JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، تعزيز خميرة مختلطة واحدة فحص بروتوكول لتحديد عوامل النسخ (TFs) التي يمكن أن تربط إلى منطقة الحامض النووي البشري من الفائدة. هذا الأسلوب يستخدم خط أنابيب فرز الفائق الذي يمكن استجواب الربط > TFs 1,000 في تجربة واحدة.

Abstract

تحديد مجموعات عوامل النسخ (TFs) التي تنظم كل الجينات البشرية هو مهمة شاقة تتطلب إدماج العديد من النهج التجريبي والحسابية. أحد هذه الأساليب هو الإنزيم (Y1H) واحد-الهجين الخميرة، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام الجينات مراسل. فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (.على سبيل المثال، والمروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لتنشيط الجينات مراسل. وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لأداء شاشات Y1H تحويل مكتبات TF-فريسة أو صفائف إلى سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي. هنا، يمكننا وصف خط أنابيب، ودعا Y1H المحسن (eY1H) فحوصات، حيث استجوبه التفاعلات الحمض النووي TF تزاوج سلالات الطعم الحامض النووي مع مجموعة أراييد من سلالات فريسة TF استخدام صفيف عالية كثافة منصة الروبوتية (HDA) أن يسمح للفحص في 1,536 تنسيق مستعمرة. وهذا يسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية (60 تسلسل الحمض النووي-الطعم ضد > 1,000 TFs تستغرق أسبوعين كل باحث) وإمكانية تكرار نتائج. نحن توضيح أنواع مختلفة من النتائج المتوقعة عن طريق اختبار تسلسل المروج البشرية ضد صفيف TFs البشرية 1,086، فضلا عن أمثلة للمسائل التي يمكن أن تنشأ من خلال الشاشات وكيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها لهم.

Introduction

مشكلة مركزية في مجال الطب الحيوي هو تحديد الآليات التي تنظم كل الجينات البشرية. النسخ هو الخطوة الأولى في السيطرة على مستويات التعبير الجيني، وأنه يخضع لمجموعات من عوامل النسخ (TFs) التي تكون فريدة لكل الجينات. ونظرا لأن البشر ترميز > 1,500 TFs1،2، تحديد مجموعة كاملة من TFs التي تتحكم في التعبير عن كل الجينات لا يزال يشكل تحديا مفتوحاً.

يمكن استخدام نوعين من أساليب لخريطة التفاعلات الحمض النووي TF: أساليب محورها TF وتتمحور حول الحمض النووي3 (الشكل 1A). في أساليب محورها TF، يتم سبر TF الاهتمام لربط المجينية الحمض النووي المناطق أو تحديد خصوصيته ربط الحمض النووي. وتشمل هذه الأساليب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) متبوعاً بالتسلسل الفائق والبروتين ملزمة [ميكروارس] سيليكس4،،من56. في أساليب تتمحور حول الحمض النووي، هو سبر تسلسل الحمض النووي من الفائدة لتحديد مجموعة TFs ربط تسلسل الحمض النووي. على أوسع نطاق تطبيق هذه الأساليب هو الخميرة مختلطة واحدة فحوصات (Y1H)، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام مراسل الجينات7،،من89.

فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (مثلاً المروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لمراسل الجينات التنشيط9،10 (الشكل 1B). هو استنساخ الحمض النووي-الطعم المنبع مراسل اثنين تتكامل الجينات (لاكز و HIS3) وكل بنيات bait::reporter الحمض النووي في جينوم الخميرة لتوليد تشروماتينيزيد 'سلالات الطعم الحامض النووي'. يتم إدخال TF الفريسة، ترميز في بلازميد يعبر عن TF تنصهر إلى مجال التنشيط (AD) من الخميرة TF Gal4، في سلالة الحمض النووي-الطعم لصيد السمك للتفاعلات TF-الحمض النووي. إذا كان يربط TF-الفريسة لتسلسل الحمض النووي-الطعم، ثم الإعلان الحالي في TF-الفريسة سيؤدي إلى تفعيل كلا الجينات مراسل. نتيجة لذلك يمكن المحددة للنمو في اللوحات التي تفتقر إلى الحامض الأميني، فضلا عن التغلب على مثبط تنافسي، 3-أمينو-1,2,4-تريازولي (3-ات)، الخلايا مع تفاعل إيجابي وتصور كمستعمرات الأزرق حضور X-غال. لأن الخميرة قوية Gal4 يستخدم الإعلانية، وفحوصات Y1H يمكن الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على تفعيل النسخي، فضلا عن ريبريسورس. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن يتم التعبير عن TF يفترس من مروج خميرة قوية (ADH1)، ويمكن الكشف عن التفاعلات حتى بالنسبة TFs التي لديها مستويات منخفضة من التعبير الذاتية، التي تشكل تحديا للكشف عن طريق رقاقة11،12.

وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لإجراء فحوصات Y1H إدخال سلالات الحمض النووي-الطعم الخميرة يفترس TF بتحويل مكتبات فريسة TF المجمعة متبوعاً بالتحديد ومستعمرة الانتقاء والتسلسل لتحديد TF متفاعلة فيما بينها، أو تحويل كل استنساخ8،9. هذه هي بروتوكولات تستغرق وقتاً طويلاً، مما يحد من العدد تسلسل الحمض النووي التي يمكن أن يكون اختبار كل باحث. عزز تحسن الذي حدث مؤخرا لفحوصات Y1H، تسمى Y1H (eY1H)، زاد زيادة كبيرة الإنتاجية الفحص باستخدام منصة روبوتية صفيف (HDA) كثافة عالية لرفيقه سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي مع مجموعة من سلالات الخميرة كل التعبير عن مختلف TF-فريسة10،13 (الشكل 1). تستخدم هذه الشاشات تنسيق مستعمرة 1,536 السماح لاختبار TFs معظم البشرية في البيلوروسية استخدام لوحات ثلاثة فقط. علاوة على ذلك، ونظرا لأن اختبار الحمض النووي TF التفاعلات بطريقة عشوائية ويسمح هذا النهج بمقارنة التفاعلات بين الحمض النووي-الطعوم (مثل الخيارين فضله النوكليوتيدات واحدة) وبين TFs مختلفة أو TF متغيرات11،12 ،14.

استخدام فحوصات eY1H، نحن قد تتحدد بالإنسان أكبر و ايليجانس كاينورهابديتيس TF تتمحور حول الحمض النووي-DNA التفاعلات الشبكات إلى تاريخ. على وجه الخصوص، قمنا بتحديد 2,230 التفاعلات بين القدرة على التنمية البشرية 246 و 283 TFs12. علاوة على ذلك، لقد استخدمنا eY1H فحوصات للكشف عن تغيير الربط TF إلى 109 النوكليوتيدات واحدة فضله المتغيرات المرتبطة بالأمراض الوراثية مثل تشوه التنموية، والسرطان، والاضطرابات العصبية. في الآونة الأخيرة، كنا eY1H تحدد شبكة تتألف من 21,714 التفاعلات بين مروجي الجينات C. ايليجانس 2,576 و 366 TFs11. وكان هذه الشبكة مفيدة للكشف عن الدور الوظيفي لعشرات من TFs C. ايليجانس .

البروتوكولات لتوليد بقع الحمض النووي-الطعم وتقييم مستويات النشاط مراسل الخلفية قد ذكرت في مكان آخر من15،،من1617. وهنا يصف لنا خط أنابيب eY1H التي يمكن استخدامها لفحص أي منطقة الحمض النووي الجينوم البشري ضد مجموعة من 1,086 TFs البشرية. حالما يتم إنشاؤها من خميرة سلالة الحمض النووي-الطعم ورصدت مجموعة TF-فريسة على لوحات المقابلة، يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في الأسبوعين الماضيين (الجدول 1). الأهم من ذلك، يمكن أن باراليليزيد البروتوكول حيث أن باحث واحد يمكن أن الشاشة 60 تسلسل الحمض النووي-الطعم في وقت واحد. وللتدليل على البروتوكول، ونحن فحص المروجين لاثنين من الجينات سيتوكين CCL15 و IL17F. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض النتائج من شاشات الفاشلة لتوضيح أنواع المشاكل التي قد تنشأ عند إجراء فحوصات eY1H وكيفية استكشاف لهم.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

  1. اتفاقية استكهولم −U −H لوحات (أطباق بيتري 150 مم)
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي.
    1. حل ميكس التسرب، الخميرة قاعدة النيتروجين (YNB)، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 920 مل من الماء، ودرجة الحموضة إلى 5.9 مع هيدروكسيد الصوديوم م 5 (حوالي 1 مل لتر من وسائل الإعلام؛ انظر الجدول 2 لتكوين). صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
    2. في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
    3. اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
    4. فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي.
    5. إضافة لوسين والتربتوفان إلى وسائل الإعلام. خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في أطباق بيتري معقمة 150 مم (~ 80 مل في الطبق). الجافة لمدة 3 – 5 أيام في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. لوحات مستطيلة YAPD
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة الحشيش لسلالة الحمض النووي-الطعم والتزاوج مع مجموعة الصفيف TF.
    1. حل مساحيق (انظر الجدول 3 للتكوين)، باستثناء أجار، في 950 مل من الماء في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
    2. في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
    3. اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
    4. فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة.
    5. إضافة الجلوكوز، المزيج جيدا على لوحة ضجة وباردة إلى 55 درجة مئوية. صب وسائط الإعلام في لوحات مستطيلة الشكل (انظر الجدول للمواد؛ ~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجافة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      ملاحظة: على الرغم من أن حجم الوسائط المقترحة 70 مل للوحة الواحدة، يمكن استخدام 50 – 80 مل كل لوح. ثلاث مسائل حاسمة للنظر عندما تكون لوحات صب 1) أن تعادل بحيث يكون لوسائط الإعلام أجار نفس سمك في جميع أنحاء اللوحة (استخدام جدول تعادل أو سطح لصب صفيحة ولا تصب في أكوام من ألواح أكثر من سبعة) ، 2) التأكد من عدم وجود فقاعات في أجار وسائل الإعلام (فقاعات ينبغي أن برزت باستخدام إبرة معقمة)، و 3) التجفيف اللوحات ليوم واحد فقط، والتفاف اللوحات في أكياس من البلاستيك لتجنب الفشل في تثبيت الخميرة.
  3. −Trp اتفاقية استكهولم واتفاقية استكهولم −U −Trp لوحات مستطيلة
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة مجموعة الصفيف TF (Sc −Trp) وحدد الخميرة مثنوية بعد التزاوج (Sc −U −Trp).
    1. حل ميكس التسرب، YNB، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 920 مل من الماء، ودرجة الحموضة إلى 5.9 مع هيدروكسيد الصوديوم 5 متر (حوالي 1 مل لتر من وسائل الإعلام) (انظر الجدول 4 للتكوين). صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
    2. في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
    3. اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
    4. فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية.
    5. إضافة لوسين، الحامض الأميني واليوراسيل (تجاهل اليوراسيل لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم).
    6. خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في لوحات مستطيلة (~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجاف لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة والتفاف اللوحات في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة لمدة 3 أشهر.
  4. اتفاقية استكهولم −U −H −Trp + 3AT + X-غال لوحات مستطيلة
    ملاحظة:     ستستخدم هذه اللوحات كلوحات قراءات لفحوصات eY1H.
    1. حل ميكس التسرب، YNB، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 850 مل مياه (انظر الجدول 5 للتكوين). عدم الأس الهيدروجيني. صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
    2. في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 850 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
    3. اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
    4. إعداد 10 × بو الأملاح (1 لتر) عن طريق الجمع بين 900 مل من الماء و 70 غ غ2هبو4∙7H2س ز 34.5 NaH2بو4∙H2ميكس O. استخدام شريط إثارة حل المساحيق وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم م 5. إضافة الماء لكي 1 لتر والاوتوكلاف.
    5. إعداد الحل X-غال بإضافة 3.5 غم مسحوق X-غال إلى أنبوب بلاستيكي 50 مل تحتوي على 42.5 مل من ثنائي ميثيل ميثلامين. إضافة مسحوق X-غال إلى ثنائي ميثيل ميثلامين حل أكثر سهولة (وهذا يستغرق 30 دقيقة). يبقى الحل الأسهم في الظلام (غير شفاف 50 مل استخدام أنبوب أو غطاء في إحباط). مخزن في-20 درجة مئوية.
    6. فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز و 10 × بو الأملاح (انظر الجدول 5 للتكوين)، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية.
    7. إضافة لوسين، 3AT، والعاشر--غال (انظر الجدول 5 للتكوين).
    8. خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في لوحات مستطيلة (~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجافة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة المشمولة في رقائق الألومنيوم (3AT والعاشر--غال وحساسة للضوء) لمدة تصل إلى شهر واحد.

2-اكتشاف مجموعة TF

  1. ذوبان الجليد الصفيف فريسة TF
    1. ذوبان الجليد والغليسيرول الخميرة لوحات الأسهم مع الصفيف فريسة TF على الجليد.
      ملاحظة: يمكن إنشاء صفائف فريسة TF ك منشور مسبقاً10،،من1213،18.
    2. ريسوسبيند الخميرة استخدام ماصة 12-قناة حدود 1 – 3 دقيقة قبل الخطوة التالية.
  2. اكتشاف الخميرة في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
    1. في الروبوت HDA (انظر الجدول للمواد)، حدد لوحات 96 جيدا متعددة كمصدر، ولوحات أجار 96 كهدف، ومنصات دبوس طويل 96.
      ملاحظة: دبوس منصات ليست قابلة لإعادة الاستخدام، ويجب أن يتم تجاهل.
    2. حدد البرنامج تكرار العديد من جعل نسختين كل لوح 96-جيدا. عدم استخدام سلة المحذوفات، أو إعادة النظر في خيارات لتفادي التلوث مرة أخرى من الأرصدة المجمدة.
    3. حدد الخيار لدوامة صعودا وهبوطاً في المصدر إلى مزيج الخميرة.
    4. حقيبة الصفيف رصدت واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 2 – 3 أيام.
  3. توليد 384 مستعمرة صفائف في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
    1. في الروبوت، حدد 96 أجار لوحات كمصدر، 384 طبق أجار كهدف، ومنصات دبوس قصيرة 96.
    2. حدد البرنامج الصفيف 1:4 . وبهذه الطريقة، ستدمج مستعمرة 96 أربع لوحات (تحتوي كل منها على TF مختلفة) في لوحة واحدة 384 مستعمرة. عدم استخدام سلة المحذوفات، أو إعادة النظر في خيارات لتفادي التلوث بين لوحات مختلفة.
    3. حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 384-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
  4. إنشاء صفائف مستعمرة 1,536 في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
    ملاحظة: وهذا سيؤدي إلى المصفوفات التي تحتوي على أربع مستعمرات لكل TF-فريسة.
    1. في الروبوت، حدد 384 أجار لوحات كمصدر ولوحات 1,536 أجار كهدف 384 دبوس قصيرة منصات.
    2. حدد البرنامج المصدر واحد المقايسة 1:4. الهدف أن انسخ كل مستعمرة من المستعمرات الأربع للحصول على كوادروبليكاتيس. استخدام سلة المحذوفات وإعادة النظر في خيارات كما أنها تنطوي على نسخ أربع مرات كل مستعمرة.
    3. حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 1536-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  5. تضخيم الصفيف مستعمرة 1,536 في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
    1. في الروبوت، حدد 1,536 أجار لوحات كمصدر، ولوحات أجار 1,536 كهدف، ومنصات دبوس قصيرة 1,536.
    2. حدد البرنامج العديد من إجراء نسخ متماثل لتكرار نسخ 3 – 4. استخدام سلة المحذوفات وإعادة النظر في الخيار، ولكن التخلص من لوحة المفاتيح عند التبديل إلى لوحة مختلفة في الصفيف لتجنب التلوث المتبادل.
    3. حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 1536-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام لاستخدام للتزاوج الخطوات (انظر أدناه). وبعد ذلك، تبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة ونسخة مرة أخرى بعد 7 أيام لإجراء جولة جديدة من الفحص.

3-eY1H الشاشة

  1. إعداد الطعم الحامض النووي سلالة المروج للتزاوج
    1. بقعة الخميرة سلالات الطعم الحامض النووي على طبق −H −U اتفاقية استكهولم وتنمو لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية.
    2. متتالية الخميرة في 15 سم −U Sc −H لوحة استخدام مسواك عقيمة، حيث يناسب كل لوحة سلالات مختلفة 12 – 16. احتضان يوم واحد في 30 درجة مئوية.
    3. متتالية الخميرة في 15 سم −U Sc −H لوحة استخدام مسواك عقيمة، حيث يناسب كل لوح 4 سلالات مختلفة. احتضان لمدة يوم واحد في 30 درجة مئوية.
    4. تتخلص من الخميرة استخدام مسواك عقيمة، مع التأكد من عدم كشط أي أجار، وإضافة إلى أنبوب 1.5 مع 500 ميليلتر من الماء المعقم.
    5. إضافة 10 – 15 حبات زجاجية معقمة على صفيحة مستطيلة YAPD. أضف تعليق الخميرة على اللوحة ويهز جيدا في جميع الاتجاهات لمدة 1 دقيقة لضمان الخميرة وينتشر من خلال كل لوحة.
    6. عكس اللوحة فورا والاستفادة من ذلك الخرز الذهاب إلى الغطاء. إزالة وإعادة تدوير الخرز.
    7. حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب الأسفل لمدة 1 – 2 في 30 درجة مئوية. ثم انتقل إلى الخطوة التزاوج.
  2. التزاوج من الخميرة الحمض النووي-الطعم وسلالات الصفيف TF
    1. نقل الصفيف TF إلى صفيحة مستطيلة YAPD مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج العديد من النسخ المتماثل . يمكن استخدام كل لوحة الصفيف TF نقل إلى 3 – 4 لوحات YAPD (اعتماداً على عدد اللوحات في الصفيف). لوحات الصفيف TF المستخدمة للتزاوج يجب أن يكون 2-3 أيام ولكن ليس أكثر كالتزاوج قد تكون غير فعالة.
    2. نقل العشب من سلالة الطعم الحامض النووي إلى لوحات YAPD الفعل الذي يحتوي على صفيف TF مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج العديد من النسخ المتماثل . تستخدم إزاحة عشوائية في المصدر مع دائرة نصف قطرها مم ~0.6 لتجنب أخذ الخميرة من نفس المكان، وخلط في الهدف لتسهيل الاتصال بين سلالات الخميرة. استخدام العشب تحتوي على سلالات الطعم الحمض النووي (قسم 3.1) كمصدر، ولوحات YAPD الذي يحتوي على صفيف TF رصدت في خطوة 3.2.1 كهدف.
    3. حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
  3. اختيار الخميرة مثنوية
    1. نقل الخميرة تفعيل من لوحات YAPD إلى لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج النسخ المتماثل . مزيج في المصدر والهدف.
    2. حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 2 – 3 أيام (حضانة أطول يؤدي إلى نشاط مراسل خلفية عالية).
  4. نقل إلى لوحات قراءات
    1. نقل الخميرة مثنوية من لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم إلى قراءات لوحات مستطيلة Sc −U −H −Trp + 5 مم 3AT 0.4 مم X-غال استخدام الروبوت. حدد لوحات أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج النسخ المتماثل .
    2. حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
  5. تصوير لوحات قراءات
    1. لسلالات الطعم الحامض النووي مع خلفية عالية النشاط الصحافي، التقاط صور في أيام 2 و 3 و 4. وبخلاف ذلك، التقاط صور في أيام 4 و 7. التفاعلات الإيجابية هي المحددة باللون الأزرق ونمو المستعمرات الخميرة ويمكن تحديد يدوياً، أو يمكن تحديده باستخدام برمجيات تحليل الصورة.

النتائج

ينبغي النظر في العوامل الرئيسية الثلاثة عند تحليل النتائج من فحوصات eY1H: النشاط مراسل الخلفية من سلالة الطعم الحامض النووي، وقوام النشاط مراسل المقابلة للتفاعلات TF-الحمض النووي، وعدد المستعمرات الإيجابية. النشاط مراسل الخلفية (أي، أوتواكتيفيتي) من سلالة الطعم الحامض النووي تشير إلى النم?...

Discussion

EY1H الروبوتية التزاوج فحص النهج الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من سرعة النقل لتحديد المجموعة TFs التي تربط منطقة الحمض النووي من اهتمام، مقارنة بفحص المكتبة السابقة أو الفرز صفت النهج القائمة على التحول. علاوة على ذلك، التفاعلات الحمض النووي TF الكشف عنها بواسطة eY1H فحوصات يتم استنساخه بدرجة ع...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" [R35-GM128625 على J.I.F.B.].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLCSigmaA8056-100GCompetitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrateUS BiologicalsA0865Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological gradeAmerican International ChemicalAGHGUPNutritive media for yeast growth
Ammonium SulfateUS BiologicalsA1450Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose AnhydrousUS BiologicalsG3050Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen baseUS BiologicalsD9540-02Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH MeterHanna InstrumentsHI2020-01To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ctDiamondTo streak yeasts on petridishes
Glass BeadsWalter Stern100CTo spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99%Millipore SigmaG9012-1LRequired to make frozen yeast stocks
L-HistidineUS BiologicalsH5100For yeast growth selection in selective media
L-LeucineUS BiologicalsL2020-05For yeast growth selection in selective media
L-TryptophanSigmaT-0254For yeast growth selection in selective media
N,N-DimethylformamideSigma319937-1LTo make X-gal solution
Omnipense EliteWheatonW375030-AFor dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, BacteriologicalAmerican International ChemicalPEBAUPProtein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mmVWR10753-950For growing yeast baits for screening
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated IncubatorThermoFisher ScientificPR205745RTo incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 shortSinger InstrumentsREP-005To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 shortSinger InstrumentsREP-004To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 longSinger InstrumentsREP-001To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 shortSinger InstrumentsREP-002To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robotSinger InstrumentsFor transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)FisherS318-1For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrateSanta Cruz Biotechnologysc-203402CRequired for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrateSanta Cruz Biotechnologysc-202342BRequired for LacZ reporter activity on X-gal 
UracilSigmaU0750-100GFor yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast ExtractUS BiologicalsY2010Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS US BiologicalsY2030Required for vigorous yeast growth

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144 Y1H eY1H

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved