Un test de Micro-neutralisation du Virus respiratoire Syncytial (VRS) amélioré et haut débit

Résumé

Cette étude décrit un haut débit, essai micro-neutralisation d’imagerie afin de déterminer le titre des anticorps neutralisants spécifiques pour le virus respiratoire syncytial (VRS). Ce format de test a été testé sur les types d’échantillons différents.

Résumé

Respiratoires syncytiales virus spécifique des anticorps neutralisants (RSV NAbs) sont un marqueur important de protection contre la RSV. Un certain nombre de formats différents test est actuellement utilisées dans le monde y a donc un besoin d’une méthode précise et haut-débit pour mesurer la RSV NAbs. Nous décrivons ici une analyse micro-neutralisation axée sur l’imagerie qui a été testée sur le sous-groupe RSV A et peut également être adaptée pour la RSV sous-groupe B et types d’échantillons différents. Cette méthode est très reproductible, avec des variations entre dosages pour l’antisérum de référence est inférieur à 10 %. Nous croyons que ce dosage peut être facilement établi dans de nombreux laboratoires dans le monde entier à un coût relativement faible. Développement d’un test amélioré et à haut débit qui mesure RSV NAbs représente une avancée significative pour la normalisation de cette méthode au niveau international comme étant critiques pour l’évaluation des nouveaux vaccins RSV à l’avenir.

Introduction

Virus respiratoire syncytial (VRS) est la principale cause des infections des voies respiratoires basses dans la population pédiatrique dans le monde¹. Malgré son poids élevé, il n’existe encore aucun vaccin ou traitement. Depuis 2013, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré au point de vaccins RSV comme une priorité de recherche majeur, avec des réunions de la consultation de WHO annuel^2,3. L’OMS a convenu sur l’utilisation de RSV neutralisant la mesure des anticorps (NAb) pour surveiller l’immunogénicité des vaccins, comme cela est reconnu comme le marqueur sérologique majeur de protection⁴. NAbs auraient dû être divulgués pour se protéger contre l’infection à VRS grave dans un certain nombre d’études ainsi que des essais cliniques de l’anticorps monoclonal anti-VRS palivizumab, actuellement la stratégie prophylactique uniquement disponible⁴.

Il existe plusieurs formats de dosage de NAb utilisées par les laboratoires dans le monde entier, y compris des analyses cellulaires et moléculaires, qui ont fait des efforts de normalisation difficile^5,6,7,8. Cependant, le test de neutralisation (PRN) de plaque-réduction conventionnels qui mesure le nombre de plaque réduite formant des unités (PFU) par la présence d’un anticorps spécifique au RSV demeure l' étalon-or⁹. Nous rapportons ici un protocole PRN amélioré, simplifié et haut débit qui peut être utilisé sur nombreuses lignées cellulaires, pour différentes souches de RSV et avec un débit accru de dosage. Ce protocole a été testé à l’aide d’échantillons cliniques de différents paramètres, ainsi que sur des échantillons provenant des expériences de modèle animal.

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Protocole

Remarque : Toutes les mesures doivent être effectuées sous une hotte BSL2 à moins d’indication contraire. Titrage viral est requis avant un test PRN pour déterminer la concentration optimale de RSV, utilisée dans l’essai de PRN. Il est recommandé de la partie aliquote les stocks de virus dans un petit volume qui sera décongelé une fois et utilisés pour chaque dosage NAb. À l’aide de la même souche virale pour toutes les analyses de NAb exécutées pour tous les échantillons provenant d’une étude est également recommandée. Veillez à ce que les milieux de culture et de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est chauffé à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques de la cellule.

1. RSV titrage Viral

Remarque : Selon le nombre de stocks de virus et le nombre de doublons, la plaque de test peut être configurée selon la Figure 1. Chaque stock de virus devrait être titré en trois exemplaires vers le bas de la plaque d’essai, à partir de la plus forte concentration virale (par exemple, 01:10). Titrages de série peuvent être généralement 01:10. Culture de cellules A549 et entretien ainsi que mise en culture RSV est effectuée à l’aide de procédures standards et ne sont pas inclus dans le présent protocole.

1. Plaques de semis (1 jour)
   1. Remettre en suspension les cellules A549 de Dulbecco milieu modifié Eagles (DMEM) + 10 % de sérum de veau foetal (FCS) + 1000IU pénicilline/streptomycine (stylo/strep) à 4 x 105/ml. Graine de 96 puits à fond plat plaques stériles avec 100 μL/puits contenant des cellules de 4 x 10⁴ A459.
   2. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂ (cellules seront dans la croissance de la phase logarithmique).
      Remarque : Utilisez le nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il est recommandé de ne pas commencer les expériences quand un nouveau flacon de cellule est toujours dans les trois premiers passages.
2. Infection par le virus (jour 2)
   1. Préparation des dilutions de virus
      1. Rapidement décongeler un seul flacon congelé du VRS dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que presque complètement décongelés et placer immédiatement sur la glace. Préparer 3 répétitions pour chaque RSV stock de virus à être dosés, utiliser une dilution de stock de virus initial de 01:10 avec 100 μL de virus/bien dilué et réserver au moins une colonne de contrôle négatif.
         Remarque : Figure 1 illustre le contrôle négatif en géométrie.
      2. Ajouter 100 μL de chaque virus dilué à 01:10 en trois exemplaires de la ligne A du 96 puits U fond plaque stérile. Ajouter 90 μL/puits de DMEM + 1000IU stylo/strep sans FCS aux lignes B à H.
      3. Effectuer la série 01:10 dilutions vers le bas de la plaque en transférant 10 μL de la ligne A au rang de solution B. Mix de pipetage contenu et descendre 5 fois et continuer les dilutions dix fois jusqu’en ligne H. jeter la finale 10 μL afin que chacun le volume final est bien 90 μL.
         Remarque : Il est important d’utiliser de nouvelles astuces pour chaque dilution.
   2. Inoculation du virus aux cellules A549
      1. Récupérer cell plate(s) A549 préparé la veille. S’assurer que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont ~ 80 % anastomosé. Jeter les médias en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile.
      2. Laver tous les puits avec 100 μl de PBS, jeter les excès PBS en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile après chaque lavage. Ne pas laisser les plaques sécher.
      3. Transférer les dilutions de virus de la plaque de titrage viral (Figure 1) aux puits correspondants sur la plaque de cellules A549. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO₂. Après 1 h d’incubation, décanter le surnageant à l’aide d’une pipette (pour éviter la contamination croisée). Retirer 90 μL/puits.
      4. Ajouter 100 μl de milieu 1 x 199 (M199, voir Table des matières) + 1,5 % sel de sodium carboxyméthylcellulose (CMC) faible viscosité + 2 % FCS contenant pen/strep dans chaque puits.
         NOTE : 2 x M199 + FCS 4 % + 2 % plume/strep et solutions de CMC 3 % doivent être préparées à l’avance et conservés à 4 ° C pour une utilisation future. Assurez-vous que la solution est chauffée à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques.
         1. Préparer la solution de x M199 2 : 1 sachet/500 mL eau distillée, eau + 20 mL FCS + 10 mL stylo/strep (compenser 2 x MI99). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
         2. Pour la préparation de 3 % de MCC, ajouter 15 g de CMC lentement dans 500 mL d’eau distillée. Dissoudre le MCC dans l’eau à l’aide de radiateur agitateur métallique à 50 ° C, ce qui prend environ 1 h de préparation. Mélanger bien pour faire 3 % CMC et stériliser la solution.
            Remarque : Le CMC solid doit être ajouté à l’eau afin d’être dissoute ; ajouter de l’eau à la solide sec produit un « bouquet » de solide qui est très difficile à dissoudre.
         3. Préparer 1 x M199 + faible viscosité CMC 1,5 % + 2 % FCS contenant pen/strep en mélangeant 1:1 le 2 x M199 et 3 % CMC établie à l’étape 1.2.2.4.2.
      5. Incuber les plaques pendant 3 jours à 37 ° C, 5 % de CO₂.
3. Développement de la plaque de test et d’analyse (jour 5)
   1. Fixation et plaque de test en développement
      1. Jetez M199 + MCC + 2 % FCS stylo contenant/strep en retournant délicatement la plaque. Ajouter lentement (afin d’éviter de perturber la couche de cellules) 200 μL de tampon de fixation (80 % d’acétone, PBS de 20 %, conservés à-20 ° C) pour fixer les cellules. Incuber à-20 ° C pendant 20 min.
      2. Jeter le tampon de fixation et éponger doucement sur la serviette de papier absorbant. Laisser le visage de la plaque vers le bas pour sécher pendant 10 min.
         Remarque : De partir de cette étape, essai peut être effectué à l’extérieur de la hotte BSL2.
      3. Préparer le solution blocage diluant dans du PBS filtrée contenant 0,05 % de 5 % lait polysorbate 20 (PBS-polysorbate, voir Table des matières). Pour une plaque, calculer le volume nécessaire pour blocage basé sur 200/puits et 110 puits : 200/puits x 110 puits = 22 mL (1,1 mL concentré de lait diluant à 20,9 mL filtrés PBS-polysorbate). À ce stade, composent aussi solution de blocage suffisante pour des anticorps primaires et secondaires. Pour une plaque, calculer le volume nécessaire pour chaque solution d’anticorps issue des puits/50 et 110 : 110 puits x 50/bien = 5,5 mL. Par conséquent, le volume total de lait diluant bloquant la solution requise pour un dosage Monodisque est 33 mL.
      4. Ajouter 200 /well de solution de saturation. Incuber plaque à température ambiante (RT) pendant 30 min. jetez la solution en retournant délicatement la plaque et sécher sur une serviette de papier absorbant.
      5. Préparer des anticorps de chèvre X VRS de 1/500 (mAb-anticorps primaire) dilué en bloquant la solution. Ajouter 50 /well de la solution de mAb et incuber à 37 ° C pendant 1 h. plaque de lavage 3 fois avec PBS-polysorbate filtrée.
      6. Préparer l’âne d’Alexa Fluor 1:5,000 anti-chèvre IgG (anticorps secondaire) dilué en bloquant la solution. Ajouter 50 /well de la solution d’anticorps secondaire et incuber à 37 ° C pendant 1 h. plaque de lavage 5 fois avec PBS-polysorbate filtrée.
      7. Lire la plaque sur un lecteur de taches automatisées en utilisant le canal de fluorescéine isothiocyanate (FITC) et compter les paramètres, comme illustré à la Figure 2. Enrouler la plaque au fleuret et conserver à 4 ° C. Calibrer l’appareil à l’aide d’une plaque de culture de 96 puits inutilisé et saisie des paramètres de compte avant le dosage.
         Remarque : Re-scanner dans les prochains jours est possible si nécessaire. L’étalonnage et le réglage du comte peuvent être enregistrés et utilisés pour la numérisation future si le test utilise le même type de plaque utilisée pour l’étalonnage.
      8. Vérifier les images des puits pour plaques d’artefact ou monocouches de cellules perturbé (Figure 3). Exclure les puits avec les monocouches de cellules perturbées.
         Remarque : Selon la taille des plaques artefact, comptages manuels peuvent doivent être effectuées pour ces puits ou ces puits pourraient devoir être rejetées par l’analyse des données. Critères pour un résultat valide comprennent les plaques monocouche ou artefact aucune cellule perturbé détectés dans plus d’une réplique bien et aucun PFU détecté en négatifs puits (puits sans virus ajouté).
   2. Déterminer les concentrations virales
      1. Choisissez les deux dernières dilutions où les taches peuvent être comptées clairement. Calculer le nombre moyen de taches de puits répétées à la même dilution. Calculer le titre viral (UFP / mL) de l’exemple stock, en utilisant la formule ci-dessous :
         UFP/mL = nombre moyen de plaques / (Volume de virus dilué × facteur de Dilution ajoutée au puits)
         NOTE : La concentration de virus déterminée pour chaque stock RSV peut maintenant servir dans le dosage de la PRN (étape 2).

2. RSV neutralisation Assay

1. Plaques de semis (1 jour)
   1. Remettre en suspension les cellules A549 DMEM + 10 % FCS + 1000IU stylo/strep à 4 x 105/ml. Plaques de stériles semences 96 puits à fond plat avec 100 μL/puits contenant 4 x 10⁴ A459 cellules et incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂ (cellules seront dans la croissance de la phase logarithmique).
      Remarque : Utilisez le nouveau flacon de cellules A549 après 23 passages. Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules A549 avant numéro de passage 3.
2. Préparation de virus et de sérum (jour 2)
   Remarque : Selon le type de l’échantillon, il y a des étapes requises pour le pré-traitement des échantillons avant le dosage de la NAb. Il est recommandé d’utiliser le sérum standard international RSV qui sont maintenant disponible sur demande de l’Institut National Biological Standards and Controls (NIBSC).
   1. Préparation de la dilution du sérum
      1. Décongeler l’antisérum de référence RSV humain (sérum de référence, REF) et sérum tester des échantillons à inactiver les Heat RT.-des échantillons de sérum et référencer l’antisérum dans un bain d’eau à 56 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser. Préparer des dilutions selon le modèle de la plaque (Figure 4).
      2. Dilution au 1/100 de la préparation de la réf. du préparer un minimum de 110 μL de REF dilué dans DMEM + stylo/strep sans FCS par plaque de test (par exemple, 1,5 μL de REF dans un volume total de 150 μL). Ajouter 110 μL de 1/100 dilué REF dans bien A12 de 96 puits U fond plaque stérile.
      3. Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS aux puits B12 à H12 dans la colonne 12. Effectuer série des dilutions de 1:2 vers le bas de la plaque de transfert μL 55 entre ligne A et ligne B, solution de mélange de pipetage contenu et descendre 5 fois et continuant jusqu'à ligne H. jeter le μL 55 final des médias afin que chacun le volume final est bien 55 μL. Utilisez les nouvelles astuces pour chaque dilution.
      4. Préparer au 1/100 dilution du sérum échantillons essayés. Comme tous les échantillons de sérum sont testés en triple exemplaire, préparer un volume minimum de 110 μL/puits x 3 = 330 μL / échantillon de sérum.
      5. Ajouter 110 μL de chaque échantillon de sérum dilué (1/100 ; S1 = sérum 1, S2 = sérum 2, etc..) correspondant à des puits A1 à A9 et aussi E1 à E9 de la plaque 96 puits stérile selon la Figure 4.
      6. Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS dans toutes les loges étiquetés Perform X. série 1:2 dilutions comme par l’Etape 2.2.1.3 jusqu’au rang D (pour exemples 1, 2 et 3). Jeter le μL 55 final des médias afin que le volume final de chaque puits est 55 μL. De même, effectuer la série des dilutions de 1:2 pour les échantillons de 4, 5 et 6 pour les lignes E à H.
         Remarque : Il est important d’utiliser de nouvelles astuces pour chaque dilution.
      7. Ajouter 55 μL de DMEM + stylo/strep sans FCS à Herbert George wells dans les colonnes 10 et 11.
   2. Préparation du virus
      1. Rapidement décongeler un seul flacon congelé du VRS dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que presque complètement décongelés et placer immédiatement sur la glace.
      2. Diluer les virus en DMEM + stylo/strep sans FCS basées sur la concentration de l’aliquote de RSV, déterminé à l’étape 1.3.2. Appliquer une dilution qui donne environ 200 PFU/puits. Préparer un volume total de 5,5 mL (pour 100 puits).
   3. Préparation du mélange de virus-sérum
      1. Ajouter 55 du virus dilué à tous les puits des colonnes 1 à 9 et les puits de lignes E-H des colonnes 10 et 11 (contrôle positif) selon le modèle de la plaque (Figure 4).
      2. Ajouter 55 de DMEM + stylo/strep sans FCS dans toutes les loges de lignes A-D des colonnes 10 et 11 (témoin négatif). Incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   4. Inoculation du virus aux cellules A549
      1. Avant la fin de la période d’incubation, récupérer cell plate(s) A549 préparées à l’étape 2.1.1. S’assurer que les monocouches de cellules A549 dans les plaques de 96 puits sont ~ 80 % anastomosé.
      2. Jeter les médias en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile. Laver tous les puits avec 100 μl de PBS, jeter les excès PBS en retournant doucement le plaque et éponger légèrement sur une serviette en papier absorbant stérile après chaque lavage. Ne pas laisser les plaques sécher.
      3. Transférer 100 /well du mélange virus-sérum dans les puits correspondants sur la plaque de cellules A549 suivant le modèle de plaque incuber la plaque pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
      4. Après que 1 h, à l’aide d’une pipette, sortir 90/bien et ajouter 100 de préchauffé 1 x M199 + 1,5 % MCC + 2 % FCS + stylo/strep. Incuber les plaques pendant 3 jours à 37 ° C, 5 % de CO₂.
         Remarque : Assurez-vous que la solution est chauffée à 37 ° C avant d’ajouter aux plaques.
3. Développement de la plaque de test et d’analyse (jour 5)
   1. Mettre la plaque de fixation et dosage suivant étapes 1.3.1.1 à 1.3.1.8.
   2. Déterminer le titre de neutralisation de 50 %
      1. Déterminer que le titre de neutralisation de 50 % en calculant la distance proportionnelle entre les dilutions du sérum réciproque ci-dessus et inférieure à 50 % du contrôle « aucun sérum » wells (contrôle positif de virus - colonne 10, lignes E-H).
      2. Compter le nombre de PFU (c.-à-d., plaques) dus à des infections virales dans les puits de sérum et aucun puits de contrôle sérum. Calculer le nombre moyen de PFU aucun puits contrôle sérum et déterminer la valeur de 50 %.
      3. Identifier les dilutions de sérum de chefs qui sont immédiatement au-dessus et au-dessous de la valeur de 50 % des aucun puits de contrôle de sérum. À l’aide d’un modèle de feuille de calcul ou en graphique semi-logarithmique, tracer le nombre de PFU sur l’axe des abscisses (échelle linéaire) et la dilution du sérum réciproque sur l’axe des ordonnées (échelle₁₀ log). Tracer une ligne entre deux points et lire les titres de neutralisation de 50 % de l’essai des échantillons de sérum de cette ligne.
         Remarque : La feuille de test RSV PRN (Feuille de calcul complémentaire) est utilisée pour déterminer le titre de neutralisation de 50 %.

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Résultats

Le titrage d’un stock de virus a été réalisé à partir de 01:10 à 01:10⁸ dilution pour déterminer la concentration de virus stock avant l’essai PRN (résultats représentatifs illustrés à la Figure 5). De la Figure 5, PFU peut compter sûrement à des dilutions de 01:10⁴ et 01:10⁵. Le nombre moyen de PFU de puits en triple à la même dilution a été calculé. Depuis le nombre moyen d...

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Discussion

Nous avons développé et optimisé un test de micro-neutralisation de la RSV simple et efficace qui peut être facilement adapté à la plupart des laboratoires. Ce test est capable de mesurer la capacité d’infection virale ainsi que l’inhibition de l’infection virale par NAb au niveau cellulaire à l’aide de balayage d’image informatisée de mesure. L’utilisation d’une plateforme d’imagerie et systèmes de base d’anticorps spécifiques a augmenté la spécificité et la sensibilité de détection tac...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell line
A549	ATCC	CCL-185	provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2	ATCC	VR-1540	lot number 60430286
Reagents
Acetone	Merck	1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)	Life Technologies	A11055
CMC sodium salt powder	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)	Scientific Services – Tissue Culture		MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)	Interpath	SFBS-F
Goat X RSV antibody	Merck	AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)	BEI Resources	NR-4022	Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder	Life Technologies	31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)	Australian Biosearch	50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)	Life Technologies	15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser	Merck		In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)	Scientific Services – Tissue Culture		MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate	Sigma-Aldrich	9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)	Invitro Technologies	FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)	Thermo Fisher	NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)	Australia PL	AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	650180
5 mL serological pipette	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
10 mL serological pipette	Interpath	607180
25 mL serological pipette	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007