İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Özet

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.

Özet

Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,'. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.

Giriş

Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs^1,2, kalır açık bir meydan okuma.

İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri³ (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX^4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler^7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.

Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek^9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,'. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized 'DNA-yem suşları.' oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip^11,12' algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.

Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm^8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av^10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri^{11,12 ,14}.

EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs¹²2,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs¹¹arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.

Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde^15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.

Protokol

1. hazırlıkları

1. SC −U −H levha (150 mm Petri yemekler)
   Not: Bu tabakları DNA-yem maya suşları büyüyen için kullanılacaktır.
   1. Bırakma mix, Maya azot Bankası (YNB), adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 5 M NaOH (yaklaşık medya litre başına 1 mL; kompozisyon için bkz: Tablo 2 ) ile geçiyoruz. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
   2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
   3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
   4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de heyecan tabağa ve serin bir su banyosu içinde 55 ° c.
   5. Lösin ve triptofan ortamına Ekle. De heyecan tabağa mix ve 150 mm Steril Petri yemekler (çanak başına ~ 80 mL) içine dökün. 3-5 gün oda sıcaklığında, Kuru şal plastik torbalarda ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın.
2. YAPD dikdörtgen tabak
   Not: Bu tabakları DNA-yem zorlanma ve TF dizi koleksiyonu ile çiftleşme için çim büyüyen için kullanılacaktır.
   1. (Bkz Tablo 3 . kompozisyon için) tozlar, agar dışında 950 mL su 2 lt şişeye içinde dağıtılması ve heyecan çubuğu ekleme.
   2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
   3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
   4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün.
   5. Glikoz ekle mix de bir heyecan plaka ve serin ile 55 ° c Medya dikdörtgen kalıplara dökmek ( Tablo malzemelerigörmek; ~ 70 mL plaka başına) peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve depolamak için 6 aya kadar soğuk odasında.
      Not: Önerilen ortam birimi plaka başına 70 mL olsa da, 50-80 mL plaka başına kullanılabilir. Otelde 1 dökme tabaklara dikkate alınacak üç kritik konular) agar medya plaka boyunca aynı kalınlıkta olması onlar seviyelendirilir (plaka dökme için düzeltilmiş tablo veya yüzey kullanma ve yediden fazla tabak yığınlarda dökmek değil) 2) agar kabarcıkları yokluğu sağlamak için medya (balonlar attı bir steril iğne kullanarak) ve 3) tabakları sadece bir gün için kurutma ambalajlama ve tabakları Maya sabitleme içinde hatalarını önlemek için plastik torbalarda.
3. SC −Trp ve Sc −U −Trp dikdörtgen tabak
   Not: Bu tabakları TF dizi koleksiyon (Sc −Trp) büyüyen ve diploit Maya (Sc −U −Trp) çiftleşmeden sonra erkeğini seçmek için kullanılır.
   1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 NaOH 5 M (yaklaşık medya litre başına 1 mL) ile dağıtılması (bkz. kompozisyon için Tablo 4 ). Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
   2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
   3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
   4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
   5. (Sc −U −Trp plakalar urasil'ı atın) lösin, histidin ve urasil ekleyin.
   6. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. Oda sıcaklığında 1 günde kuru, tabakları plastik torbalarda kaydırmak ve Soğuk Oda 3 aya kadar saklayın.
4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal dikdörtgen levha
   Not: bu plaka okuma plakaları eY1H deneyleri için kullanılacaktır.
   1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 850 mL su içinde erimesi (bkz. kompozisyon için Tablo 5 ). Değil pH yapmak. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
   2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 850 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
   3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
   4. 10 BU tuzları (1 L) x 900 mL su, Na₂HPO₄∙7H₂O 70 g ve 34,5 g NaH₂PO₄∙H₂O. tozlar dağıtılması ve 7.0 kullanarak 5 M NaOH pH ayarlamak için bir heyecan çubuğunu kullanarak Mix birleştirerek hazırlayın. 1 L ve basınçlı kap getirmek için su ekleyin.
   5. X-gal çözüm bir 50 mL plastik tüp dimetil formamide 42,5 mL içeren 3.5 g X-gal tozu ekleyerek hazırlayın. X-gal toz daha kolay çözülmeye dimetil formamide ekleyin (Bu 30 dakika sürer). Hisse senedi çözüm (kullanım opak 50 ml tüp veya kapak folyo) anlatmamanı. -20 ° C'de mağaza
   6. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin ve 10 x (bkz. Tablo 5 kompozisyon için) BU tuzları, mix de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
   7. (Bkz. Tablo 5 kompozisyon için) lösin, 3AT ve X-gal ekleyin.
   8. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve alüminyum folyo kaplı soğuk odada depolamak (3AT ve X-gal ışığa duyarlı olan) en fazla 1 ay.

2. bir TF dizi lekelenme

1. TF-av dizi çözdürme
   1. TF-av dizi buz ile Maya gliserol hisse senedi plakalar çözülme.
      Not: Daha önce yayımlanmış^10,12,13,18TF-av diziler oluşturulabilir.
   2. Bir sonraki adım önce 1-3 dakika içinde 12 kanallı pipet kullanarak Maya resuspend.
2. Maya Sc −Trp dikdörtgen tabaklar lekelenme.
   1. HDA robot (bakınız Tablo malzemeler), select çok iyi 96 plakaları kaynak, hedef ve 96 uzun PIN altlığı olarak 96 ağar kaplamalar olarak.
      Not: PIN pad yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.
   2. 96-şey plaka başına iki kopya yapmak için Çoğaltmak birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanmayın veya dondurulmuş stoklarının arka kirlenmesini önlemek için seçenekleri tekrar.
   3. Yukarı ve aşağı Maya karışımı kaynağında girdap seçeneğini belirleyin.
   4. Benekli dizi çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2 – 3 gün kuluçkaya.
3. 384 koloni diziler Sc −Trp dikdörtgen levha üretme
   1. Robotun içine 96 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa PIN altlığı seçin.
   2. 1:4 dizi programı seçin. Bu şekilde, dört 96 koloni tabak (her bir farklı TF içeren) bir 384 koloni plaka konsolide edilecek. Geri dönüşüm kullanmayın veya seçenekleri farklı plakalar arasında kirlenmesini önlemek için tekrar.
   3. Tabakları çanta ve benekli 384-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C de 2 gün kuluçkaya.
4. Sc −Trp dikdörtgen levha 1.536 koloni diziler oluşturma
   Not: Bu dört kolonileri her TF avlarına içeren diziler sonuçlanır.
   1. Robotun içine 384 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 384 kısa PIN altlığı seçin.
   2. 1:4 tahlil tek kaynak programı seçin. Her koloni quadruplicates elde etmek için dört kolonileri kopyalamak için hedeftir. Geri dönüşüm kullanın ve işin içinde dört kez her koloni kopyalama seçenekleri tekrar.
   3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
5. Sc −Trp dikdörtgen tabaklar 1.536 koloni dizide yükseltecek
   1. Robotun içine 1.536 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 1.536 kısa PIN altlığı seçin.
   2. 3-4 kopya çoğaltmak için Çoğaltma birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanın ve seçeneği tekrar ama çapraz bulaşma kaçınmak için dizi farklı bir tabak için geçiş yaparken panelindeki atmak.
   3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı adımları (aşağıya bakın) çiftleşme için kullanmak 3 gün 30 ° C'de kuluçkaya. Bundan sonra tabakları oda sıcaklığında ve kopya tarama yeni bir turu için 7 gün sonra tekrar tutmak.

3. eY1H ekran

1. DNA-yem zorlanma çimenler çiftleşme için hazırlanıyor
   1. Maya DNA-yem suşları Sc −U −H plaka üzerinde spot ve 30 ° C'de 3 gündür büyümek
   2. Böylece her plaka 12-16 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün kuluçkaya
   3. Böylece her plaka 4 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün için kuluçkaya
   4. Değil herhangi bir agar raspa ve 500 µL steril su ile 1,5 bir tüp içine eklemek emin steril bir kürdan kullanarak Maya kazı.
   5. 10-15 steril cam boncuk YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya süspansiyon plaka üzerine ekleyin ve Maya kalenin yayılır emin olmak 1 dk her yöne iyice çalkalanır.
   6. Kalenin hemen ters çevir ve böylece boncuk kapak için dokunun. Kaldırmak ve boncuk geri dönüşüm.
   7. Tabakları çanta ve agar tarafı aşağı 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya Daha sonra çiftleşme adıma geçin.
2. Maya DNA-yem ve TF dizi suşları çiftleşme
   1. TF dizi YAPD dikdörtgen plaka robot ile aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Her TF dizi plaka 3-4 YAPD tabak (bağlı olarak dizi levha sayısı) aktarmak için kullanılabilir. Çiftleşme için kullanılan TF dizi tabak 2 – 3 gün eski olması gerekir ama çiftleşme olarak daha verimsiz olabilir.
   2. Bahçede büyük bir DNA-yem yük zaten içeren TF dizi robot YAPD plakaları aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Maya aynı noktadan almaktan kaçının için kaynak ~0.6 mm yarıçaplı rasgele sapmalarla kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak hedefte karıştırın. Kaynak ve hedef olarak 3.2.1. adımda benekli TF dizi içeren YAPD plakaları olarak DNA-yem suşları (Bölüm 3.1) içeren çim kullanın.
   3. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.
3. Diploit Maya yelpazesi
   1. Şeklindeki Maya YAPD plakaları ile robot Sc −U −Trp tabakaları bana aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin. Kaynak ve hedef karıştırın.
   2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2-3 gün (uzun kuluçka yüksek arka plan muhabir etkinliği için olur) için kuluçkaya.
4. Okuma plakaları için transfer
   1. Diploit Maya Sc −U −Trp plakalar aktarım okuma dikdörtgen tabaklar Sc −U −H −Trp + 5 mM 3AT + 0.4 mM X-gal robot kullanarak. 1.536 ağar kaplamalar kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin.
   2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C de 7 gün için kuluçkaya.
5. Okuma plakaların görüntüleme
   1. Yüksek arka plan muhabir etkinliği ile DNA-yem suşları için gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, 4 ve 7 gün fotoğraf çekmek. Olumlu etkileşimler mantar kolonileri büyüme ve mavi renk tarafından tanımlanır ve el ile belirlenebilir veya görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlenebilir.

Sonuçlar

Üç ana faktör ne zaman analiz eY1H deneyleri sonuçları düşünülmelidir: arka plan muhabir etkinliği DNA-yem baskı, TF-DNA etkileşimleri ve olumlu kolonileri sayısına karşılık gelen muhabir etkinlik gücünü. DNA-yem zorlanma arka plan muhabir etkinliği (örneğin, autoactivity) genel büyüme ve okuma plaka bir TF-av yokluğunda bile Maya kolonilerde rengini gösterir. İdeal olarak, bir arka plan beyaz veya açık kahverengi renk, Sigara autoactive suşları göstermek colonies olumlu etkileşimler iç...

Tartışmalar

Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90'ını aynı Maya DNA-yem zorlanma¹⁰ bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90'ı tespit deneyl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC	Sigma	A8056-100G	Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate	US Biologicals	A0865	Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade	American International Chemical	AGHGUP	Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate	US Biologicals	A1450	Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous	US Biologicals	G3050	Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base	US Biologicals	D9540-02	Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter	Hanna Instruments	HI2020-01	To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct	Diamond		To streak yeasts on petridishes
Glass Beads	Walter Stern	100C	To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99%	Millipore Sigma	G9012-1L	Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine	US Biologicals	H5100	For yeast growth selection in selective media
L-Leucine	US Biologicals	L2020-05	For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan	Sigma	T-0254	For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide	Sigma	319937-1L	To make X-gal solution
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological	American International Chemical	PEBAUP	Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm	VWR	10753-950	For growing yeast baits for screening
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator	ThermoFisher Scientific	PR205745R	To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short	Singer Instruments	REP-005	To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short	Singer Instruments	REP-004	To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long	Singer Instruments	REP-001	To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short	Singer Instruments	REP-002	To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot	Singer Instruments		For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)	Fisher	S318-1	For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	Required for LacZ reporter activity on X-gal
Sodium Phosphate monobasic monohydrate	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	Required for LacZ reporter activity on X-gal
Uracil	Sigma	U0750-100G	For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract	US Biologicals	Y2010	Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS	US Biologicals	Y2030	Required for vigorous yeast growth