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Resumo

Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.

Resumo

Respiratórios sincicial vírus específicos anticorpos neutralizantes (RSV NAbs) são um importante marcador de proteção contra RSV. Um número de formatos diferentes de ensaio está atualmente em uso em todo o mundo para que haja a necessidade de um método de precisão e alta produtividade para medir RSV NAbs. Descrevemos aqui um ensaio de microneutralização com base em imagem que foi testado no subgrupo RSV A e também pode ser adaptado para o subgrupo RSV B e tipos de amostras diferentes. Este método é altamente reprodutível, com variações inter-ensaio para o soro de referência, sendo menos de 10%. Acreditamos que este ensaio pode ser prontamente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Desenvolvimento de um ensaio melhorado, elevado-throughput que mede RSV NAbs representa um significativo passo em frente para a padronização deste método internacionalmente, bem como sendo fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.

Introdução

Vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecções do trato respiratório inferior na população pediátrica em todo o mundo1. Apesar de sua alta carga, não há ainda nenhuma vacina ou tratamento disponível. Desde 2013, a Organização Mundial de saúde (OMS) declarou-se desenvolvimento de vacina RSV como uma prioridade de pesquisa principais, com anual WHO consulta reuniões2,3. A OMS chegou a acordo sobre uso de RSV neutralizando a medição de anticorpo (NAb) para monitorar a imunogenicidade da vacina, como isto é reconhecido como o principal marcador serológico de proteção4. NAbs foram mostrados para proteger contra uma grave infecção pelo VSR em um número de estudos, bem como ensaios clínicos do palivizumab anti-VRS monoclonal anticorpo, atualmente a estratégia profilática apenas disponível4.

Existem vários formatos de ensaio NAb usados pelos laboratórios em todo o mundo, incluindo ensaios baseados em molecular e celular, que têm feito esforços de padronização desafiando5,6,7,8. No entanto, o ensaio de neutralização (PRN) placa convencional-redução que mede o número de placa reduzida, formando unidades (PFU) pela presença de um anticorpo específico RSV continua a ser o padrão-ouro9. Aqui, nós relatamos um protocolo PRN melhorado, simplificado e alta produtividade que pode ser usado em inúmeras linhas de célula, por diferentes cepas de RSV e com taxa de transferência maior do ensaio. Este protocolo foi testado usando amostras clínicas de diferentes configurações, bem como em amostras de experiências modelo animal.

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Protocolo

Nota: Todos os passos tem que ser executada em uma capa de BSL2, a menos que indicado de forma diferente. Titulação viral é necessária com antecedência um ensaio PRN para determinar a concentração ideal de RSV utilizada no ensaio de PRN. Recomenda-se alíquota as reservas de vírus em um pequeno volume que será descongelado uma vez e usado para cada ensaio de NAb. Também é recomendável utilizar o mesmo estoque viral para todos os ensaios de NAb realizados para todas as amostras de um estudo. Certifique-se de meios de cultura e tampão fosfato salino (PBS) é aquecido a 37 ° C antes de adicionar placas de célula.

1. RSV titulação Viral

Nota: Dependendo do número de reservas de vírus e o número de duplicatas, a placa de ensaio pode ser configurada de acordo com a Figura 1. Cada estoque de vírus deverá ser titulado em triplicado abaixo da placa de ensaio, começando com a mais alta concentração viral (ou seja, 01:10). Titulações seriais podem ser normalmente 01:10. Cultura de pilha A549 e manutenção, bem como o procedimento de cultura RSV é feito usando os procedimentos padrão e não estão incluídos neste protocolo.

  1. Semeadura de placas (1 dia)
    1. Ressuspender as células A549 de Dulbecco Eagles modificado médio (DMEM) + 10% de soro fetal bezerro (FCS) + 1000 UI penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococos) em 4 x 105/mL. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo células de 4 x 104 A459.
    2. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase).
      Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. É aconselhável não iniciar os experimentos quando um novo frasco de célula está ainda nas primeiro de três passagens.
  2. Infecção por vírus (dia 2)
    1. Preparação de diluição serial de vírus
      1. Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo. Prepare-se 3 repetições para cada RSV estoque de vírus para ser analisada, usar uma diluição de vírus inicial de 01:10 com 100 μL de vírus/bem diluído e reserve pelo menos uma coluna para o controle negativo.
        Nota: A Figura 1 mostra o controlo negativo em triplica.
      2. Adicionar 100 μL de cada vírus diluído em 01:10 em triplicado de linha A de um U-fundo de 96 poços placa estéril. Adicionar 90 μL/poço de DMEM + 1000 UI pen/estreptococo sem FCS para linhas B-H.
      3. Executar serial 01:10 diluições abaixo da placa através da transferência de 10 μL de linha A linha solução B. Mix por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continuar as diluições dez vezes até linha H. descarte o final 10 μL, para que o volume final em cada bem é 90 μL.
        Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição.
    2. Inoculação do vírus às células A549
      1. Recupere cell plate(s) A549 preparado no dia anterior. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%. Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril.
      2. Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.
      3. Transferi as diluições de vírus da placa de titulação viral (Figura 1) correspondente aos poços da placa de célula A549. Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2. Após incubação de 1 h, decante sobrenadantes usando uma pipeta (para evitar contaminação cruzada). Tire 90 μL/poço.
      4. Adicionar 100 μL de médio 1 x 199 (M199, consulte tabela de materiais) + 1,5% sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC) de baixa viscosidade + FCS 2% contendo caneta/estreptococo a cada poço.
        Nota: 2 x M199 + FCS 4% + caneta/inflamada de 2% e 3% soluções CMC precisam ser preparado com antecedência e armazenadas a 4 ° C para uso futuro. Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.
        1. Preparar a solução de x M199 2: 1 sachê/500 mL de água destilada água + 20 mL FCS + 10 mL caneta/estreptococo (para compensar 2 x MI99). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de 0,22 μm.
        2. Para a preparação de 3%, CMC, adicione 15 g de CMC lentamente em 500 mL de água destilada. Dissolva o CMC na água usando aquecedor agitador metálico a 50 ° C, que leva cerca de 1h de preparação. Misture bem para fazer 3% CMC e autoclave a solução.
          Nota: O CMC sólido deve ser adicionado à água para ser dissolvido; adição de água para o sólido seco produz uma "moita" de sólido que é muito difícil de dissolver.
        3. Preparar 1 x M199 + baixa viscosidade CMC de 1,5% + 2% FCS contendo caneta/inflamada pela mistura 1:1 a 2 x M199 e 3% CMC preparado na etapa 1.2.2.4.2.
      5. Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
  3. Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
    1. Fixação e desenvolvimento do ensaio placa
      1. Descarte o M199 + CMC + 2% FCS contendo caneta/inflamada por inversão suavemente a placa. Adicionar lentamente (para evitar perturbar a camada de células) 200 μL de tampão de fixação (acetona 80%, 20% de PBS, armazenado a-20 ° C) para reparar as células. Incube a-20 º C por 20 min.
      2. Descartar o buffer de fixação e borre-se suavemente na toalha de papel absorvente. Deixar o rosto de placa até secar durante 10 min.
        Nota: Desta etapa em diante, o ensaio pode ser executado fora do capô BSL2.
      3. Preparar a solução bloqueio diluente de 5% leite em filtrado PBS contendo 0,05% polissorbato 20 (PBS-Polissorbato, consulte Tabela de materiais). Para um prato, calcular o volume necessário para bloqueio baseado em 200/bem e 110 poços: 200/poço x 110 poços = 22 mL (1,1 mL concentrado leite diluente em 20,9 mL filtrados polisorbato-PBS). Nesta fase, também compõem a solução bloqueio suficiente para anticorpos primários e secundários. Para um prato, calcular o volume necessário para cada solução de anticorpo baseada em poços/50 e 110: 50/bem x 110 poços = 5,5 mL. Portanto, o volume total de diluente de leite que obstrui a solução necessária para um ensaio de placa única é 33 mL.
      4. Adicione 200 pois da solução de bloqueio. Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) por 30 min. descarte a solução invertendo-se suavemente a placa e borre na toalha de papel absorvente.
      5. Prepare 1: 500 anticorpos de cabra X RSV (mAb – anticorpo primário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução mAb e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 3 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.
      6. Prepare 1:5,000 burro de Alexa Fluor anti-cabra IgG (anticorpo secundário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução anticorpo secundário e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 5 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.
      7. Leia a placa em um leitor de pontos automatizados usando o canal de fluoresceína isotiocianato (FITC) e contar as configurações, conforme mostrado na Figura 2. Embrulhe o prato em folha e armazenar a 4 ° C. Calibre o instrumento, usando uma placa de cultura de 96 poços não utilizadas e introduzir as configurações de contagem antes do ensaio.
        Nota: Re-digitalização dentro de alguns dias é possível, se necessário. A calibração e ajuste de contagem podem ser salvos e usados para a verificação futura, caso o ensaio utiliza o mesmo tipo de placa utilizada para a calibração.
      8. Verifique as imagens dos poços para placas de artefato ou monocamadas de células rompidas (Figura 3). Exclua poços com monocamadas de células rompidas.
        Nota: Dependendo do tamanho das placas artefacto, contagem manual pode precisar de ser executadas para os poços ou daqueles poços podem precisar ser descartado da análise de dados. Critérios para um resultado válido incluem placas de monocamada ou artefato sem células rompidas detectadas em replicar mais de um bem e não PFU detectado em negativos wells (poços sem vírus adicionado).
    2. Determinar as concentrações virais
      1. Escolha as últimas duas diluições onde manchas podem ser contadas claramente. Calcule o número médio de pontos de replicar poços na mesma diluição. Calcule o título viral (PFU / mL) da amostra ações usando a fórmula abaixo:
        PFU/mL = número médio de placas / (× fator de diluição Volume de vírus diluído adicionado ao poço)
        Nota: A concentração de vírus determinada para cada unidade populacional RSV agora pode ser usada no ensaio de PRN (etapa 2).

2. RSV neutralização ensaio

  1. Semeadura de placas (1 dia)
    1. Resuspenda A549 células em DMEM + 10% FCS + 1000 UI pen/estreptococo em /mL de 4 x 105. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo 4 x 104 A459 células e incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase).
      Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. Não é recomendável usar células A549 antes do número de passagem 3.
  2. Preparação de soro e vírus (dia 2)
    Nota: Dependendo do tipo de amostra, existem etapas necessárias para amostras de pré-processamento antes do ensaio de NAb. É recomendável usar o RSV internacional padrão sera que agora está disponível mediante pedido do Instituto Nacional de padrões biológicos e controles (NIBSC).
    1. Preparação da diluição do soro
      1. Descongelar o soro de referência RSV humano (soro de referência, REF) e soro teste amostras em RT. Heat-inativar amostras de soro e referência anti-soro num banho de água a 56 ° C durante 30 min antes de usar. Prepare diluições de acordo com o modelo da placa (Figura 4).
      2. Preparar a diluição 1: 100 a REF. Prepare um mínimo de 110 μL de REF diluído em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS por placa de ensaio (por exemplo,, 1,5 μL de REF em um volume total de 150 μL). Adicionar 110 μL de 1: 100 diluído REF em A12 bem de um U-fundo de 96 poços placa estéril.
      3. Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços B12 para H12 na coluna 12. Execute a série diluições de 1:2 para baixo a placa Transferindo 55 μL de linha A linha B, misturando a solução por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continua até a linha H. Discard o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada bem é 55 μL. Use novas dicas para cada diluição.
      4. Prepare a diluição de 1: 100 de soro teste amostras. Como todas as amostras de soro são doseadas em triplicado, preparar um volume mínimo de 110 μL/poço x 3 = 330 μL por amostra de soro.
      5. Adicionar 110 μL de cada amostra de soro diluído (1: 100; S1 = soro 1, S2 = soro 2, etc.) para poços correspondentes A1 A9 e também E1 a E9 da placa de 96 poços estéril, de acordo com a Figura 4.
      6. Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços rotulados X. Perform serial diluições de 1:2, conforme passo 2.2.1.3 até linha D (para amostras 1, 2 e 3). Descarte o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada poço é 55 μL. Da mesma forma, executar o serial diluições de 1:2 para amostras 4, 5 e 6 para linhas E-H.
        Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição.
      7. Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços nas colunas 10 e 11.
    2. Preparação do vírus
      1. Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo.
      2. Dilua o vírus em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS baseada na concentração da alíquota RSV determinada na etapa 1.3.2. Aplica uma diluição que dá aproximadamente 200 PFU/bem. Preparamos um volume total de 5,5 mL (100 poços).
    3. Preparação da mistura de soro e vírus
      1. Adicione 55 do vírus diluído para todos os poços de colunas 1-9 e poços de linhas E-H de colunas 10 e 11 (controle positivo), de acordo com o modelo da placa (Figura 4).
      2. Adicione 55 de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços de linhas A-D de colunas 10 e 11 (controle negativo). Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.
    4. Inoculação do vírus às células A549
      1. Antes da conclusão do período de incubação, recupere A549 cell plate(s) preparado na etapa 2.1.1. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%.
      2. Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril. Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.
      3. Transferi 100 pois da mistura de soro e vírus aos poços correspondentes na placa de célula A549, seguindo o modelo de placa incubar a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.
      4. Depois de 1h, usando uma pipeta, retirar 90/bem e adicionar 100 de pré-aquecido 1 x M199 + 1,5% CMC FCS 2% + caneta/estreptococos. Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2.
        Nota: Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.
  3. Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
    1. Desenvolva a placa de fixação e ensaio seguindo passos 1.3.1.1 para 1.3.1.8.
    2. Determinar o título de neutralização de 50%
      1. Determine que o título de neutralização de 50%, calculando a distância proporcional entre as diluições do soro recíproca acima e abaixo de 50% do controle 'sem soro' poços (controle positivo vírus - coluna 10, linhas E-H).
      2. Contar o número de PFU (ou seja, placas) decorrentes de infecções virais individuais em poços de soro e não poços de controle do soro. Calcular o número médio de PFU dos poços sem controle de soro e determinar o valor de 50%.
      3. Identifica as diluições do soro com contagens que são imediatamente acima e abaixo do valor de 50% dos poços sem controle de soro. Usando um gráfico log semi ou modelo de planilha, plotar o número de PFU sobre o eixo x (escala linear) e a diluição do soro recíproca no eixo y (escala de log10 ). Traçar uma linha entre os dois pontos e ler os títulos de neutralização de 50% do teste de amostras de soro desta linha.
        Nota: A planilha de ensaio RSV PRN (Planilha complementar) é usada para determinar o título de neutralização de 50%.

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Resultados

A titulação de um estoque de vírus foi realizada de 01:10 para 01:108 diluição para determinar a concentração de vírus estoque antes do ensaio do PRN (representante resultados mostrados na Figura 5). Da Figura 5, PFU pode ser contada de forma confiável em diluições de 01:104 e 01:105. Foi calculado o número médio de PFU de três vias poços na mesma diluição. Desde o número médio ...

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Discussão

Temos desenvolvido e aperfeiçoado um ensaio de microneutralização RSV simples e eficiente que pode ser facilmente adaptado na maioria dos laboratórios. Este ensaio é capaz de medir a capacidade de infecção viral, bem como a inibição da infecção viral por NAb a nível celular, usando a varredura de imagem computadorizada de medição. A utilização de uma plataforma baseada em imagem latente e sistemas baseados em anticorpos específicos aumentou a especificidade e a sensibilidade da deteção ponto comparada ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer todos os participantes envolvidos. Reconhecemos o programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano. LPC é um destinatário NHMRC Fellowship de desenvolvimento de carreira.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

Referências

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  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
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