JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة إنتاجية عالية، المستندة إلى تصوير المقايسة الأبطال الجزئي لتحديد عيار تحييد الأجسام المضادة المحددة للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). تم اختبار هذا الشكل مقايسة على أنواع مختلفة من عينة.

Abstract

الجهاز التنفسي المخلوي الخاصة بالفيروس تحييد الأجسام المضادة (RSV رعايتها) علامة هامة للحماية ضد RSV. عدد من تنسيقات مختلفة بالانزيم قيد الاستخدام حاليا في جميع أنحاء العالم حتى لا يكون هناك حاجة لطريقة دقيقة والفائق لقياس رعايتها RSV. يصف لنا هنا مقايسة الأبطال الجزئي على أساس التصوير التي قد تم اختباره على RSV الفريق الفرعي A ويمكن تكييفها أيضا للفريق الفرعي RSV ب وأنواع مختلفة من عينة. هذا الأسلوب الغاية استنساخه، مع اختلافات المقايسة بين الوكالات ل antiserum مرجع حاليا أقل من 10 في المائة. ونحن نعتقد أن هذا التحليل يمكن أن ينشأ سهولة في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بتكلفة منخفضة نسبيا. تطوير مقايسة محسنة، والفائق الذي يقيس رعايتها RSV يمثل خطوة هامة إلى الأمام لتوحيد هذا الأسلوب دوليا، فضلا عن انتقاده لتقييم المرشحين لقاح RSV الرواية في المستقبل.

Introduction

الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) هو السبب الرئيسي لالتهابات الجهاز التنفسي السفلي في طب الأطفال من السكان في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن عبء عالية، لا تتوفر لا يزال أي لقاح أو علاج. وقد أعلنت منظمة الصحة العالمية (WHO) منذ عام 2013، تطوير اللقاحات RSV كأولوية رئيسية لبحث، مع اجتماعات التشاور منظمة الصحة العالمية السنوي2،3. ووافقت منظمة الصحة العالمية على استخدام RSV تحييد قياس الأجسام المضادة (NAb) لرصد اللقاحات الاستمناع، هذا هو المعترف بها كعلامة المصلية الرئيسية لحماية4. يعتقل أظهرت لحماية ضد العدوى RSV شديدة في عدد من الدراسات، فضلا عن التجارب السريرية من باليفيزوماب المضادة-RSV [مونوكلونل] جسم، حاليا استراتيجية وقائية فقط المتاحة4.

وهناك عدة صيغ المقايسة قبض تستخدمها المختبرات في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك فحوصات يستند إلى الخلية والجزيئية، التي جعلت جهود توحيد تحدي5،6،،من78. غير أنه ما زال المقايسة الأبطال (PRN) التقليدية للحد من اللوحة أن التدابير عدد البلاك انخفاض تشكيل وحدات (بفو) بوجود جسم RSV-خاصة بمعيار الذهب9. هنا، نحن تقرير بروتوكول PRN المحسنة والمبسطة والفائق التي يمكن استخدامها في العديد من خطوط الخلايا، لسلالات RSV مختلفة ومع المقايسة زيادة الإنتاجية. تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام عينات سريرية من إعدادات مختلفة وكذلك على عينات من تجارب حيوانية نموذجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: وقد جميع الخطوات المراد تنفيذها في غطاء BSL2 إلا إذا ذكر بشكل مختلف. مطلوب معايرة الفيروسية قبل مقايسة PRN لتحديد تركيز RSV المثلى المستخدمة في التحليل PRN. من المستحسن أن قاسمة مخزونات الفيروس في وحدة صغيرة والتي سيتم إذابة مرة واحدة وتستخدم لكل مقايسة قبض. ويوصي أيضا باستخدام نفس الرصيد الفيروسية لفحوصات قبض كل إجراء لجميع العينات المأخوذة من دراسة واحدة. تأكد من أن وسائل الإعلام الثقافة والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) هو درجة حرارة عند 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى ألواح الخلية.

1-RSV الفيروسية المعايرة

ملاحظة: اعتماداً على العدد مخزون فيروس وعدد التكرارات، يمكن إعداد لوحة المقايسة وفقا الرقم 1. وينبغي أن تيتراتيد كل مخزون الفيروس في ثلاث نسخ إلى أسفل لوحة المقايسة، بدءاً من أعلى تركيز الفيروسية (أي، 01:10). معايرات المسلسل يمكن عادة 01:10. A549 خلية ثقافة والصيانة، فضلا عن RSV الثقافة الداخلي يتم استخدام إجراءات موحدة وغير مدرجة في هذا البروتوكول.

  1. لوحات البذر (1 يوم)
    1. ريسوسبيند خلايا A549 في دولبيكو "تعديل النسور" المتوسطة (دميم) + 10% مصل العجل الجنين (FCS) + 1000 وحدة دولية البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا) في 4 × 105/mL. 96 البذور جيدا مسطحة-أسفل لوحات العقيمة مع 100 ميكروليتر/البئر الذي يحتوي على خلايا 4 × 104 A459.
    2. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (الخلايا ستكون في سجل--مرحلة النمو).
      ملاحظة: استخدام قنينة خلايا A549 جديدة بعد 23 الممرات. ينصح بعدم بدء التجارب عند قنينة خلية جديدة لا تزال في الممرات الثلاثة الأولى.
  2. الإصابة بالفيروسات (2 يوم)
    1. إعداد الفيروس تمييع المسلسل
      1. سرعة ذوبان الجليد قنينة مجمدة واحدة من RSV في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مذاب تماما تقريبا ووضع فورا على الجليد. إعداد 3 replicates لكل RSV مخزون الفيروس تكون جزيئي واستخدام فيروسات أولى إضعاف أسهم 01:10 مع 100 ميكروليتر من الفيروس المخفف/جيدا ونحتفظ بعمود واحد على الأقل للمراقبة السلبية.
        ملاحظة: ويبين الشكل 1 التحكم السلبي في تريبليكاتيس.
      2. إضافة 100 ميكروليتر من كل الفيروس المخفف الساعة 01:10 في ثلاث نسخ صف أ ش 96-جيدا-قاع لوحة العقيمة. إضافة ميكروليتر 90/بئر دميم + 1000 وحدة دولية/بكتيريا القلم دون FCS إلى صفوف ب إلى ه.
      3. أداء تسلسلي 01:10 تخفيف أسفل اللوحة بنقل 10 ميكروليتر من الصف صف الحل ب مزيج من المحتوى بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات ومواصلة تخفيف عشرة إضعاف حتى الصف H. تجاهل ميكروليتر 10 النهائي حيث يكون الحجم النهائي في كل ميكروليتر 90 جيدا إلى.
        ملاحظة: من المهم استخدام نصائح جديدة لتمييع كل.
    2. تلقيح الفيروس إلى خلايا A549
      1. استرداد cell plate(s) A549 أعدت في اليوم السابق. التأكد من وجود مونولاييرس خلايا A549 في لوحات 96-جيدا روافد ~ 80%. تجاهل وسائل الإعلام بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة.
      2. تغسل جميع الآبار مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مرتين، وتجاهل برنامج تلفزيوني الزائدة بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسل. عدم السماح بلوحات لتجف.
      3. نقل تخفيف الفيروس من لوحة المعايرة الفيروسية (الشكل 1) للآبار المقابلة على لوحة خلايا A549. احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. وبعد تفريخ ح 1، صب supernatants استخدام ماصة (لتجنب التلوث المتبادل). تأخذ بها 90 ميكروليتر/جيدا.
      4. إضافة 100 ميكروليتر من متوسطة 1 x 199 (M199، انظر الجدول للمواد) + 1.5% كاربوكسيميثيلسيلولوسي الصوديوم الملح (CMC) منخفضة اللزوجة + FCS 2% يحتوي على القلم/بكتيريا لكل بئر.
        X M199 ملاحظة: 2 + FCS 4% + 2% القلم/بكتيريا وحلول CMC 3% بحاجة إلى أن تكون معدّة مسبقاً والمخزنة في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. تأكد من أن الحل هو استعد في 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى لوحات.
        1. إعداد حل x M199 2: 1 الكيس/500 مل المقطر المياه + 20 مل FCS + 10 مل القلم/بكتيريا (جعل حتى 2 x MI99). تصفية الحل باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
        2. لإعداد 3% CMC، إضافة 15 غم من اللجنة العسكرية المركزية ببطء إلى 500 مل ماء المقطر. حل اللجنة العسكرية المركزية في المياه باستخدام سخان محرض المعدني في 50 درجة مئوية، ويستغرق حوالي 1 ساعة إعداد. مزيج جيد لجعل 3% CMC والاوتوكلاف الحل.
          ملاحظة: اللجنة العسكرية المركزية الصلبة يجب أن يضاف إلى الماء من أجل حلها؛ وتنتج "أجمة" الصلبة التي من الصعب جداً حل إضافة المياه إلى الصلبة الجافة.
        3. إعداد 1 × M199 + 1.5% CMC منخفضة اللزوجة + FCS 2% يحتوي على القلم/بكتيريا بخلط 1:1 2 x M199 و 3% CMC إعدادها في الخطوة 1.2.2.4.2.
      5. احتضان لوحة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  3. وضع لوحة الفحص والتحليل (5 يوم)
    1. التثبيت والنامية المقايسة لوحة
      1. تجاهل اللجنة العسكرية المركزية + M199 + 2% FCS المحتوية على القلم/بكتيريا بعكس اللوحة بلطف. أضف ببطء (تجنبا للإزعاج في طبقة الخلايا) 200 ميكروليتر من التثبيت المخزن المؤقت (الأسيتون 80%، 20% برنامج تلفزيوني، المخزنة في-20 درجة مئوية) لإصلاح الخلايا. احتضان في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      2. تجاهل المخزن المؤقت التثبيت ولطخة بلطف في منشفة ورقية ماصة. اترك لوحة الوجه وصولاً إلى الجاف لمدة 10 دقائق.
        ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن إجراء الفحص خارج هود BSL2.
      3. إعداد 5% لبن حل حظر مادة في برنامج تلفزيوني المصفاة التي تحتوي على 0.05% بوليسوربيت 20 (برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت، انظر الجدول للمواد). للوحة واحدة، وحساب حجم اللازمة لعرقلة استناداً إلى الآبار 200/جيدا و 110: الآبار 200/بئر x 110 = مل 22 (1.1 مل تركيز الحليب مادة في مل 20.9 تصفية برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت). في هذه المرحلة، كما تشكل الحل حجب كافية للأجسام المضادة الأولية والثانوية. للوحة واحدة، وحساب حجم اللازمة لكل جسم حل يستند إلى الآبار 50/جيدا و 110: الآبار 110 x 50/جيدا = 5.5 مل. ولذلك، الحجم الإجمالي للحليب مخفف عرقلة الحل المطلوب مقايسة لوحة واحدة 33 مل.
      4. إضافة/well 200 من عرقلة الحل. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) عن 30 دقيقة تجاهل الحل بعكس اللوحة بلطف ولطخة على منشفة ورقية ماصة.
      5. إعداد 1: 500 الماعز X RSV جسم (ماب – جسم الابتدائي) المخفف في عرقلة الحل. إضافة 50/well الحل ماب واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 لوح الغسيل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت التي تمت تصفيتها.
      6. إعداد حمار أليكسا-فلور 1:5,000 مفتش الماعز المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) المخفف في عرقلة الحل. إضافة 50/well الحل جسم الثانوية واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 لوح الغسيل 5 مرات مع برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت التي تمت تصفيتها.
      7. قراءة اللوحة على قارئ الآلي بقع استخدام قناة fluorescein isothiocyanate (فيتك) وتعتمد الإعدادات كما هو مبين في الشكل 2. التفاف لوحة في إحباط وتخزينها في 4 درجات مئوية. معايرة هذا الصك باستخدام صفيحة غير مستخدمة 96-بئر ثقافة وإدخال الإعدادات العد قبل الفحص.
        ملاحظة: إعادة تفحص في غضون أيام قليلة من الممكن إذا لزم الأمر. يمكن حفظها واستخدامها لفحص المستقبل إذا كان الإنزيم يستخدم نفس النوع من اللوحة المستخدمة للمعايرة معايرة وإعداد عدد.
      8. تحقق من صور الآبار للحرفية لويحات أو تعطل الخلايا مونولاييرس (الشكل 3). استبعاد الآبار مع مونولاييرس خلية معطلة.
        ملاحظة: اعتماداً على حجم لويحات الحرفية، التهم اليدوي قد تحتاج إلى إجراء لهذه الآبار أو قد تحتاج تلك الآبار التخلص من تحليل البيانات. وتشمل معايير للحصول على نتيجة صحيحة لا خلية تعطلت أحادي الطبقة أو الحرفية لويحات المكتشفة في تكرار واحد أو أكثر وبفو لا اكتشاف في الآبار السلبية (الآبار دون الفيروسات المضافة).
    2. تحديد تركيزات الفيروسية
      1. اختر تخفيف الأخيرين حيث يمكن أن تحسب النقاط واضح. حساب متوسط عدد البقع من آبار نسخ متماثل في إضعاف نفسه. حساب عيار الفيروسية (بفو كل مل) من عينة المخزون باستخدام الصيغة التالية:
        بفو/مل = متوسط عدد من اللوحات (× معامل تخفيف حجم الفيروس المخفف يضاف إلى البئر)
        ملاحظة: تركيز الفيروس مصممة لكل سهم RSV يمكن الآن استخدامها في التحليل PRN (الخطوة 2).

2-RSV تحييد الإنزيم

  1. لوحات البذر (1 يوم)
    1. ريسوسبيند خلايا A549 في القلم 1000 وحدة دولية/بكتيريا في/mL 4 × 105+ دميم + FCS 10%. 96 البذور جيدا مسطحة-أسفل لوحات العقيمة مع 100 ميكروليتر/البئر التي تحتوي على A459 4 × 104 خلايا، واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (الخلايا ستكون في سجل--مرحلة النمو).
      ملاحظة: استخدام قنينة خلايا A549 جديدة بعد 23 الممرات. لا ينصح باستخدام خلايا A549 قبل مرور عدد 3.
  2. إعداد الفيروس والمصل (2 يوم)
    ملاحظة: اعتماداً على نوع العينة، هناك خطوات مطلوبة لعينات ما قبل المعالجة قبل الفحص قبض. من المستحسن استخدام الأمصال RSV القياسية الدولية التي أصبحت الآن متاحة بناء على طلب من المعهد الوطني "المعايير البيولوجية" والرقابة (NIBSC).
    1. إعداد مصل تمييع
      1. ذوبان الجليد antiserum مرجع RSV البشرية (المرجع المصل، المرجع) واختبار العينات في إلغاء تنشيط الحرارة الرايت عينات مصلية ومرجع أنتيسيروم في حمام مائي في 56 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل استخدام المصل. إعداد تخفيف حسب قالب لوحة (الشكل 4).
      2. إعداد تمييع 1: 100 لتحضير الرقم الحد أدنى من 110 ميكروليتر من REF المخفف في دميم + القلم/بكتيريا دون FCS كل لوح المقايسة (مثل، ميكروليتر 1.5 من المرجع في إجمالي حجم 150 ميكروليتر). إضافة 110 ميكروليتر من 1: 100 المخفف REF في A12 جيدا 96-جيدا U-قاع لوحة العقيمة.
      3. إضافة 55 ميكروليتر دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار B12 إلى H12 في العمود 12. إجراء تخفيف 1:2 أسفل اللوحة المسلسل بنقل 55 ميكروليتر من صف بصف ب وخلط الحل بمحتوى بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات والمستمرة حتى الصف تجاهل H. ميكروليتر 55 النهائي لوسائل الإعلام حيث يكون الحجم النهائي في كل ميكروليتر 55 جيدا. استخدام تلميحات جديدة لتمييع كل.
      4. إعداد تمييع 1: 100 من المصل عينات الاختبار. كما يتم جزيئي جميع عينات مصل الدم في ثلاث نسخ، إعداد حجم الحد أدنى ميكروليتر/البئر 110 × 3 = 330 ميكروليتر كل عينة اختبار المصل.
      5. إضافة 110 ميكروليتر من كل عينة اختبار المصل المخفف (1: 100؛ S1 = S2 من المصل 1، = مصل 2، إلخ.) إلى الآبار المقابلة A1 إلى A9 و E1 إلى E9 بليت العقيمة 96-جيدا وفقا الرقم 4أيضا.
      6. إضافة 55 ميكروليتر من دميم + القلم/بكتيريا دون FCS لجميع الآبار المسمى عاشرا تنفيذ المسلسل تخفيف 1:2 حسب الخطوة 2.2.1.3 حتى صف د (بالنسبة للعينات 1 و 2 و 3). تجاهل ميكروليتر 55 النهائي لوسائل الإعلام حيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 55 ميكروليتر. وبالمثل، أداء المسلسل تخفيف 1:2 لعينات 4 و 5 و 6 لصفوف ه إلى ه.
        ملاحظة: من المهم استخدام نصائح جديدة لتمييع كل.
      7. إضافة 55 ميكروليتر دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار في الأعمدة 10 و 11.
    2. إعداد الفيروسات
      1. سرعة ذوبان الجليد قنينة مجمدة واحدة من RSV في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مذاب تماما تقريبا ووضع فورا على الجليد.
      2. يضعف الفيروس في دميم + القلم/بكتيريا دون FCS استناداً إلى تركيز قاسمة RSV تحديد في الخطوة 1-3-2. تطبيق إضعاف الذي يعطي حوالي 200 بئر/بفو. إعداد وحدة تخزين إجمالي 5.5 مل (للآبار 100).
    3. إعداد الخليط مصل فيروس
      1. إضافة 55 الفيروس المخفف لجميع الآبار من أعمدة 1-9 وحفر الآبار من صفوف ه-ح من الأعمدة 10 و 11 (مراقبة إيجابية) وفقا للقالب لوحة (الشكل 4).
      2. إضافة 55 دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار جميع الصفوف أ-د من الأعمدة 10 و 11 (مراقبة سلبية). احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    4. تلقيح الفيروس إلى خلايا A549
      1. قبل انتهاء فترة الحضانة، استرداد cell plate(s) A549 إعدادها في الخطوة 2.1.1. التأكد من وجود مونولاييرس خلايا A549 في لوحات 96-جيدا روافد ~ 80%.
      2. تجاهل وسائل الإعلام بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة. تغسل جميع الآبار مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مرتين، وتجاهل برنامج تلفزيوني الزائدة بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسل. عدم السماح بلوحات لتجف.
      3. نقل/well 100 من خليط مصل فيروس إلى الآبار المقابلة على لوحة خلايا A549 عقب قالب لوحة إينكوباتي لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
      4. بعد ح 1، استخدام ماصة، وإخراج 90/جيدا وإضافة 100 من بريوارميد 1 × M199 + 1.5% CMC FCS 2% + + القلم/بكتيريا. احتضان لوحة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
        ملاحظة: تأكد من أن الحل هو استعد في 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى لوحات.
  3. وضع لوحة الفحص والتحليل (5 يوم)
    1. وضع لوحة التثبيت والمقايسة اتباع الخطوات 1.3.1.1 إلى 1.3.1.8.
    2. تحديد عيار تحييد 50%
      1. تحديد عيار تحييد 50% عن طريق حساب المسافة النسبية بين تخفيف المصل المتبادلة المذكورة أعلاه وأدناه 50% من عنصر التحكم 'لا مصل' الآبار (مراقبة الفيروسات إيجابية-العمود 10، صفوف ه-ح).
      2. حساب عدد بفو (أي، لويحات) الناجمة عن العدوى الفيروسية الفردية في الآبار المصل ولا آبار مراقبة المصل. حساب متوسط عدد بفو المصل لا مراقبة الآبار وتحديد القيمة 50%.
      3. تحديد تخفيف المصل مع التهم التي يتم فورا فوق وتحت القيمة 50% من آبار مراقبة المصل لا. استخدام الرسم البياني شبه سجل أو قالب جدول البيانات، ارسم عدد بفو على المحور السيني (المقياس الخطي) وتمييع المصل متبادلة على المحور الصادي (سجل الجدول10 ). رسم خط بين النقطتين وقراءة التتر تحييد 50% للاختبار عينات مصلية من هذا الخط.
        ملاحظة: يتم استخدام مقايسة RSV PRN ورقة العمل (ورقة العمل التكميلية) لتحديد عيار تحييد 50%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم إجراء المعايرة من مخزون فيروس من 01:10 إلى 01:108 إضعاف لتحديد تركيز الفيروس الأسهم قبل الفحص PRN (الممثل النتائج هو موضح في الشكل 5). من الرقم 5، بفو يمكن أن تحسب موثوق في تخفيف من 01:10 01:10 و4 5. تم حساب متوسط عدد بفو من ثلاث آبار في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لقد وضعت والأمثل البساطة والكفاءة RSV إبطال الجزئي مقايسة التي يمكن تكييفها مع سهولة في معظم المختبرات. هذا الفحص غير قادرة على قياس قدرة العدوى الفيروسية، فضلا عن قياس تثبيط العدوى الفيروسية بقبض على المستوى الخلوي باستخدام المسح صورة محوسبة. استخدام منصة المستندة إلى تصوير ونظم محددة تس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون جميع المشتركين. نعترف "برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية" للحكومة الفيكتوري. PVL مستلم NHMRC زمالة التنمية المهنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84(2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253(2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576(2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved