その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

要約

遺伝子にエンコードされた Ca^{2 +}インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca^{2 +}イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca^{2 +}シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca^{2 +}シグナルの時空間マッピングと粒子ベースの分析を使用してその場で記録の定量化を促進します。

要約

Ca^{2 +}イメージング隔離されたセルまたはそのままティッシュ内の細胞の特定の種類の多くの場合では、Ca^{2 +}シグナルの複雑なパターンを明らかにします。この活動は、慎重かつ詳細な分析と定量化可能な基になるイベントについて多くの情報をキャプチャするために必要です。空間、時間の強度パラメーター Ca^{2 +}信号振幅、速度伝搬時間周波数などに本質的な細胞内シグナル伝達に必要ないくつかの生物学的情報があります。高解像度 Ca^{2 +}イメージング通常結果、定量データに画像情報を翻訳という点でプロセスと、このプロセスに時間がかかる大規模なデータファイルのヒューマン エラーとバイアスに敏感にすることができます。原細胞からの Ca^{2 +}シグナルの解析は通常視野 (FOV) 内の利益 (率 ROI) の任意に選ばれた地域から簡単な強度の測定に依存しています。このアプローチは、FOV に含まれている重要な信号情報の多くを無視します。したがって、Ca^{2 +}染料または光 Ca^{2 +}を用いるそのような高解像度の録音からの情報の回復を最大化するためには、イメージング、適切な Ca^{2 +}シグナルの時空解析が必要です。このペーパーで説明されているプロトコルより完全な分析の組み合わせを使用してセルから記録された Ca^{2 +}信号の定量化を容易にする Ca^{2 +}イメージング録音からの大量のデータの取得方法について説明します。時空間マップ (STM)-ベースの解析と粒子ベースの分析。プロトコルは、Ca^{2 +}異なる細胞集団の場を適切に分析できる観測信号のどのように異なるパターンもについて説明します。たとえば、メソッドを検討する Ca^{2 +}シグナル、小腸細胞間質細胞カハール (ICC)、GECIs を使用しての特殊な人口。

概要

Ca^{2 +}は筋収縮^1,2, 代謝³、細胞増殖^3,4,などの細胞プロセスの広い範囲を制御するユビキタス細胞内メッセンジャー⁵、神経端末^6、7、伝達物質の放出の刺激および転写活性化の核要因します。⁷細胞内 Ca^{2 +}信号多くのゾル性細胞質 Ca^{2 +}、一時的な標高の形をとるこれらが自発的にしたり、セル型⁸によってアゴニスト刺激から生じる。空間、時間の強度パラメーター Ca^{2 +}信号振幅、速度、伝搬時間周波数などに本質的な細胞内シグナル伝達^5,に必要な生物学的情報を提供できます。^7,9. 細胞質 Ca^{2 +}シグナルは、Ca^{2 +}放出チャネル リアノジン受容体などを介して Ca^{2 +}小胞体 (ER) からの Ca^{2 +}放出もしくは細胞外からの流入と起因できます。(RyRs) とイノシトール 3 リン酸受容体 (IP₃Rs)¹⁰。RyRs と IP₃Rs 両方に貢献するかもしれない Ca^{2 +}信号の生成と無数の Ca^{2 +}シグナル パターンで様々 な Ca^{2 +}流入機構と組み合わせてこれらのチャネルの協調開始可能性があります。数字で形作られているし、確率の Ca^{2 +}流入チャネル、Ca^{2 +}放出チャネルの Ca^{2 +}流入と放出チャネルと Ca^{2 の分布と発現の間の近さの表現のプロフィールを開く+}再取り込みと押し出しの蛋白質。Ca^{2 +}シグナルは、フォーム、制服の長期的な続くことがあるいくつかの数秒あるいは数分、細胞内および細胞間 Ca^{2 +}波細胞内の距離を越える場合があります。 を伝播する高強度グローバル振動をかかることがあります。以上 100 μ m^{10、11,12,13,14,15,16}、または Ca 2 +^{などのより簡単な空間的にローカライズされたイベント}火花および Ca^{2 +}パフが数十ミリ秒のタイム スケールで発生し、広がる未満 5 μ m^17,18,19,20。

蛍光顕微鏡は、Ca^{2 +}シグナルの分離および培養細胞および組織内そのままを監視するため広く使用されています。伝統的に、これらの実験に関与蛍光 Ca^{2 +}インジケーター、レシオ メトリックの使用と非レシオ メトリック染料 Fura2 や Fluo3/4 Rhod2 など他の人の間で^21,22,23。これらの指標は、細胞膜の透過性と細胞に閉じ込めてなる内因性エステラーゼを介してエステル基の開裂によって設計されていた。Ca^{2 +}親和性の高い指標にバインドは、細胞や組織は、適切な波長の光によって照らされたとき蛍光性の変更を発生します。細胞透過性の Ca^{2 +}インジケーターの使用が Ca^{2 +}細胞内シグナル伝達と空間分解能および Ca^{2 +}シグナルの試金によって不可能であったこれらの信号の定量化の私達の理解を大幅に強化電気生理学などの他の手段。しかし、伝統的な Ca^{2 +}インジケーターは長時間録画期間²⁴で発生する退色など、いくつかの制限にあります。一方、新しい Ca^{2 +}インジケーターは染料 Cal520/590 大幅改良された信号ノイズ比、^{ローカル Ca 2 +}シグナル²⁵を検出する能力のようです、退色の問題残っていることがいくつかの捜査官^{の懸念26,,2728}。急激な退色も倍率、画像取り込みの速度を制限し、客観的電力の増加と画像の取得率が高い必要がありますように録音のため使用できる解像度は、励起光強度を増加します。退色が増加します。

伝統的な Ca^{2 +}インジケーター染料が悪化して Ca^{2 +}シグナルの現場を記録するときの制限、たとえばとき録音細胞内 Ca^{2 +}からの信号はそのまま組織。上記の問題のため細胞透過性 Ca^{2 +}インジケーターを使用してその場で Ca^{2 +}シグナルの可視化は低倍率に限られており、イメージ キャプチャ、記録する捜査官の能力の制約の割引と時間的または空間的に制限された細胞内 Ca^{2 +}シグナルを定量化します。したがって、キャプチャ、分析、および上記のように目的の生体反応の生成に重要にすることができます Ca^{2 +}シグナルの時空の複雑さを味わうことは困難だった。原細胞からの Ca^{2 +}シグナルの解析は、通常、利益 (率 ROI) 視野 (FOV) 内の選択された領域から簡単な強度の測定に依存します。数、サイズおよび Roi、研究者の気まぐれに依存しての位置の任意選択することができます結果をバイアスして深刻な。ROI 分析で固有バイアスだけでなく、このアプローチは多くの重要な無視信号任意選ばれた内の動的な Ca^{2 +}イベントとして、視野に含まれる情報投資収益率が分析のために選択されています。さらに、Roi の分析は、観測された Ca^{2 +}信号の空間特性に関する情報を提供するために失敗します。たとえば、可能性があります可能になる Ca^{2 +}伝ぱ挙動に起因で上昇を区別する Ca^{2 +}波と局所高 Ca^{2 +}リリース ROI 内の Ca^{2 +}シグナルの一覧表からのイベント。

遺伝子にエンコードされた Ca^{2 +}インジケーター (GECIs) の出現は Ca^{2 +}イメージングが行われたその場で^{29,30,31,32,33 をすることができますどのように根本的に変わった}.染料を GECIs を使用するいくつかの利点があります。最も重要なおそらくは GECI の式をセルの特定方法は、関心のない細胞から不要なバック グラウンド汚染を削減で実行できること。伝統的な Ca^{2 +}インジケーター上 GECIs のもう一つの利点は、退色を低減 (蛍光と退色はのみ発生するとセルがアクティブなとき)、色素ロード標本、特に高と比較して倍率およびイメージの高い率は、³⁴をキャプチャします。したがって、ローカライズされた細胞内 Ca^{2 +}信号をその場で簡単な GECIs、光センサー GCaMP シリーズ affords 捜査能力を記録するなど、イメージングと調査 Ca^{2 +}細胞内シグナル伝達の以前可能なされていないネイティブ環境。このような高解像度の記録からの情報の回復を最大限に Ca^{2 +}シグナルの時空の適切な分析が必要です。GECIs 明確な利点を提供していますが、最近の研究が明らかにしたこと同時に従来による神経細胞の神経化学的クラスの大規模な集団から Ca^{2 +}イメージングを正常に実行できることに注意してください。遺伝子組み換え動物³⁵にエンコードされていない Ca^{2 +}インジケーター。このアプローチのニューロンの発火の同期バースト高周波の複数の異なったクラスを明らかにする事後的免疫組織化学を使用し、動物に遺伝の修正は生理と干渉している可能性があります可能性を避ける行動調査官^35,36を理解するように努めます。

本稿に記載されているプロトコルの詳細な分析を容易にし、Ca^{2 +}の定量信号の時空間マップ (STM) の組み合わせを使用してその場で細胞から記録・解析と粒子ベースの分析に基づきます。プロトコルは、Ca^{2 +}異なる細胞集団の場を適切に分析できる観測信号のどのように異なるパターンもについて説明します。たとえば、メソッドを検討する Ca^{2 +}細胞、小腸における間質細胞のカハール (ICC) の専門にされた人口におけるシグナル伝達します。ICC は動的細胞内 Ca^{2 +}シグナル伝達、GCaMPs^37,38,39,40,^{を発現するマウスを使用して可視化を示す胃腸 (GI) に特殊化した細胞 41,42}。Ca^{2 +}過渡電流 ICC での Ca^{2 +}活性化にリンクされて-腸管平滑筋細胞 (SMCs)^{43の興奮性の調節に重要なチャネル ( Ano1でエンコード) Cl-を活性化 44,45}。したがって、Ca^{2 +}シグナル ICC の研究は腸の運動を理解します。ICC 解剖学的分離され独立して視覚化することができる 2 つのクラスがあるので、マウスの小腸はこのデモのための優秀な例を提供しています: 私) ICC に円形と縦の滑らかな筋肉の間の領域であります。筋間神経叢を取り巻く層 (ICC マイ)。これらの細胞のペース メーカー細胞として機能し、徐波^46,47,48,49; として知られている電気的活動を生成ii) ICC が運動ニューロン (神経叢深い筋肉、従って ICC DMP) のターミナルの豊富な神経叢の中でもあります。これらの細胞は腸運動神経伝達^37,39,40,50レスポンスの仲介者として機能します。ICC-MY および ICC DMP は形態的に異なる Ca^{2 +}シグナル伝達行動は、特定のタスクを達成するために根本的に異なります。ICC 私形状、ギャップ接合^51,52を介して相互に連結された細胞のネットワークを形成します。Ca^{2 +}簡単な空間的にローカライズされた Ca^{2 +}リリース イベントとして FOV (60 X 目的とイメージ)³⁸内可視化として ICC マイネットワークを非同期的に複数のサイトで発生している ICC 私のマニフェストで信号します。これらの非同期信号を一時的に編成されます 1 秒クラスターを一緒に集計、時量の Ca^{2 +}純 1 s 細胞上昇に。これらの信号は、ICC ネットワーク内で細胞を伝播し、したがって整理 Ca^{2 +}シグナリング、組織ワイド Ca^{2 +}ウェーブにサブ携帯サイトから生成されます。時空間クラスタ リングと Ca^{2 +}の総和に ICC マイと呼ばれている Ca^{2 +}非定常クラスター (CTCs)³⁸信号します。Ctc は発生マウスで毎分 30 回、リズミカルに (例えばかなり類似している期間と Ctc の間の同じような期間) を使用します。逆に、ICC DMP が紡錘形細胞、平滑筋細胞と静脈瘤の神経プロセスの間に配布していない独立して、セカンダリ プロセスをいくつかのネットワーク^51,52形式します。ICC DMP 平滑筋細胞がギャップ結合を形成し、SIP シンシチウム⁵³として知られている、この大きいシンシチウム内で機能します。Ca^{2 +}シグナルが細胞の長さに沿って複数のサイトで発生するが、これらの過渡電圧がない同調または一時的にクラスター化されている ICC マイ³⁷で観測されました。ICC DMP における Ca^{2 +}シグナルは、変数強度、継続時間と空間の特性と、確率的に発生します。以下、Ca^{2 +}シグナル ICC マイの例を使用してプロトコルと ICC の DMP は、その場で細胞の特定の種類の複雑な信号を分析する手法を説明します。私たちは、Cre リコンビナーゼ (Cre) ICC 特定プロモーター (キット) 主導の活性化を誘導した後、ICC の排他的 GCaMP6f を表現する誘導 Cre Lox p システムを利用しました。

プロトコル

使用されるすべての動物と本研究で実施プロトコル ケアと実験動物の使用のための健康ガイドの国立機関に従ってだった。すべてのプロシージャは、制度上の動物の使用とネバダ大学リノ校でケア委員会によって承認されました。

1 KitGCaMP6f マウスの発生

1. Ai95 クロス (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f マウス) と c キット^{+/Cre ERT2} (キット Cre マウス) ICC 特定 GCaMP6f 表現する動物 (キット Cre GCaMP6f マウス) を生成します。
   注:ローカライズされたレポートで報告された効率のため GCaMP6f を使用した簡単な細胞内 Ca^{2 +}信号をその場でそして生体内で⁵⁴。
2. Cre リコンビナーゼ活性化と ICC (図 1) に後続の GCaMP6f 式を誘導するために 6-8 週の年齢で、タモキシフェンとキット Cre GCaMP6f マウスを注入します。
   1. タモキシフェン ソリューションを作成、タモキシフェンの 80 mg を溶解 (材料の表を参照してください) エタノールの 800 μ l (材料の表を参照してください) キュベットと 20 分の渦。
   2. サフラワー油 (一般) 20 mg/mL のソリューションを作成し、注入前に 30 分間の超音波の 3.2 mL を追加します。
   3. マウス (腹腔内投与; を挿入します。IP) タモキシフェン ソリューション (タモキシフェン 2 mg) 3 日連続の 0.1 ml。ジェノタイピングによる GCaMP6f 式を確認し、マウスを使用して、最初の注射後 10 日。
      1. それぞれの動物から耳の小片をクリッピングによる遺伝子型マウス。60 分 75 mL に水酸化ナトリウムの 95 ° C で耳クリップをインキュベートして 75 mL の Tris バッファーによって中和し、ゲノム DNA の隔離のため、名手法⁵⁵を使用します。標準 PCR を使用して、それぞれの動物は、DNA GCaMP6f 特異的プライマー⁵⁶と 20 mL の反応で 2 mL の遺伝子型を決定します。野生のタイプを決定する 2% の agarose のゲルの PCR の製品の 10 mL を実行 (297 bp) 突然変異 (~ 450 bp) バンド。

2. 組織の Ca^{2 +}イメージングのための準備

1. イソフルラン吸入によるマウスを anaesthetize (4%、材料表を参照してください) 換気フードと頚部転位によって、犠牲に。
2. はさみを開くを使用してマウスの腹部は小腸を取り外し、クレブス リンゲル液重炭酸塩 (KRB) に置きます。小腸腸間膜の国境沿いを開き、KRB で腔内内容を洗い流します。鋭い解剖を使用して、粘膜と粘膜のサブ層を削除します。
   注:KRB ソリューションは、次の構成 (mM): 1,185億 NaCl、KCl 4.7、CaCl₂ 2.5、MgCl₂ 1.2、NaHCO₃ 23.8、KH₂PO₄ 1.2、ブドウ糖 11.0。このソリューションでは、95% O₂- 5% CO₂と平衡にバブル時の 37 ° C で 7.4 の pH があります。
3. 小さなピンは、ピン 5 mL ボリューム、60 mm 径 Sylgard コーティング皿上向き円形の平滑筋層のベースに小腸組織を使用してください。実験の前に 1 時間の平衡期間 37 ° C で温めた KRB ソリューションと準備を灌流します。
4. 小型の上皮内 Ca^{2 +}イメージングを実行この平衡期間に続く腸 ICC-MY および ICC DMP (このプロトコルで画像を回転ディスク装備共焦点顕微鏡で取得した) 共焦点顕微鏡を用いたします。GECIs が上記の利点のためコマ撮りの高解像度の画像を使用して (> 30 フレーム/秒、FPS) ICC で動的な Ca^{2 +}シグナルの映画を取得する高出力目的 (60-100 倍) と組み合わせます。
   注:組織の動きを減らすためには、ニカルジピンを適用 (0.1-1 μ M)、^{37,38,39,40,41}を前述の記録中。
5. 区別 ICC-MY および彼らの異なる解剖学的位置、形態および基底 Ca^{2 +}活動パターン使用して小腸で ICC DMP。
   1. 検索 ICC マイ筋間神経叢にある小腸の円形と縦の平滑筋層の間のレベル。彼らが星状形、接続されているネットワーク (図 3 a) を形成です。Ctc (上記) を毎分 〜 30 サイクルの規則的な発生と ICC 私のネットワークを介して伝達します。
   2. 逆に、円形の平滑筋層と粘膜下神経叢の間に、深い筋肉神経叢のレベルで単一の平面で ICC DMP を探します。ICC DMP はネットワークではないため、正規の配布イベントを示さない、確率、ローカライズされた細胞内 Ca^{2 +}トランジェントを代わりに火災紡錘形細胞 (図 2 a)。
6. かかわらず利用獲得ソフトウェア、TIFF 画像のスタックとして映画を保存します。

3. 時空マッピング (STM) を使用して ICC DMP 確率 Ca^{2 +}シグナルの解析

1. ImageJ ソフトウェア (NIH、アメリカ、http://imagej.nih.jov/ij でダウンロードして無料) とオーダーメイドのソフトウェア (超高速、G8d, GWH、Mac OS で動作可能な接触グラント ・ ヘニング grant.hennig@ バージョンの組み合わせで時空マッピングを使用して ICC DMP を分析します。med.uvm.edu について超高速アクセスおよび使用のお問い合わせ)
   注:後のセクション (ステップ 3.9 で始まる) で完全に単独で ImageJ のこれらの時空間的地図を分析する方法もあります。
2. 超高速を開き、マウスの右クリックを使用して、ムービー ファイルを含むフォルダーを開きます。超高速 (非圧縮 TIFF 形式である必要があります) で開いて分析するムービー ファイルを左クリックします。開いたら、画面の右側の大きな領域を含む青接されたウィンドウ (ムービー ウィンドウ) 内でムービーが含まれます。画面の左側にあるは、プロット ウィンドウ (上部 4/5 ths) とトレース ウィンドウ (下 1/5^th) に含まれます。
3. Shift キーを押しと同時に (MMB、サイズが小さくなります) マウスの中央ボタンでスクロール アップまたは (サイズが増加) MMB のスクロールでムービーの寸法を調整します。'A' を押すと、再生を停止または開始上下の矢印キーを押すことで、再生速度を調整できます。
4. STM の超高速を使用してを作成するには、をクリックし、マウスの左ボタンをドラッグしながら shift キーを押し全体のセルの上の投資収益率を描画します。投資収益率のコーナーで MMB をスクロールして、ROI の向きを調整します。投資収益率が分析されるべきセルにされている (図 2 a)、使用は右にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックすると 'ROI STMs-STMyAvg > xRow'、プロット ウィンドウで細胞活性の STM を作成するを左クリックして (を選択するオプションがまたあります' STMxAvg > yRow '、1 つが選択されている、セルの方向は x より揃えかどうかに依存またはたとえば強調表示のセル図 2 a y 軸は y 軸志向より')。
5. プロット ウィンドウに STM の左クリックし、'P' 平均バック グラウンド ノイズを減算し、STM のコントラストを上げるに ' H' を押してキーを押します。STM を保存するには、' STM 負荷保存保存 STM .tif として ' にアクセスするを右クリックし、TIFF として保存するをクリックします。
6. ICC DMP の分析の残りの部分は、ImageJ で実施されます。ImageJ は、2 つの主要なコンポーネント、モニター、携帯電話のユーザー インターフェイスの上部に固定位置を持つツールバーで構成されています。ImageJ を用いた、ICC DMP Ca^{2 +}活動 (ファイルを開くツールバーの画像 J) の STM TIFF ファイルを開きます。
7. オープン、超高速作成 STM は、垂直指向の時間があります。ImageJ は自動的にいずれかの RGB または 16 ビット イメージとして TIFF ファイルを開きます。画像の品質を向上させるため、左 'イメージ' を ImageJ ツールバーのクリックします。スクロール オプションの最初の ' 'さまざまなイメージ形式のメニューを下ってしずくを明らかに上スクロール 32年ビット' を入力し、クリックして変更します。
8. STM を左から右までの時間に対して読み取り可能にするために、次のパスに ImageJ ツールバーをクリックして左: ' 画像変換回転 90 度左 '。また、その場で Ca^{2 +}活動エネルギーを用いた超高速、これなしで単独で ImageJ は下記の STMs を作成することが可能です。
   注:一度、STMs を作成すると、彼らはそれらを生成に使用されたソフトウェアに関係なく、同じ方法で分析しました。ImageJ で STMs を作成するこの方法をスキップするには、3.19 のステップに進みます。
9. ImageJ で STMs を作成するには、ICC DMP Ca^{2 +}活動 (ImageJ ツールバーのファイルを開く) の記録を構成する TIFF ファイルのスタックを開きます。ImageJ は自動的にいずれかの RGB または 16 ビット イメージとして TIFF ファイルを開きます。画像の品質を向上させるため、左 'イメージ' を ImageJ ツールバーのクリックします。スクロール オプションの最初の ' 'さまざまなイメージ形式のメニューを下ってしずくを明らかに上スクロール 32年ビット' を入力し、クリックして変更します。
10. (自動蛍光またはカメラのノイズに起因する) バック グラウンド ノイズは、映画から今減算する必要があります。ImageJ インターフェイス内の「矩形選択」関数を左クリックしてし (左クリックすると目的のサイズおよび図形にドラッグすることによって) 映画のバック グラウンド蛍光を投資収益率を描画します。
11. 投資収益率を選択する、ImageJ ツールバーの '分析' を左クリックし、結果のドロップダウン ・ メニューから「ヒストグラム」を左クリックして。ポップアップ ボックスが計算; するピクセル範囲値について表示されます。ImageJ は、'[ok]' ROI のあらかじめ選択されているので左クリックの値を持ちます。
12. 'OK' をクリックすると、投資収益率の背景のピクセル ノイズの値の分布を示すヒストグラムを含む新しいポップアップ ボックスが表示されます。ヒストグラムの下に記載されている平均値のメモを取る、ポップアップ ボックスを閉じます。
13. 32 ビット映画に戻るをクリックし、左明らかにドロップ ダウン メニューから [ImageJ] ツールバーの '選択' までスクロールし、[すべて選択] を左クリックするには、[編集] クリックして全体を選択します。
14. ImageJ ツールバーのクリックして 'プロセス'、'数学' までスクロールし、明らかにドロップ ダウン メニューから「減算」を左クリックして。
15. FOV から減算する値を挿入できるポップアップ ボックスが表示されます。3.12 上記の手順でヒストグラムから得られる平均値を入力し、'OK' をクリックします。ImageJ がし、TIFF スタック内のすべてのフレームを処理するように (および 1 つのフレームだけではなく映画は現在で)。[はい] をクリックします。
16. [はい] をクリックすると、映画は黒になります。これを修正する左クリックして 'イメージ' ImageJ ツールバーとスクロールで「調整」にします。左は、「明るさ/コントラスト」(B と C) 明らか最初オプションをクリックします。これは、ポップアップ ボックスの明るさとコントラストのさまざまな側面を変更可能性がありますが表示されます。一度映画で増加の品質を明らかにするために 'Auto' オプションを左クリックします。この B & C ポップ ボックスを開いたまま将来の使用のため。
17. ライン スキャンを作成するには、最初 ImageJ インターフェイス異なる行のオプションを明らかにするための線選択ツールをクリックして右リストから選択する分割線を左クリックします。分割線ツールを選択、個々 の ICC-DMP の中間軸に沿って線を描画する使用シングル左クリックと。それぞれの唯一の左クリックは特定の時点でラインを修正、行し、自由に移動できる任意の角度でさらに。行が完了したとき左ダブル クリックの場所で行を修正します。
18. 'スタック' で ImageJ ツールバーとスクロール 'イメージ' を左クリックし、'スライスを切り直す' オプションを左クリックします。ポップアップ ボックスが表示されます。「90 度回転」するオプションを左クリックして、これは左から右へライン スキャン オリエンテーションが校正して時間が x 軸、y 軸上のスペースで反対を読むことできるように。STM を作成する [OK] をクリックします。
19. STM の強度は、高強度 Ca^{2 +}シグナル ホワイト、その強度によって白や明るい灰色の度合いのようにグレースケールで作成されます。通常、作成されたライン スキャンのコントラストが改善する必要があります。ボックス B & C ポップに ' Auto' をクリックしてこれを行います。
20. ライン スキャンの蛍光性の強度は、任意のピクセル値に STM に提示されます。Ca の振幅を正確に測定するために^{2 +}蛍光値の STM (F) 今 stm 探針からの信号は正規化する必要があります。ImageJ インターフェイスの「長方形選択」関数を使用して、蛍光 (F₀) の最も均一で少なくとも強烈な領域が表示されます STM の領域での投資収益率を描画します。
21. 選択した ROI 内強度の平均値 (F₀) を取得する 3.11-3.12 での撮影手順を繰り返し、ImageJ ツールバーから '編集選択選択すべて' 左クリックしてで全体の STM を選択します。
22. ImageJ ツールバーとスクロール '数学'; 'プロセス' 左クリックします。明らかにオプションから '分割' 左クリックします。その後ポップアップ ボックス ステップ 3.21 から得られた平均値 (F₀) を入力します。(F₀) で全体の STM を割るところに STM 真っ暗になります。B & C ボックスをポップアップ 'Auto' をクリックしてこれを修正します。「振幅」F₀として表現される蛍光の強度と、ライン スキャン今校正します。
23. STM は、x 軸上の TIFF スタック内のフレームの数と y 軸上のセルの長さを表すピクセル数に現在表示されます。Ca^{2 +}シグナルから時間と空間の情報を定量化するために、空間と時間の STM を調整します。ImageJ ツールバーの 'イメージ' を左クリックし、「プロパティ」を左クリックして。ポップアップ ボックスが表示されます。このウィンドウ内で完全に STM を調整する適切な値を入力します。
24. ' ピクセル幅 '、秒単位で 1 つのフレームをキャプチャするのにかかる時間の長さを入力します。例については、5 FPS で 0.2 の値を入力、50 FPS を入力します 0.02 33 FPS のための値を入力 0.033 等。'ピクセル高さ' どのように多くのミクロン各ピクセルを表す (使用目的と取得に使用するカメラによって異なります) を入力します。'ボクセル深さ' 1 'OK' をクリックする前にままです。その他のパラメーターは、ウィンドウ内で調整する必要はありません。
    注:'OK' をクリックすると後、は、STM は振幅、空間と時間の完全に調整されています。STM の振幅は、秒で表現されます F₀時間が x 軸と y 軸上の領域 (図 2 b) μ m で表現されますように表現されます。Ca^{2 +}イベント stm 測定する準備が整いました、校正 STM は、後日分析する単一の TIFF イメージとして保存することも。
25. ImageJ は、色分けされたルックアップ テーブル (Lut) STM を色分けするために使用可能性がありますに建てられた数を持っています。パス 'イメージ参照テーブル' の ImageJ ツールバー] をクリックして組み込み LUT の適用、適用する LUT を選択します。カスタムメイド Lut は、LUT をインポートするを選択し、' ファイル-インポート-LUT' パスの ImageJ ツールバーを左クリックする STM にもインポートできます。たとえば図 2に示すように STM きたカスタム LUT 'QUBPallete' (クイーンズ大学ベルファスト、イギリス) をコード暖色系 (赤・ オレンジ) に、それに適用される強烈な Ca^{2 +}蛍光や低 Ca 2 +^{の領域として冷たい色 (黒・青) の領域として}蛍光。
26. 様々 な色によって表される振幅の範囲を示すための振幅調整バーを挿入するには、ImageJ ツールバーから '分析' 左クリックして、'ツール' スクロールし、表示されたメニューから「校正バー」を選択します。オプションが指定されたサイズ、ズーム、範囲調整バーの STM の位置に必要に応じてこれらの設定を調整し、'OK' をクリックします。調整バーを挿入すると、ImageJ はそのままで、別に校正バーなしの元のバージョンを残して、それを含む新しい STM を作成することに注意してください。
    注:調整バーを挿入するときに、'オーバーレイ' ボックスがチェックされている, 新しい STM は生成されません。
27. 個々 の Ca^{2 +}イベントの分析を開始、ImageJ インターフェイスで「直線セレクターを左クリックしてします。当初、STM をクリックして左、(時間) に対して x 軸に平行 Ca^{2 +}イベントの中心を通ってまっすぐ水平線を描画しています。2 回目 (図 2 D) を左クリックして、ラインを完了します。
28. ImageJ ツールバー '分析' をクリックし、プロファイルのプロット」を左クリックします。新しいボックスは、Ca^{2 +}イベント (図 2 e) のプロットのプロファイルが表示されます。
    注:このボックス内で 'リスト' オプションので必要な場合は、トレースを作成するスプレッドシート プログラムにコピーすることができます生成されたプロットの XY 値のリストが生成されます。
29. プロットのプロファイルで表される Ca^{2 +}イベントの振幅を測定するには、ImageJ インターフェイスで「直線セレクターを左クリックしてします。その後、Ca^{2 +}イベントのピークにプロット プロファイルのベースラインから垂直線を描画します。(ImageJ インターフェイスに表示) の行の長さは、ΔF/F₀ (図 2 e) として表現されるイベントの振幅を表します。
30. 取得した振幅値を使用すると、Ca^{2 +}のイベントの期間が 50% 最大振幅 (最大ピーク振幅の半分、FDHM で全期間) の時点でイベントの幅で直線を描画することによって測定可能またはイベントの全期間(図 2 e) 必要な場合測定されます。
    注:実験者は、これらの録音の閾値有効な Ca^{2 +}イベントの特定の基準を設計する必要があります。実験の結果, Ca^{2 +}イベント解析に対して有効である場合、振幅として定められました > 録音の制御セクションで最大振幅イベントの 15%。しかし、これらのしきい値は、特定の組織に依存、細胞研究、組織や細胞の種類ごとに特定の最適化を必要とする任意のガイドラインのみ。
31. 脱分極相または Ca^{2 +}イベント プロット プロフィールの上部の圧力に線を描画することによって上昇または下落の率はそれに応じて計算する可能性があります。線が描画された後、マウス カーソルは、行の開始し、終了ポイントに移動できます。カーソルがこれらの点に静止しているときこの場所の xy 座標が ImageJ インタ フェースの左下に表示されます。したがって、取得することによって x, y 値、行の開始 (x₁, y₁) と終了 (x₂y₂)、斜面ライン、y₂ - y₁ /₂ -₁ (図 2 f × × として上昇または下落 (ΔF/秒) の速度を計算できます).
32. 伝搬や Ca^{2 +}のイベントの空間の広がりを計算するためには、ImageJ インターフェイスで「直線セレクターを左クリックします。その後、y 軸に沿って Ca^{2 +}イベントの長さに沿って直線の垂直線を描画します。(ImageJ インターフェイスに表示) の行の長さは、μ m (図 2) で表されるイベントの空間の広がりを表します。
33. イベントの伝搬の前面に沿って線を描画、直線の傾きを計算することによって伝播の Ca^{2 +}イベントの速度を決定します。これは、同様の x, y 値、行の開始を決定することにより 3.32、手順で説明した方法で手動で実行することがあります (x₁, y₁) と終了 (x₂y₂);これらの値は、STM にマウス カーソルがあるとき ImageJ インタ フェースの左下に表示されます。
34. Ca^{2 +}イベント定量化のため目的のパラメーターのコレクションにプールあたりのセル単位で各パラメーターの平均値を生成するこれらの値の平均また、分布ヒストグラムの範囲 (図 2 H) を表示するにすべての raw 値を配置します。

4. ICC-私を使用して粒子の Ctc の定量化に基づく解析

1. PTCLs の超高速で映画を分析する前に、映画の時空の校正ファイル名に挿入する必要があります。角かっこで値を持つ単一のダッシュでタイトル内の各フレームに等しいおよび各ピクセルに等しいミクロン数の分離も秒数を格納する超高速で分析するすべてのファイルを編集します。たとえば、60 × 対物 (512 x 512) 33 FPS でつけた映画が必要 [0.22-0.033 お] をファイル名に挿入されます。
2. 超高速を開き、マウスの右クリックを使用して、ムービー ファイルを含むフォルダーを開きます。超高速 (図 3 a、非圧縮 TIFF 形式である必要があります) で開いて分析するムービー ファイルを左クリックします。
3. 全体の視野からの Ca^{2 +}シグナルを正確に計算するために、分化とバック グラウンド干渉 (カメラのノイズ、自動蛍光等) を除去し、ノイズ比率へのシグナルを高める平滑化最初映画を行われます。ムービー ウィンドウで、右クリック メニューを表示し、区別するために値を入力して右クリック「STK フィルター-を区別する '、右クリック アクセスを使用して ENTER キー押すし、左クリックしてで適用 (映画 33 FPS で 2 の値を取得するため (∆ t は部 = ± 66 70 msec) など 値は増加イメージ キャプチャの増加の率として)。
   注:このコンテキストでは分化が部の強度を減らす指定したフレーム数を動的なアクティビティを表示記録 (ピクセル単位)。したがって、録音のすべてのフレーム内の各ピクセルを分析した値 '2' を挿入する場合、そのフレーム内の前にピクセル蛍光 1 フレームと後 1 フレームの動的変化がない場合、これらのピクセル内強度は録音から差し引かれます。したがって、非動的な背景ノイズを除去し、信号対雑音が増加します。
4. ガウス フィルターを適用することによって差別化された映画を滑らかに。メニューに [ムービー] ウィンドウで右クリックし、値を挿入するもう一度右クリック右クリック アクセス ' STK フィルター ガウス KRNL' を使用して、(奇数を常に使用、映画 33 FPS で取得のため 5 の値うまく、1.5 倍の 1.5 μ m、StdDev 1.0) 値を入力、ENTER キーを押します (図 3 b) を適用するを左クリックします。
5. 最初に、CTC の後、CTC とも 20-40 フレームの出現が続く静止期間 (20-40 フレーム) が含まれています映画の期間を選択して PTCLs を作成を開始します。これを行うには、黄色のバーを右に左にスクロールする、MMB を使用して映画をスクロールします。
6. 行われた選択、使用右 ' STK Ops-ランプ DS PTCLinfo' にアクセスして適用する左クリックして [ムービー] ウィンドウでクリックします。この関数は、最大輝度から最低の強度のしきい値を徐々 にランプ PTCL の解析ルーチンを実行します。これは表示されますグラフィカル ノイズのプロットとプロット ウィンドウで、3 つの色つきトレースとトレース ウィンドウ PTCL の平均のサイズを示す赤のトレース、PTCLs の数を示す緑のトレースと絶対強度を示す青のトレースをしきい値。
   注: 各閾値で PTCLs の数と平均サイズは自動的に計算され、半手動によるしきい値を適用する強度が使用の先頭 PTCLs の平均サイズ、ドロップするの赤のトレースの変曲点に発生します。トレース ウィンドウ (図 3 D、すなわち多数の空間的制限ノイズ PTCLs PTCLs の平均のサイズを減らすため)。
7. プロット ウィンドウ内でヒストグラム バランスに白金ノイズの示すプロット 'H' を押します。押して色スキームを通じてサイクル ' [' 背景が色つきトレース上で白く色になるまで。
8. 色のプロットが右手側にシフト測定ツールを持ち出すと、交差点をプロット上で左クリックする ' F' を押します。これは、以下のトレース ウィンドウのスクロール バーの 1 本の縦線がマークされます。
9. トレース ウィンドウ内にスクロール MMB 左右に赤のトレースの変曲点からマークの白い縦線 4.10 のステップで作成した t に表示されます 'yAVG' を読む青のトレースが、それの右クリックによって選択されているかどうかを確かめる彼は、トレース ウィンドウの左側を下げます。トレース ウィンドウ内に、MMB を一度押すことによって選択範囲を選択解除します。
10. ムービー ウィンドウ内でカラー ホイールを表示する 'C' を押して、プレスが' のしきい値を調整します。ムービー ウィンドウ (図 3)、飽和状態で赤が白になりますと、有効な PTCLs は今示されています。白の領域を削除するには、マウスの左ボタンを上方向にスクロールします。
11. カラー ホイールで黄色の数値値を調整、ステップ 4.11 から取得した yAVG 値にこの値を調整する MMB を上または下にスクロールします。これは、アクティブな Ca^{2 +}赤ですべてを割り当てる設定した閾値の時点で一時的な白金。アクセスこれに基づいて粒子の座標ファイルとして保存、する使用して右クリックすると「STK 3 D 保存 PTCLS 0' とする左クリックすると、ファイルを保存します。
12. 超高速を終了し、再開します。4.13 の手順で作成された白金ファイル (.gpf ファイル) を開きます。このファイルの種類のすべてのアクティブな Ca^{2 +}トランジェントは制服青白金 (図 3E) として保存されます。各白金は、独自の ID、エリア、境界座標、状態フラグ (下記参照)、結果の配列の個々 のエンティティは、PTCLs、または PTCLs の間の時空間的特性の解析は合理化です。
13. PTCLs 分析を開始にムービー] ウィンドウで右クリックを使用してアクセスする、任意の残りの PTCL ノイズ (小さい無効な PTCLs .gpf ファイルの生成時に作成) を削除 ' 白金 STKOPS フラグ ptcls > 分 = 70' とクリックして適用します。このアクションは 6 μ m²を超える PTCLs にフラグを設定 (~ 直径 > 2 μ m) と超高速 ' フラグ 1' 選択に割り当てられます。これが完了したら、このしきい値 (フラグ 1) の上にある PTCLs は、しきい値以下の任意の PTCLs ままになります彼らの基本青色 (図 3 f) に対しムービー] ウィンドウで紫光の色として表示されます。
14. ムービー] ウィンドウで右クリックを使用してアクセスする、白金活動の熱マップの表現を作成 ' 白金 STKops StatMap フラグ ='。この最後のパスを右クリックして、分析するフラグ割り当てを入力できます。したがって、単に '1' を入力フラグ 1 に割り当てられている PTCLs を定量化を希望する場合、ENTER キーを押します、そして適用する左クリックします。これは録音データ全体の発生 (%) を表す異なる色で記録の全体の長さの合計の PTCLs を示すヒートマップが生成されます (図 3、温かみのある色調、その場所での発生が増加を示します)。
15. ヒート マップを保存するには、' STM 負荷保存保存 STM .tif として ' にアクセスすることを右クリックし、TIFF として保存するをクリックします。
16. ムービー] ウィンドウで右クリックを使ってアクセスし白金活動を定量化 ' 白金メジャー PTCLStats STK ='、この最後のパスを右クリックする、分析するフラグ割り当てを入力ことができます。したがって、単に '1' を入力フラグ 1 に割り当てられている PTCLs を定量化を希望する場合、ENTER キーを押します、そして適用する左クリックします。これはトレース ウィンドウでのトレースのシリーズが生成されます。
17. 超高速は、デフォルトでは互いの上に 4.17 の手順で生成された白金トレースを重ね合わせます。それらを分ける「整列別トレース」にアクセス適用する左クリックしてトレース ウィンドウの右クリックを使用して。これは Ca^{2 +}白金白金エリア (緑色)、白金カウント (赤)、白金サイズ (シアン)、および白金サイズ標準偏差を (青い) 示す映画で活動時間軸に対してプロット (図 3 H) を定量化する 4 つの異なる PTCL トレースを明らかにします。
18. これらのトレースは、さらなる分析のための表計算プログラムにインポートできるテキスト ファイルとして保存できます。トレースを保存し、次に shift キーを押しを使用して右 ' テキストとしてダンプ盛り合わせ ROI' にアクセスし、ファイルを保存するを左クリックしてトレース ウィンドウでクリックするとします。この情報は収集し、ヒストグラムまたは他の適切なグラフィカルな表現 (図 3 H) に示されています。
19. PTCLs (すなわち、発射サイト見て) の初期発生を見てするためにこれらの初期の PTCLs は、異なるフラグの割り当てを与えられています。発射サイトより良い分離次 70 ms の粒子の前のフレームが重複で任意の粒子とは重複しない PTCLs のみ、ネットワーク内で発生すると見なされますサイトを発射します。
20. このしきい値を適用する使用右にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックすると ' 白金行動 F1 InitSites > F = 3' と左クリックして適用します。これは ' フラグ 3' として PTCLs を開始する割り当てられます、映画 (図 4 a) でライム グリーン色としてこの条件を満たす PTCLs が表示されます。
21. 超高速も能力を定量化し、プロットで与えられた視野だけでなく、CTC の中に発火の可能性をプロット白金発射サイトの数を与えます。これらのパラメーターを分析するには、4.16 (図 4 b) の手順で説明されているように PTCLs (フラグ 3) を開始するヒート マップを作成します。
22. プロット ウィンドウで左クリックして、'C' を押して、カラー ホイール、プレスを持ち出すのだろうし、' のしきい値。PTCLs は、ターンのグレーと白の開始のヒート マップ。削除すべてのスクロールをマウスの左ボタンとしきい値ヒート マップで PTCLs のみ有効な PTCLs は灰色で覆われているように白 (、MMB を上下にスクロールしてしきい値を調整)。
23. 使用を右 ' STM PTCLs 検索 PTCLs 70' にアクセスを適用するを左クリックしてプロット ウィンドウでヒート マップをクリックします。これは 70 ピクセル²白金または白金サイト (図 4) を発射別色分け開始として割り当てられるサイズでより大きいすべてのグレーの PTCLs マップに割り当てます。
24. 適用する白金発火マップと 'STM PTCLs 作成白金・ ロワ' にアクセスして左クリックしての右クリックによって時間に対するこれらの発射サイトのそれぞれのアクティビティをプロットします。周りに投資収益率で表示されるサイトを焼成した色別白金の [ムービー] ウィンドウで新しいイメージが生成されます。
25. 使用右にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックすると ' 白金メジャー PTCLpixROIBM > = 1' とクリックして適用します。これは、少なくとも 1 つの白金を含む、トレース ウィンドウでこれらの Roi 内の活動のすべてのプロットがムービー] ウィンドウですべての Roi を識別します。既定では、これらのトレースは互いに重ねられます。それらを分離するには、使用右「整列別トレース」にアクセス適用する左クリックしてトレース ウィンドウでクリックしてします。トレースを保存し、次に shift キーを押しを使用して右 ' テキストとしてダンプ盛り合わせ ROI' にアクセスし、ファイルを保存するを左クリックしてトレース ウィンドウでクリックするとします。
26. 各発射サイトの活動は、発生マップとしてプロットできます。これを行うには、使用右にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックすると ' 白金測定 ROI 自動ピアノ = 10' とクリックして適用します。これは、プロット ウィンドウで時間との闘いのすべての発射サイトのプロットが生成されます。独自の「レーン」でそれぞれ別々 に色エンティティとして各発射サイトが表示され、これらのプロットは、これらの発生マップにアクセスすることを右クリックして保存 Ca^{2 +} PTCLs Ctc (図 4、E) の間開始に対応 ' STM負荷保存保存 STM .tif として '、TIFF として保存するを左クリックします。
27. CTC 中各発射サイトに発砲の確率を定量化する使用右へ [ムービー] ウィンドウでクリックすると ' 行動マークは、白金 = 1' とクリックして適用します。これはしきい値を超える PTCLs を含む映画内のすべてのフレームを識別してこれらはムービー ウィンドウの底に青い縦線としてマークされます。
28. Ctc は、CTC の各サイクルの間に 1 〜 s ギャップと FOV 内複数の発射サイトから非同期発火の急速なクラスタ リングとしてマニフェストします。この規則性と Ctc 間なしのアクティブな PTCLs の長いギャップは、さらに分析のための CTC を定義する使用されます。
29. 使用右にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックすると ' 行動・ ブロックは、PTCL ギャップ < ='、最終的なポイントの右クリックを使用して、番号を入力して。このコマンドがステップ 4.28 ブロックで識別されるアクティブな白金フレームをグループ化し、ブロックは、別のアクティブな PTCLs フレームの数に基づいています。33 FPS の録画などの値が 10 のよく動作します。アクティブな PTCLS が離れてより小さい 10 のフレーム (330 ms) 彼らは、(ブロック表示されますピンク四角形としてムービー ウィンドウの下部の青い縦線上今 CTC を示す各ピンクの四角形を持つ) 分析のための単一のブロックにグループ化されます。
30. 使用を右 ' 白金白金メジャー イベント Prob' にアクセスする [ムービー] ウィンドウでクリックします。表計算プログラムにインポートできるテキスト ファイルが生成されます。このテキスト ファイルは、Ctc に階段 4.16-4.23 と彼らの貢献から定義された開始サイトの性質上データの広大な量を提供します。
    注:テキスト ファイルが表示されます ('ドメイン' と呼ばれる)、開始サイト数ピクセルと μ m²、いずれかの回の焼成開始サイトごとのまたは複数回各 CTC (% として与えられる) 中、確率でサイトのサイズ平均期間とのサイズPTCLs 開始サイト、(で定義されたステップ 4.23) として CTC サイクル数、各 CTC サイクル中に発射される発射サイトの割合で発生しています。この情報の収集し、ヒストグラムまたは他の適切なグラフィカルな表現 (図 4 階) に示されています。

結果

キット Cre GCaMP6F マウス (図 1)、動的な Ca^{2 +}シグナル胃腸に ICC の挙動その場で視覚化されるを使用しています。共焦点顕微鏡を用いた ICC の特定の人口の高精細画像は、フォーカス (図 2 a)³⁷の明確な解剖学的平面は同じ組織内で ICC の他の集団からの信号を汚染することがなく得ることができます?...

ディスカッション

Ca^{2 +}イメージング細胞そのまま組織内または細胞のネットワーク内の特定の種類の多くの場合では、Ca^{2 +}過渡現象の複雑なパターンを明らかにします。この活動は、慎重かつ詳細な分析と定量化可能な基になるイベントとこれらのイベントの速度論について多くの情報をキャプチャするために必要です。STM および白金分析この種類の録音から得られた量的データの量を最大化?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6