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요약

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

초록

호흡 syncytial 바이러스는 특정 중화 항 체 (RSV NAbs)는 RSV에 대 한 보호의 중요 한 표식. 다른 분석 결과 형식의 번호에에서는 현재 전세계 사용 이므로 RSV NAbs 측정 하기 위한 정확 하 고 높은 처리 방법에 대 한 필요. 여기는 영상 기반 마이크로 중화 분석 결과 RSV 하위 그룹 A에서 테스트 되었습니다와 RSV 하위 그룹 B 및 서로 다른 샘플에 대 한 또한 적응 수 있습니다 설명 합니다. 이 방법은 매우 재현성, 참조 원으로 10% 미만 대 한 상호 분석 결과 유사 합니다. 우리는이 분석 결과 많은 실험실에서 상대적으로 저렴 한 비용으로 전세계에 쉽게 설치 될 수 있다 믿습니다. RSV NAbs 측정 개선, 높은 처리량 분석 결과의 개발 뿐만 아니라 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 되 고 국제적으로이 방법의 표준화에 대 한 중요 한 단계를 앞으로 나타냅니다.

서문

호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 소아 인구 세계1에 더 낮은 호흡 기관 감염의 주요 원인입니다. 그것의 높은 부담에도 불구 하 고 아직 아무 백신 이나 치료 가능한 있다. 2013 년 이후 세계 보건 기구 (WHO)는 주요 연구 우선 순위, 연간 WHO 상담 회의2,3로 RSV 백신 개발을 선언 했다. WHO는 RSV 중화 항 체 (NAb) 측정 모니터를 사용 하 백신 immunogenicity로 보호4의 주요 혈 청 학적인 감 적으로 인식 되 고이에 동의 했다. NAbs 안티-RSV 단일 클론 항 체 palivizumab, 현재만 예방 전략 사용 가능한4의 임상 시험 연구의 숫자에 가혹한 RSV 감염 으로부터 보호 하기 위해 표시 되었습니다.

5,6,,78도전 표준화 노력 만든 세포 및 분자 기반 분석을 포함 한 전세계 실험실에 의해 사용 되는 여러 NAb 분석 결과 형식을 확인 하 고 있습니다. 그러나, RSV 특정 항 체의 존재에 의해 감소 된 플 라크 형성 단위 (PFU)의 수를 측정 하는 기존의 플 라크 감소 중화 (PRN) 분석 결과 금9아직도 남아 있다. 여기, 우리는 향상 된, 단순화, 및 높은 처리량 PRN 프로토콜 다른 RSV 긴장 증가 분석 결과 처리량과 수많은 셀 라인에 사용할 수 있는 보고 합니다. 이 프로토콜은 임상 샘플 다른 설정에서 뿐만 아니라 동물 모델 실험에서 샘플을 사용 하 여 테스트 되었습니다.

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프로토콜

참고: 모든 단계는 다르게 명시 하지 않는 한 BSL2 후드에서 수행 해야 합니다. 바이러스 성 적정이 PRN 분석 결과에 사용 되는 최적의 RSV 농도 결정 하는 PRN 분석 결과 사전 필요 합니다. 약 수를 한 번 해 동 되 고 각 NAb 분석 결과 대 한 사용 되는 작은 볼륨에서 바이러스 주식 추천 된다. 모든 NAb 분석 한 연구에서 모든 샘플에 대 한 수행에 대 한 같은 바이러스 성 주식을 사용 하 여 또한 것이 좋습니다. 문화 미디어와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 셀 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열이 다는 것을 확인 하십시오.

1. RSV 바이러스 성 적정

참고: 바이러스 주식 수와 중복의 수에 따라 분석 결과 접시 그림 1에 따라 설정할 수 있습니다. 각 바이러스 주식 분석 결과 플레이트, 높은 바이러스 농도 (즉, 1:10)부터 아래로 3 중에서 적정 한다. 일반적으로 직렬 titrations 수 1시 10분. RSV 문화 절차 뿐만 아니라 A549 세포 배양 및 유지 보수 할 수 있습니다 표준 절차를 사용 하 고이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.

  1. 시드 플레이트 (1 일)
    1. Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) + 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) + 1000 IU 페니실린/스 (펜/strep) 4 x 105/mL A549 세포 resuspend 100 μ/잘 4 x 104 A459 셀을 포함 하 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 접시.
    2. 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다).
      참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 그것은 권장 하지 시작 실험 때 새로운 셀 유리병은 처음 세 개의 구절에서 여전히.
  2. 바이러스 감염 (주 2)
    1. 바이러스 직렬 희석의 준비
      1. 거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게. 3 복제 준비 각 RSV 바이러스 재고 분석 수, 희석 바이러스/잘 100 μ 1시 10분의 초기 바이러스 재고 희석 사용 하 고 부정적인 제어에 대 한 열이 하나 이상 보유 합니다.
        참고: 그림 1 triplicates에 부정적인 컨트롤을 보여 줍니다.
      2. 각 희석된 바이러스의 100 μ A 96 잘 U-바닥의 행의 3 중에서 1:10 추가 살 균 판. DMEM + 1000 IU 펜/strep FCS 없이 90 μ/잘 헤 B 행에 추가
      3. 수행 하는 직렬 1시 10분 희석 아래로 행을 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 B. 믹스 솔루션 행 행 H. 폐기 최종 10 μ까지 ten-fold 희석 되도록 각 최종 볼륨 잘 90 μ A에서 10 μ를 전송 하 여 접시.
        참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.
    2. A549 세포에 바이러스 접종
      1. 전날에 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다. 부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다.
      2. PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.
      3. A549 세포에 바이러스 성 적정 플레이트 (그림 1)에서 해당 우물 바이러스 희석을 전송. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어. 1 h 부 화 후 supernatants를 (교차 오염 방지) 하는 피 펫을 사용 하 여 가만히 따르다. 90 μ/잘 꺼내 주세요.
      4. 추가 1 x 매체 199의 100 μ (M199, 재료의 표 참조) + 1.5 %carboxymethylcellulose 나트륨 소금 (CMC) 낮은 점도 + 펜/strep 각 잘을 포함 하는 2 %FCS.
        참고: 2 x M199 + 4 %FCS + 펜/strep 2%와 3 %CMC 솔루션 사전에 준비 하 여 나중에 사용할 4 ° C에 저장 해야 합니다. 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.
        1. 2 x M199 솔루션 준비: 1 향 주머니/500 mL 증류수 10 mL 펜/strep + 물 + 20 mL FCS (2를 만들기 위해 x MI99). 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
        2. 3의 준비에 대 한 %CMC, 증류수 500 mL에 천천히 CMC의 15 g 추가. 준비의 약 1 h는 50 ° C에서 금속 활동가 히터를 사용 하 여 물에 CMC를 분해. 믹스 3을 잘 %CMC 및 고압 솔루션.
          참고: 단단한 CMC; 해산 하기 위하여 물에 추가 되어야 합니다. 건조 고체 물 추가 분해 하기 매우 어려운 고체의 "덩어리"를 생성 합니다.
        3. 1 x M199 + 1.5 %CMC 낮은 점도 준비 + 펜/strep 혼합 하 여 1: 1를 포함 하는 2% FCS M199 및 3% x 2 CMC 단계 1.2.2.4.2에서에서 준비.
      5. 37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어.
  3. 분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
    1. 고정 및 개발 분석 결과 플레이트
      1. 부드럽게 접시를 반전 하 여 M199 CMC + 2 %FCS 포함 펜/strep를 삭제 합니다. 천천히 추가 (피하기 위하여 셀 레이어 방해) 고정 버퍼 (80% 아세톤, 20 %PBS,-20 ° C에서 저장 된)의 200 μ 셀을 해결 하기 위해. 20 분 동안-20 ° C에서 품 어.
      2. 고정 버퍼를 삭제 하 고 부드럽게 흡수 성 종이 타월에 오 점. 플레이트 얼굴을 두고 10 분 동안 드라이까지.
        참고: 앞으로이 단계에서 분석 결과 BSL2 후드 밖에 서 수행할 수 있습니다.
      3. 준비 5% 우유 희석제 차단 솔루션 0.05%를 포함 하는 필터링 된 PBS에 폴 20 (PBS-법무부, 재료의 표참조). 한 접시, 200/잘 고 110 우물에 따라 차단에 필요한 볼륨 계산: 200/잘 x 110 웰 스 = 22 mL (1.1 집중 mL 우유 20.9 ml에서 희석제 필터링 PBS-법무부). 이 단계에서 또한 1 차 및 이차 항 체에 대 한 충분 한 차단 솔루션을 확인 합니다. 한 접시에 대 한 계산 50/잘 고 110 우물에 따라 각 항 체 솔루션에 필요한 볼륨: 50/잘 x 110 웰 스 5.5 mL =. 따라서, 단일 플레이트 분석 결과에 필요한 솔루션을 차단 하는 우유 희석 액의 총 볼륨 33 mL 이다.
      4. 차단 솔루션의 200 /well을 추가 합니다. 품 어 플레이트 실 온 (RT)에서 30 분 삭제에 대 한 솔루션 부드럽게 접시를 반전 하 여 고 흡수 성 종이 타월에 오 점.
      5. 1: 500 염소 X RSV 항 체 (mAb-1 차적인 항 체) 솔루션을 차단에 희석을 준비 합니다. MAb 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 3 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.
      6. 1:5,000 알 렉 사 Fluor 당나귀 솔루션을 차단에 희석 방지 염소 IgG (이차 항 체)를 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 5 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.
      7. 읽기 fluorescein isothiocyanate (FITC) 채널을 사용 하 여 자동화 된 명소 리더에 접시 및 그림 2와 같이 설정. 접시를 호 일에 포장 및 4 ° c.에 저장 악기는 사용 하지 않는 96 잘 문화 플레이트를 사용 하 여 및 분석 결과 전에 수 설정을 입력 보정.
        참고: 몇 일 이내에 다시 검사 하는 것이 필요한 경우 가능 합니다. 교정 및 개수 설정을 저장 하 고 분석 결과 보정에 사용 하는 접시의 동일한 유형을 사용 하는 경우 미래의 검색을 위해 사용할 수 있습니다.
      8. 인 위 플 라크 또는 방해 셀 monolayers (그림 3)에 대 한 웰 스의 이미지를 확인 하십시오. 교란된 셀 monolayers와 웰 스 제외.
        참고: 인 위 패의 크기에 따라 수동 카운트 그 우물에 대 한 수행 해야 할 수도 있습니다 또는 그 우물 데이터 분석에서 삭제 할 수 있습니다. 유효한 결과 대 한 기준 이상의 복제에서 잘 발견 아무 방해 셀 단층 또는 인 위 패와 부정적인 우물 (추가 바이러스 없이 우물)에서 검색 된 없음 PFU 포함.
    2. 바이러스 농도 결정
      1. 마지막 두 희석 명소 명확 하 게 계산 될 수 있는 곳을 선택 합니다. 관광 명소 같은 희석에 복제 우물에서의 평균 수를 계산 합니다. 아래 수식을 사용 하 여 재고 샘플의 바이러스 titer (mL 당 PFU) 계산:
        PFU/mL = 플 라크의 평균 수 (희석 비율 × 희석된 바이러스 양의 우물에 추가) /
        참고: 각 RSV 주식에 대 한 결정 하는 바이러스 농도 이제 PRN 분석 결과 (2 단계)에서 사용할 수 있습니다.

2. RSV 중화 분석 결과

  1. 시드 플레이트 (1 일)
    1. DMEM + 10 %FCS + 4 x 105/mL에서 1000 IU 펜/strep A549 세포 resuspend 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 판 100 μ/잘 포함 하는 4 x 104 A459 세포 및 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다).
      참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 3 번 통과 하기 전에 A549 세포를 사용 하는 권장 하지 않습니다.
  2. 바이러스 및 혈 청 준비 (주 2)
    참고: 샘플 유형에 따라 NAb 분석 결과 전에 미리 처리 샘플에 대 한 필요한 단계 있다. 생물학 표준 및 컨트롤 (NIBSC) 국립 연구소에서 요청 시 사용할 수 있습니다 RSV 국제 표준 세라를 사용 하는 것이 좋습니다.
    1. 혈 청 희석의 준비
      1. 인간의 RSV 참조 원으로 (참조 혈 청, REF)를 녹여 및 혈 청 혈 청 샘플 실시간 열 비활성화 샘플 테스트 원으로 사용 하기 30 분 전에 56 ° C에서 물 욕조에 참조. 플레이트 템플릿 (그림 4)에 의하여 희석을 준비 합니다.
      2. 참고 준비의 1: 100 희석 DMEM + 시험 접시 당 FCS 없이 펜/strep 희석 ref 110 μ의 준비 (예:, 150 μ의 전체 볼륨에 REF의 1.5 μ). 1: 100의 110 μ 희석 96 잘 U-바닥의 잘 A12에 REF 추가 살 균 판.
      3. 웰 스 B12 H12 열 12 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다. 행 A에서에서 행 B 55 μ를 전송, 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 솔루션을 혼합 하 고는 각 최종 볼륨 잘 55 μ 미디어의 최종 55 μ 행 H. 삭제 될 때까지 계속 하 여 시리얼 접시 내려 1:2 희석을 수행 합니다. 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.
      4. 1: 100 희석 혈 청의 테스트 샘플을 준비 합니다. 모든 혈 청 샘플은 3 중에서 분석, 준비의 110 μ/3 = 330 x 최소 볼륨 혈 청 테스트 샘플 당 μ.
      5. 각 희석된 혈 청 테스트 샘플 (1: 100; 110 μ를 추가 S1 = 혈 청 1, S2 = 세럼 2, 등.) A9 하도를 그림 4에 따라 96-잘 살 균 격판덮개의 E9 E1 해당 웰 스 A1.
      6. DMEM의 55 μ 추가 + 모든 우물 FCS 없이 펜/strep 표시 X. 수행 직렬 1:2 희석 단계 2.2.1.3 당 행 D (예제 1, 2, 및 3)까지. 각 잘에서 최종 볼륨은 55 μ 미디어의 최종 55 μ를 삭제 합니다. 마찬가지로, 4, 5, 및 6 행 E H. 샘플에 대 한 직렬 1:2 희석 수행
        참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.
      7. 열 10, 11에에서 웰 스 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다.
    2. 바이러스의 준비
      1. 거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게.
      2. 1.3.2 단계에서 결정 된 RSV 약 수의 농도에 따라 FCS 없이 DMEM + 펜/strep 바이러스를 희석. 약 200 PFU/잘 주는 희석을 적용 됩니다. 5.5 mL의 총 볼륨 (100 정)에 대 한 준비.
    3. 바이러스 혈 청 혼합물의 준비
      1. 열 1-9의 모든 우물과 행 E-H 10 및 11 (긍정적인 통제) 접시 템플릿 (그림 4)에 따라 열의 우물에 희석된 바이러스의 55를 추가 합니다.
      2. DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 행 열 10, 11 (부정적인 제어)의 A-D의 모든 우물을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.
    4. A549 세포에 바이러스 접종
      1. 잠복기의 완료 이전 단계 2.1.1에서에서 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다.
      2. 부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다. PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.
      3. 다음 접시 템플릿 품 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시 A549 세포에 바이러스 혈 청 혼합물의 100 /well 해당 웰 스 전송.
      4. 피 펫을 사용 하 여 1 h 90/잘 꺼내 고 추가 후의 100 x M199 + 1.5 %CMC + 2 %FCS + 펜/strep 1 prewarmed. 37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어.
        참고: 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.
  3. 분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
    1. 개발 단계 1.3.1.1 1.3.1.8 고정 및 분석 결과 격판덮개.
    2. 50% 무력화 titer를 결정
      1. 계산 하 여 50% 무력화 titer 비례 거리 '혈 청' 컨트롤의 50% 아래와 위의 상호 혈 청 희석 사이 우물 (긍정적인 바이러스 컨트롤-열 10, 행 E-H)를 결정 합니다.
      2. PFU (즉, 플 라크)의 수를 세어 혈 청 우물과 아무 혈 청 제어 우물에서 개별 바이러스 성 감염에서 발생. 없음 혈 청 제어 우물의 PFU의 평균 수를 계산 하 고 50% 값을 결정 합니다.
      3. 혈 청 희석 카운트는 바로 위와 아래 아무 혈 청 제어 우물의 50% 값을 식별 합니다. Using 세미 로그 그래프 또는 스프레드시트 서식 파일, 플롯 (선형 눈금) x 축 및 y 축 (로그10 규모)에 상호 혈 청 희석 PFU의 수 있습니다. 두 점 사이 선을 인출 하 고이 라인에서 혈 청 샘플 시험의 50% 무력화 titers를 읽고.
        참고: RSV PRN 분석 결과 워크시트 (워크시트 보충)는 50% 무력화 titer를 결정 하는 데 사용 됩니다.

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결과

바이러스 주식의 적정 1:10 1시 10분에서 수행한 PRN 분석 결과 (대표 결과 그림5) 전에 바이러스 재고 농도 결정 하기 위해8 희석. 그림 5, PFU 계산 될 수 있는 안정적으로 1:10 희석에4 와 1시 10분5. PFU에서 같은 희석 triplicate 우물에서의 평균 수를 계산 했다. 1 105 희석은 14에 관광 명소의 평균 수, 이?...

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토론

우리가 개발 하 고 최적화는 간단 하 고 효율적인 RSV 마이크로 중화 분석 결과 대부분 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 컴퓨터 이미지 검색을 사용 하 여 세포 수준에서 NAb 바이러스 성 감염의 억제를 측정 뿐만 아니라 바이러스 감염 능력을 측정할 수 있다. 이미징 기반 플랫폼 및 특정 항 체 기반 시스템을 사용 하 여 특이성 및 전통적인 패 감지 방법6,

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 모든 참가자를 참여 감사합니다. 우리는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램을 인정합니다. PVL은 NHMRC 경력 개발 장학금 받는 사람입니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

참고문헌

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