻한 색상 (레드, 오렌지)을 적용 했다} 형광.
26. ImageJ 도구 모음에서 '분석'을 클릭 왼쪽을 다양 한 색상으로 표현 하는 진폭의 범위를 나타내는 진폭 보정 막대를 삽입 하려면 '도구', 스크롤한 밝혀 메뉴에서 ' 교정 바 '를 선택 합니다. 옵션은 주어진 크기, 확대/축소, 범위 및 교정 바;에 대 한 STM에 위치 이러한 설정을 원하는 대로 조정 하 고 '확인'을 클릭 합니다. 교정 바 넣으면 ImageJ 만듭니다 교정 바 없이 원래 버전 그대로 별도 떠나, 포함 된 새로운 STM note.
    참고: '오버레이' 상자 보정 막대를 삽입할 때 받게 됩니다, 새로운 STM 생성 되지 것입니다.
27. 개별 Ca^{2 +} 이벤트를 분석 하려면 왼쪽 ImageJ 인터페이스에서 ' 직선 ' 선택기를 클릭 합니다. 처음 왼쪽을 클릭 하 여는 STM에, 똑 바른 가로 선을 그립니다 Ca^{2 +} 이벤트의 센터를 통해 (시간)에 대 한 x 축에 평행 하 게. 왼쪽 두 번째 시간 (그림 2D)를 클릭 하 여 라인을 완료 합니다.
28. ImageJ 도구 모음에서 '분석'을 클릭 하 고 왼쪽 ' 플롯 프로필 '을 클릭. 새로운 상자는 캘리포니아^{2 +} 이벤트 (그림 2E)의 작 프로 파일 표시 됩니다.
    참고: 이 상자 안에 '목록' 옵션 원할 경우 추적을 만들 수 있는 스프레드시트 프로그램에 복사 될 수 있습니다 생성 된 플롯의 XY 값의 목록이 생성 됩니다.
29. 캘리포니아^{2 +} 이벤트 플롯 프로필에 표시의 진폭을 측정, 왼쪽 클릭 ImageJ 인터페이스에서 ' 직선 ' 선택. 그런 다음 Ca^{2 +} 이벤트;의 피크를 플롯 프로필의 기준선에서 수직선을 인출 (ImageJ 인터페이스에 표시) 선의 길이 δ/F₀ (그림 2E)으로 표시 하는 이벤트의 진폭을 나타냅니다.
30. 인수 진폭 값을 사용 하 여 Ca^{2 +} 이벤트의 기간 측정 될 수 있다 50% 최대 진폭 (전체 기간 절반 최대 진폭, FDHM)에서 이벤트의 너비에 걸쳐 직선을 그려서 또는 이벤트의 전체 지속 시간 (그림 2E) 원하는 경우 측정 될 수 있습니다.
    참고: 경험 디자인 임계 처리 유효한 Ca^{2 +} 이벤트가이 음반에 대 한 특정 기준 해야 합니다. 우리의 실험에 캘리포니아^{2 +} 이벤트 경우 그 진폭은 분석을 위해 유효한 것으로 지정 되었다 > 녹음의 제어 섹션에서 최대 진폭 이벤트의 15%. 그러나, 이러한 임계값 특정 조직에 따라 달라 집니다 그리고 아래 셀 연구 조직 및 세포의 모든 유형에 대 한 특정 최적화를 필요로 하는 임의의 지침.
31. 업 스트로크 또는 캘리포니아^{2 +} 이벤트 작 프로 파일의 종류에 따라 선을 그려, 상승 또는을의 속도 따라 계산할 수 있습니다. 라인을 그린 후 마우스 커서 선 시작 되 고 끝나는 지점으로 이동할 수 있습니다. 위에 있을 때 커서 고정이 포인트, x,이 위치에 대 한 y 좌표 ImageJ 인터페이스의 왼쪽 아래에 표시 됩니다. 따라서, 획득 하 여 x, y 값이 줄의 시작 위치에 대 한 (x₁, y₁) 종료 (x₂, y₂), 상승 또는을 (δ/s)의 속도 경사 라인, y₂ -y₁ /₂ -₁ (그림 2Fx x로 계산할 수 있다 ).
32. 전파 또는 캘리포니아^{2 +} 이벤트의 공간적 확산을 계산 하려면 ImageJ 인터페이스에서 ' 직선 ' 선택기에 클릭 왼쪽. 다음, y 축 따라 Ca^{2 +} 이벤트의 길이 따라 직선 세로 선을 그립니다. (ImageJ 인터페이스에 표시) 선의 길이 μ (그림 2G)으로 표시 하는 이벤트의 공간적 확산을 나타냅니다.
33. 이벤트의 전파 앞을 따라 선을 그려 하는 선의 기울기를 계산 하 여 전파 캘리포니아^{2 +} 이벤트의 속도 결정 합니다. 이 x, y 값이 줄의 시작 위치에 대 한 결정에 의해 3.32, 단계에서 설명한 비슷한 방식으로 수동으로 수행할 수 있습니다 (x₁, y₁) 종료 (x₂, y₂); 마우스 커서는 STM에 위치 하는 경우 이러한 값 ImageJ 인터페이스의 왼쪽 아래에 표시 됩니다.
34. 정량화 Ca^{2 +} 이벤트에 대 한 원하는 매개 변수 수집, 수영장이 값 평균 당 셀 기준; 각 매개 변수에 대 한 평균 값을 생성 또는, 그들의 범위 (그림 2 H) 보여 배포 히스토그램에 원시 값의 모든 장소.

4. ICC 내를 사용 하 여 입자에 CTCs의 정량화 분석을 기반으로

1. PTCLs와 Volumetry에서 영화를 분석 하기 전에 영화의 공간과 일시적인 교정 파일 이름으로 삽입 해야 합니다. 대괄호에 넣어진 값 단일 대시에 제목 내에서 각 프레임 이며 또한 각 픽셀 = 미크론의 수를 구분 하는 초 수를 포함 하는 Volumetry에 분석할 모든 파일을 편집 합니다. 예를 들어 60 x 목표 (512 x 512) 33 FPS에서 획득 한 영화 [0.22-0.033] 있어야 파일 이름에 삽입.
2. Volumetry를 열고 오른쪽 마우스 클릭을 사용 하 여 영화 파일이 들어 있는 폴더를 엽니다. 영화 파일 (그림 3A, 압축 되지 않은 TIFF 형식에 있어야 합니다) Volumetry에서 그것을 여 분석을 클릭 왼쪽.
3. 전체 FOV에서 캘리포니아^{2 +} 신호를 정확 하 게 계산 하기 위해 영화에 차별화 및 배경 간섭 (카메라 노이즈, 자동 형광 등)을 제거 하 고 신호 대 잡음 비 증가를 부드럽게 먼저 받게 된다. 영화 창의 오른쪽 클릭 메뉴가 ' STK 필터-차별화 ', 오른쪽 클릭 액세스를 사용 하 여 마우스 오른쪽을 클릭 하 여 다시 구분, 값을 입력 하 고 ENTER 키를 왼쪽 클릭 적용 (영화 33 FPS에서 인수 2의 값에 대 한 (∆t = ± 66-70 밀리초) 작용, 값은 증가 이미지 캡처 증가의 비율으로).
   참고: 이런이 맥락에서 차별화의 분야의 강도 줄일 것입니다 녹음 (픽셀)을 지정 된 프레임의 수 없는 동적 활동을 보여. 따라서, 기록의 모든 프레임에 각 픽셀 분석 '2'의 값을 삽입 하는 경우 하 고는 기록에서 그 픽셀 내에서 강도 뺄 경우 그 내 전에 픽셀 형광 1 프레임에 1 프레임 후 동적 변화. 따라서, 비-동적 잡음 제거 되 고 소음에 신호 증가.
4. 가우스 필터를 적용 하 여 차별화 된 영화를 부드럽게. 영화 창에 메뉴를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 값을 삽입할 다시 클릭 마우스 오른쪽 오른쪽 클릭 액세스 ' STK 필터 가우스 KRNL'를 사용 하 여, (항상 홀수 번호를 사용 하 여, 영화 33 프레임에서 인수에 대 한 5 값 잘 작동, 1.5 x 1.5 µ m StdDev 1.0) 값을 입력 하 고 enter (그림 3B) 적용을 눌러 왼쪽.
5. 첫 번째 기간 후 CTC는 CTC 고 또한 20-40 프레임 찾습니다 무부하 기간 (20-40 프레임)를 포함 하는 영화를 선택 하 여 PTCLs를 생성 하기 시작 합니다. 이렇게 하려면 노란색 바에 오른쪽 왼쪽 스크롤에서 휠 사용 하 여 영화를 통해 스크롤하십시오.
6. 만든 선택과 사용 마우스 오른쪽 ' STK 작전-램프 DS PTCLinfo'를 액세스 하 여 적용을 클릭 왼쪽 영화 창에서 클릭 합니다. 이 함수는 점차적으로 최소 강도 최대 강도에서 임계값을 경사로 PTCL 분석 루틴을 실행 합니다. 이 표시 됩니다 그래픽으로 잡음의 플롯으로 작 창에서 및 또한 3 색된 흔적으로 추적 창에서 빨간색 추적 평균 PTCL 크기를 보여주는 PTCLs, 수를 보여주는 녹색 추적와 절대 강도 보여주는 블루 추적 임계값입니다.
   참고: 각 임계값에 PTCLs의 숫자와 평균 크기에 자동으로 계산 되 고 다음 반 수동 임계값을 강도 사용 하 여 적용 되는 PTCLs의 평균 크기 시작 감소에 빨간 추적의 굴절 지점에서 발생 하에서 추적 창 (그림 3D, 즉 공간적 제한 잡음 PTCLs PTCLs의 평균 크기의 큰 숫자로 인해).
7. 작 창 내에서 'H'를 눌러 히스토그램 균형 플롯 PTCL 잡음의 표시. 색 구성표를 눌러 순환 ' [' 배경 흰색 위에 색된 추적으로 될 때까지.
8. 컬러 플롯 오른쪽에 이동 교차로에서 플롯에 왼쪽 클릭을 측정 도구를가지고 ' F'를 누릅니다. 이 단일 세로 선 아래 추적 창의 스크롤 막대에 표시 됩니다.
9. 추적 창에서 스크롤 휠 왼쪽 오른쪽 빨간 추적의 굴절 지점에서 표시 된 흰색 세로줄 단계 4.10에서에서 만든 t에 나타납니다 'yAVG'에서 읽고 블루 추적, 그것에 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 선택 되어 있는지 확인 하 고 때까지 그는 낮은 추적 창의 왼쪽. 한 번 추적 창에 휠을 눌러 선택을 취소 합니다.
10. 영화 창에서 'C'는 색상환을 누른 다음 누릅니다 것 ' 임계값을 조정. 영화 창 (그림 3C)와 같이 포화에 빨간색 흰색으로 유효한 PTCLs에 이제 표시 됩니다. 마우스 왼쪽된 버튼으로 스크롤하여 흰색 영역을 제거 합니다.
11. 색상 바퀴에서 노란색 숫자 값 조정, 단계 4.11에서에서 촬영 하는 yAVG 값에이 값을 조정 휠와 위로 또는 아래로 스크롤하십시오. 이 모든 것으로는 활성 Ca^{2 +} 빨간색을 할당할 것 이다 과도 PTCL 결정된 임계값 지점에서. 좌표 기반된 입자 파일로이 저장, 액세스 사용 오른쪽 클릭 ' STK 3D 저장 PTCLS 0'와 다음 왼쪽을 클릭 저장 파일.
12. Volumetry를 종료 하 고 다시 엽니다. 4.13 단계에서 만든 PTCL 파일 (.gpf 파일)을 엽니다. 이 파일 형식에서 모든 활성 Ca^{2 +} 과도 유니폼 블루 PTCL (그림 3E)로 저장 됩니다. 각 PTCL은 자체 ID, 지역 및 경계 좌표, 상태 플래그 (아래 참조) 및 결과 배열 개별 엔터티, PTCLs, 또는 PTCLs 사이 spatio 시간적 특성의 분석은 간소화 됩니다.
13. PTCLs 분석을 시작 하려면 액세스 영화 창에서 오른쪽 클릭을 사용 하 여 모든 나머지 PTCL 잡음 (.gpf 파일 생성 될 때 만들어진 작은 잘못 된 PTCLs) 제거 ' PTCL STKOPS 플래그 ptcls > 분 = 70' 하 고 적용을 클릭 왼쪽. 이 이렇게 6 µ m² 보다 큰 PTCLs 플래그는 (~ 지름 > 2µm)와 Volumetry ' 플래그 1' 선택에 그들을 할당 하는 것입니다. 이 완료 되 면이 임계값 (플래그 1) 이상 PTCLs 임계값 아래 어떤 PTCLs에는 그들의 기본 파란색 (그림 3 층) 남아 있을 것 이다 반면 영화 창에서 밝은 보라색 색상으로 표시 됩니다.
14. 액세스 하려면 동영상 창에서 오른쪽 클릭을 사용 하 여 열 지도 표현 PTCL 활동 만들기 ' PTCL STKops StatMap 플래그 ='. 마우스 오른쪽 클릭 하 여이 최종 경로, 분석에 플래그 할당을 입력할 수 있습니다. 따라서, 플래그 1에 할당 된 PTCLs 척도를 희망 하는 경우 '1'을 입력 하면 enter을 왼쪽 클릭 하 여 적용. 녹음을 통해 발생 (%)를 대표 하는 다른 색상으로 기록의 전체 길이 대 한 총 PTCLs를 보여주는 열 지도 생성 됩니다 (그림 3G을 따뜻한 색상 표시 해당 위치에 증가 한 발생).
15. 마우스 오른쪽을 클릭 하 고 ' STM 부하 저장-저장 STM.tif로 '에 액세스 하는 그들에 왼쪽 TIFF로 저장 하 여 열 지도 저장 합니다.
16. PTCL 활동 액세스 영화 창에서 오른쪽 클릭을 사용 하 여 계량 ' PTCL 측정 PTCLStats STK =', 마우스 오른쪽 클릭 하 여이 최종 경로, 분석에 플래그 할당을 입력할 수 있습니다. 따라서, 플래그 1에 할당 된 PTCLs 척도를 희망 하는 경우 '1'을 입력 하면 enter을 왼쪽 클릭 하 여 적용. 추적 창에서 추적의 시리즈를 생성 됩니다.
17. Volumetry는 기본적으로 입력 해 서로 4.17 단계에서 생성 된 PTCL 흔적. 분리 적용을 눌러 왼쪽에 ' 맞춤-별도 추적 ' 액세스 하 추적 창에서 오른쪽 클릭을 사용 하 여. 이 4 개의 다른 PTCL 자취 Ca^{2 +} PTCL 활동 PTCL 영역 (녹색), 보여주는 PTCL 수 (빨강), PTCL 크기 (녹청), PTCL 크기 표준 편차 (파란색) 영화에서 플롯 시간 (그림 3 H)에 대 한 계량을 발표할 예정 이다.
18. 이러한 추적 추가 분석을 위해 스프레드시트 프로그램으로 가져올 수 있는 텍스트 파일로 저장할 수 있습니다. 추적을 저장 하 고, shift 하 고 사용을 마우스 오른쪽 ' 텍스트로 Assorted 덤프 투자 수익 '을 액세스 하 여 파일을 저장할 클릭 왼쪽 추적 창에서를 클릭 합니다. 이 정보 수집 그리고 히스토그램 또는 다른 적절 한 그래픽 표현 (그림 3 H)에.
19. PTCLs (즉, 사이트를 해 봐)의 초기 발생을 보면, 하기 위해서는 이러한 초기 PTCLs 다른 플래그 할당을 받는다. 사이트를 발사 하는 더 나은 분리를 입자 다음 70 ms에서 이전 프레임 하지만 중복에 어떤 입자와 중첩 되지 않았다 PTCLs만 네트워크 내에서 발생으로 간주 됩니다 사이트를 발사.
20. 이 임계값을 적용 하려면 사용 액세스 하려면 동영상 창에서 오른쪽 클릭 ' PTCL 행동-F1 InitSites > F = 3'와 왼쪽 적용을 클릭 합니다. 이것은 PTCLs '플래그 3', 시작 고 PTCLs이이 조건을 만족 하는 영화 (그림 4A)에서 라임 그린 색상으로 표시 됩니다.
21. Volumetry는 또한 능력을을 계량 하 고 플롯에 주어진된 FOV는 CTC 동안 발사의 그들의 확률 플롯 PTCL 발사 사이트의 수를 준다. 이러한 매개 변수를 분석 하려면 PTCLs (3 기)을 시작 하는 단계 4.16 (그림 4B)에서 설명한 대로 열 지도를 만듭니다.
22. 그림 창에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭 하 고 컬러 휠 및 보도를 눌러 'C'는 다음 ' 임계값. 시작 하는 PTCLs 것입니다 다음 차례 회색과 흰색의 열 지도. 제거 스크롤 왼쪽된 마우스 단추와 임계값 열 지도에 PTCLs만 유효한 PTCLs 회색에 적용 되는 모든 백색 (는 휠와 아래로 스크롤 하 여 임계값을 조정).
23. 사용은 마우스 오른쪽 열 지도 플롯 ' STM 찾기 PTCLs PTCLs 70'을 액세스 하 고 적용을 클릭 왼쪽 창에서 클릭 합니다. 이 70 픽셀² PTCL 또는 PTCL 발사 사이트 (그림 4C) 별도 색상 코드 개시로 할당 된 크기에서 보다 큰 지도에서 모든 회색 PTCLs를 할당 합니다.
24. 적용 지도 'STM PTCLs 만들기 PTCL rois' 액세스 및 눌러서 PTCL를 클릭 하 여 각 시간에 대 한 이러한 발사 사이트의 활동을 플롯 합니다. 이 발사 주위 ROI와 함께 표시 되는 사이트 모두 별도 컬러 PTCL 영화 창에 새로운 이미지를 생성 합니다.
25. 영화 창 액세스에 사용 하 여 오른쪽 클릭 ' PTCL 측정-PTCLpixROIBM > = 1' 및 적용을 클릭 왼쪽. 이 영화 창에서 하나 이상의 PTCL를 포함 하 고 추적 창에서 이러한 ROIs 내에서 활동의 모든 플롯 모든 ROIs를 식별 합니다. 기본적으로 이러한 추적은 서로에 겹쳐 것입니다. 그들, 별도로 사용 마우스 오른쪽 ' 맞춤-별도 추적 ' 액세스 하 여 적용을 클릭 왼쪽 추적 창에서 클릭 합니다. 추적을 저장 하 고, shift 하 고 사용을 마우스 오른쪽 ' 텍스트로 Assorted 덤프 투자 수익 '을 액세스 하 여 파일을 저장할 클릭 왼쪽 추적 창에서를 클릭 합니다.
26. 각 발사 사이트의 활동으로 발생 지도 그릴 수 있습니다. 이렇게 하려면 사용 하 여 액세스 하려면 동영상 창에서 오른쪽 클릭 ' PTCL 측정 ROI Pianola = 10' 하 고 적용을 클릭 왼쪽. 시간에 대 한 모든 발사 사이트의 작 창에 생성 됩니다. 각 발사 사이트 자체 '레인'에서 각각 별도로 색 엔터티로 표시 되 고 오른쪽 액세스 하기 위해 그들을 클릭 하 여 이러한 발생 지도 저장 Ca^{2 +} PTCLs CTCs (그림 4DE) 중 시작에 해당 하는이 플롯 ' STM 부하 저장-저장 STM.tif로 ' 고 TIFF로 저장을 클릭 왼쪽.
27. CTC 동안 각 발사 사이트에 발사의 확률, 계량에 사용 액세스 하려면 동영상 창에서 오른쪽 클릭 ' PTCL 행동-마크는 = 1' 및 적용을 클릭 왼쪽. 이 임계값 위의 PTCLs를 포함 하는 영화에서 모든 프레임 식별 하 고이 파란색 세로선으로 영화 창의 맨 아래에 표시 됩니다.
28. CTCs 각 CTC 주기 사이 ~ 1의 간격으로 FOV 내에서 여러 개의 발사 사이트에서 비동기 발사의 빠른 클러스터링으로 명단. 이 규칙과 CTCs 사이 아무 active PTCLs의 긴 간격 추가 분석에 대 한 CTC를 정의 하는 데 사용 됩니다.
29. 영화 창 액세스에 사용 하 여 오른쪽 클릭 ' PTCL 행동-블록은 갭 < =', 마지막 지점에 마우스 오른쪽 클릭을 사용 하 여 숫자를 입력 하 고. 이 명령은 활성 PTCL 프레임 블록으로 4.28 단계에서 식별 된 그룹화 하 고 활성 PTCLs를 별도 프레임 수를 기반으로하는 블록. 33 FPS의 녹음에 대 한 예를 들어 10의 값 잘 작동합니다. 경우 활성 PTCLS 떨어져 10 프레임 (330 ms) 그들은 (블록 다음 표시 됩니다 분홍색 사각형으로 영화 창의 맨 아래에 세로 블루 라인을 통해 이제는 CTC를 나타내는 각 분홍색 사각형으로) 분석에 대 한 단일 블록으로 그룹화 됩니다.
30. 사용은 마우스 오른쪽 ' PTCL 측정 PTCL 이벤트 문제 '는 영화 창에서 클릭 합니다. 이 스프레드시트 프로그램으로 가져올 수 있는 텍스트 파일을 생성 합니다. 이 텍스트 파일 CTCs에 단계 4.16-4.23 및 그들의 기여에서 정의 된 개시 사이트의 성격에 광대 한 양의 데이터를 제공할 것입니다.
    참고: 텍스트 파일은 개시 ('도메인' 이라고 함), 사이트의 수를 표시 픽셀과 μ m², 가능성 중 하나 한 번 발사 각 개시 위치의 또는 여러 번 각 CTC (%로 주어진), 동안에 사이트의 크기는 평균 기간 및 크기 그 개시 사이트에서 발생 하는 PTCLs, (단계로 정의에서 4.23) CTC 사이클의 수는 각 CTC 동안 발생 하는 발사 사이트의 비율 주기. 이 정보 수집 이며 히스토그램 또는 다른 적절 한 그래픽 표현 (그림 4 층)에서.

결과

키트-Cre-GCaMP6F 마우스 (그림 1), 동적 캘리포니아^{2 +} 위장에 ICC의 행동 현장에서 몇 군데 수 신호를 사용 하 여. Confocal 현미경 검사 법, ICC의 특정 인구의 고해상도 이미지는 같은 조직 내의 하지만 초점 (그림 2A)³⁷ 의 해부학 다른 비행기에 ICC의 다른 인구에서 신호를 오염 없이 취득 될 수 있다 ^, ...

토론

캘리포니아^{2 +} 영상 그대로 조직 또는 세포의 네트워크에서 셀의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 과도의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트와 이러한 이벤트의 활동에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. STM과 PTCL 분석 이런이 종류의 녹음에서 나왔고 양적 데이터의 양을 최대화 하는 기회를 제공 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6