Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التحدي المتمثل في البحث عن الصرع هو تطوير علاجات جديده للمرضي حيث العلاج الكلاسيكي غير كافيه. استخدام بروتوكول جديد-مع مساعده من نظام تسليم المخدرات القابلة للزرع-ونحن قادرون علي السيطرة علي المضبوطات في الفئران تخدير من قبل التسليم الكهربي من GABA في التركيز الصرع.

Abstract

الصرع هو مجموعه من الاضطرابات العصبية التي تصيب الملايين من الناس في جميع انحاء العالم. علي الرغم من ان العلاج مع الدواء مفيد في 70 ٪ من الحالات ، اثار جانبيه خطيره تؤثر علي نوعيه حياه المرضي. وعلاوة علي ذلك ، نسبه عاليه من مرضي الصرع هي مقاومه للادويه. في حالتهم ، جراحه المخ والأعصاب أو التحفيز العصبي ضرورية. ولذلك ، فان الهدف الرئيسي للبحوث الصرع هو اكتشاف العلاجات الجديدة التي هي اما قادره علي علاج الصرع دون اثار جانبيه أو منع المضبوطات المتكررة في المرضي المقاومين للادويه. وتوفر الهندسة العصبية نهجا جديده باستخدام استراتيجيات وتكنولوجيات مبتكره لإيجاد حلول أفضل لعلاج مرضي الصرع المعرضين للخطر.

كدليل علي البروتوكول التجريبي الجديد في نموذج ماوس حاد من الصرع ، يتم استخدام نظام توصيل الدواء الكهربي المباشر في الموقع. وهي, المسبار العصبية التي تتضمن مضخة أيون ميكروفلويدريك (Μفيب) لتسليم المخدرات عند الطلب والتسجيل المتزامن للنشاط العصبي المحلي مزروع وأظهرت ان تكون قادره علي السيطرة علي 4-aminopyridine-المستحثة (4AP-المستحثة) الاستيلاء مثل نشاط الحدث (SLE). يتم الاحتفاظ بتركيز حمض γ (GABA) في النطاق الفسيولوجي بالتحكم الدقيق في تسليم GABA للوصول إلى تاثير مضاد للصرع في تركيز النوبات ولكن ليس للتسبب في حدوث رشقات مرتده بسبب التثبيط المفرط. يسمح الأسلوب كلا من الكشف عن النشاط المرضي والتدخل لوقف المضبوطات عن طريق تقديم الناقلات العصبية المثبطة مباشره إلى تركيز الصرع مع التحكم المكاني الدقيق.

ونتيجة للتطورات التي طرات علي الطريقة التجريبية ، يمكن الحث علي SLEs بطريقه مترجمه للغاية تسمح بالسيطرة علي المضبوطات من خلال تسليم GABA مضبوط بدقه عند بداية النوبة.

Introduction

الصرع هو الاضطراب العصبي الرابع الأكثر شيوعا: حوالي 1 ٪ من السكان يعانون من الصرع ، وحوالي ثلث المصابين بنوبات متكررة. في معظم الحالات ، يمكن التحكم في النوبات بالادويه. ومع ذلك ، العلاج الدوائي يحتاج إلى تعيين لكل مريض علي حده ، حيث الجرعات المناسبة يمكن ان يستغرق سنوات للعثور علي1،2. بالاضافه إلى ذلك, معظم الدواء له اثار جانبيه خطيره التي تقلل من نوعيه الحياة3, 4,5,6,7. وأخيرا ، في 30 ٪ من الحالات المرضي مقاومه للادويه ، وفي حاله وجود مولد النوبات واحد ثابت ، فقط جراحه المخ والأعصاب المعدية يمكن ان تخفف من حدوث نوبات8. ولذلك ، فان المبادرة الرئيسية في أبحاث الصرع الحديثة هي اكتشاف استراتيجيات جديده يمكن ان تمنع النوبات المتكررة في المرضي المعرضين للخطر ، مع الحد من ضرورة العلاجات الدوائية القوية والجراحات الجراحية المعدية.

نوبات الصرع تحدث عندما يكون هناك خلل في الدوائر المثيرة والمثبطة اما في جميع انحاء الدماغ (الصرع المعمم) أو في جزء موضعي من الدماغ (الصرع البؤري), مثل ان الخلايا العصبية التفريغ بطريقه غير طبيعيه9 , 10 , 11. الادويه المضادة للصرع يمكن ان تعمل بطريقتين مختلفتين في الوقاية من المضبوطات: اما تقليل الاثاره أو تعزيز تثبيط12. علي وجه التحديد ، فانها يمكن اما تعديل النشاط الكهربائي للخلايا العصبية عن طريق التاثير علي قنوات أيون في غشاء الخلية13 أو القانون علي نقل المواد الكيميائية بين الخلايا العصبية عن طريق التاثير علي الناقل العصبي المثبط GABA أو مثير الغلوتامات في الاشتباكات العصبية14،15. بالنسبة لبعض الادويه ، فان طريقه العمل غير معروفه18. أيضا ، العلاجات الدوائية لها تاثير مستمر علي المرضي ولا يمكن التكيف مع ديناميات انتشار النوبات. ومن الناحية المثالية ، فان المخدرات مع أليات محدده للعمل تعمل علي عمليات الصرع الاساسيه. والعلاج الأمثل لا تلمس الدماغ البينية ولكن ستعمل علي الفور عندما يبدا النوبة النامية. وعلي النقيض من ذلك ، في جميع حالات الصرع ، يعني الدواء الآن العلاج المنهجي ، والتي تؤثر علي الدماغ كله والجسم كله من المريض9.

يمكن ان تظهر نوبات الصرع بعد سنوات عديده من الاهانه الاوليه مثل صدمه الدماغ. الفترة بين الاهانه الاوليه وحدوث النوبات العفوية الاولي تتميز باعاده تنظيمات جزيئيه وخلوية كبيره ، بما في ذلك موت الخلايا العصبية مع اختفاء اتصالات الشبكة العصبية و محواري sprouting/neosynaptogenesis مع ظهور اتصالات جديده19،20،21. وبمجرد ان تصبح المضبوطات متكررة ، يميل تواترها وشدتها إلى الزيادة ، بما يشمل مناطق أكثر من المخ. ومن المهم التمييز بين مواقع ظهور المضبوطات (المناطق الصرعة) من شبكات الانتشار ، حيث ان قواعد نشاه المضبوطات وانتشارها قد تختلف. وقد قدمت البحوث التي أجريت علي الانسجه البشرية والنماذج التجريبية من الصرع البيانات الهامه فيما يتعلق باعاده تنظيم الدوائر وقدرتها علي توليد المضبوطات20،21،22، 23-بيد انه من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه المنظمات هي ردود تكيف أو ما إذا كانت مرتبطة بالابيليبتوجينيسيس أو بنشاه المضبوطات والانتشار12.

ولذلك ، فان توطين تركيز الصرع وتطبيق الادويه المضادة للصرع محليا هي واحده من التحديات الرئيسية في أبحاث الصرع المعاصرة. العديد من التجارب باستخدام نماذج الحيوانية من الصرع وبعض الدراسات السريرية تهدف إلى العثور علي بداية الاحداث الاستيلاء وتحديد أليات الكامنة في الدماغ24,25,26,27. لهذا الغرض ، قمنا بتطوير بروتوكول تجريبي جديد باستخدام 4ap-الناجم عن الصرع نموذج28،29،30،31 في اعداد الماوس الحاد ، والذي يسمح بالادراج الدقيق لثلاثه الاجهزه في منطقه معينه من الحصين ، حيث يتم التلاعب بنشاط الشبكة في الجسم المجري بطريقه مترجمه للغاية. المترجمة 4AP حقن بواسطة ميكروماص الزجاج يساعد علي تحفيز SLEs الصرع في بقعه موضعيه في الحصين ، في حين مع مساعده من الرواية التي تستند إلى البوليمر Μفيب التحقيق السيطرة علي النشاط الاستيلاء يتحقق في وقت واحد عن طريق تسجيل الخلايا العصبية النشاط الكهربائي مع مواقع تسجيل الجهاز. ويرصد أيضا نشاط الحقل المحلي هيبوكامبال مع مسبار السيليكون متعدد القناات بطريقه محدده بطبقه في القشرة وفي الحصين في وقت واحد.

تعمل المجسات التي تم اختراعها مؤخرا باستخدام حقل كهربائي مطبق لدفع الادويه المشحونة المخزنة في قناه ميكروفلوريك عبر غشاء التبادل الأيوني (IEM) والي الانسجه المحيطة (الشكل 1). و IEM بشكل انتقائي ينقل نوع واحد فقط من أيون (الموجبة أو انيون) ، التالي ، يعمل علي الحد من انتشار السلبية في الدولة "قباله" ونقل الأنواع المشحونة معاكس من الانسجه المحيطة بها في الجهاز. يتم إنشاء الحقل الكهربائي علي الطلب عن طريق تطبيق الجهد الصغير (< 1 V) بين القطب المصدر الذي هو الداخلية إلى قناه ميكروفلويديك والقطب الهدف الذي هو خارجي للجهاز (في هذه الحالة ، المسمار الراس علي نموذج الحيوانية). معدل تسليم المخدرات يتناسب مع الجهد المطبق والتيار المقاسه بين المصدر والأقطاب المستهدفة. الدقة الدقيقة لتسليم المخدرات هي واحده من المزايا الرئيسية لل Μفيب. ميزه أخرى حرجه, بالمقارنة مع فلويديك أو الضغط القائم علي نظم إيصال المخدرات, هو انه في μفيب هناك فقط زيادة الضغط لا يكاد يذكر في منفذ تسليم المخدرات كما يتم تسليم الادويه عبر iem دون حل الناقل.

هناك كميه صغيره من تسرب السلبي من GABA عندما Μفيب هو "إيقاف", ولكن تم العثور علي هذا لا للتاثير SLEs. و Μفيب هي مخصصه الصنع التالية أساليب التصنيع المجهري التقليدية التي ذكرناها سابقا31.

وبما ان أحدي طرق منع النوبات المتكررة هي الحصار المفروض علي تصريف الشبكات في البداية أو حتى قبل الحدث الأول للمصادرة ، فان الطريقة المعروضة لتقديم الناقل العصبي المثبط GABA إلى تركيز الصرع لها عظيم المحتملة العلاجية للسيطرة علي المضبوطات في المرضي الذين يعانون من الصرع البؤري. منذ GABA هو الركيزة الذاتية, فانه يترك خصائص الخلايا العصبية المتاصله دون تغيير في تركيزات الفسيولوجية. التطبيق المحلي لمستويات منخفضه من GABA سوف تؤثر فقط علي الخلايا التي تستجيب بشكل طبيعي لتثبيط, وسوف يسبب فقط اثار مماثله لتثبيط الفسيولوجية, خلافا لتحفيز الدماغ العميق (بي بي اس), التي لديها إجراءات غير محدده من خلال تحفيز جميع الخلايا من الشبكة العصبية في بيئتها ، مما تسبب في استجابه مختلطة تنطوي علي كل من الاثاره وتثبيط. وفي الختام ، فان الطريقة المقترحة توفر نهجا أكثر تحديدا للسيطرة علي المضبوطات من الاداره العامة.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الاخلاقيه لمعهد الأعصاب الايكولوجيه ووافقت عليها اللجان الاخلاقيه المحلية والمكاتب البيطرية.

ملاحظه: سبعه عشر الذكور البالغين OF1 الفئران استخدمت لهذه التجارب. وكانت الفئران في الفخ إلى 12 ح دوره الضوء/الظلام مع الغذاء والماء المتاحة الإعلان libitum.

1. التخدير

  1. حقن خليط من الكيتامين و الزيازين (100 ملغم/كغم من وزن الجسم و 10 ملغم/كغم من وزن الجسم ، علي التوالي) لتخدير الحيواني.
  2. التحقق من مستوي التخدير عن طريق مراقبه معدل التنفس والخفق والتحقق من استجابه الماوس للألم.
    ملاحظه:     عندما يصبح التنفس الماوس العادية ، لا يمكن ملاحظه الخفق ، والحيوانية لا تتفاعل مع الذيل الصنوبر ، والتخدير هو عميق بما فيه الكفاية لمواصله.
    1. ضع الحيوانية علي لوحه تسخين قابله للبرمجة كهربائيا. غطي مسبار درجه حرارة المستقيم بمنتج قائم علي الهلام البترولي (انظر جدول المواد) وضعه برفق في المستقيم (1 – 2 سم) من الفاره لمراقبه درجه حرارة الجسم. الحفاظ علي درجه حرارة الجسم بين 36.5 و 37.5 درجه مئوية خلال العمليات الجراحية والتسجيلات التجريبية.
    2. مراقبه مستوي التخدير عن طريق التحقق من ردود الفعل الماوس ، والحركات الخفق ، وتواتر التنفس. مع الأخذ بعين الاعتبار مستوي التخدير المسجل علي الأقل كل 30 دقيقه ، إعطاء جرعه صغيره من كوكتيل الكيتامين-اكسيليازين (20-50 μL ، نفس التركيز المستخدمة كما كان من قبل) عضل.

2. جراحه/بضع القحف

  1. إصلاح راس الماوس في اطار فراغي. باستخدام ابره 30 ز ، حقن المحلية ropivacaine مسكن (5 μL ، 7.5 ملغ/مل ، انظر جدول المواد) جلد في موقع شق المخطط. السماح 5 دقيقه لأنها نافذه المفعول.
  2. جعل خط المنتصف قطع مستقيم في الجلد فوق الجمجمة مع مشرط. سحب بلطف الجلد نحو الجانبين مع ملقط غرامه والمشبك عليه جانبا مع المشابك المسننات المصلية لترك الجمجمة عرضه لمزيد من العمل.
  3. تنظيف الجمجمة من اللفافة مع مشرط أو اي أداه مماثله. في حاله النزيف السطحي ، قم بازاله الدم بمسحات قطنية أو قطع صغيره من منشفه ورقيه.
  4. اتخاذ بولي (3 ، 4-ايثينيدوكسيثويوفين) سلفونات البوليسترين (PEDOT: PSS)-المغلفة المسمار الأرض (الحجم: #00 ، والقطر: 0.047 في ، وطول: 1/8 in ، انظر جدول المواد) مع سلك ملحوم وتوصيله مع موصل إلى الصدارة مكبر للصوت.
  5. بلل الجمجمة في موقع الثقب المطلوب وحفر حفره بسرعة عاليه باستخدام قطعه الحفر الدائرية الدقيقة (بقطر 0.4 ملم) علي الجمجمة فوق المخيخ حتى تكون الجافية مرئية. وضع المسمار الأرض في حفره والمسمار في مع مفك البراغي الدقة حتى تصل إلى اعلي المخيخ.
    ملاحظه: وكان المسمار الراس تراجع المغلفة مع PEDOT: PSS الحل الذي يحتوي علي 1 ٪ 3-غليكسيديلوكسيبروبيل) trimethoxysilane (GOPS) بالوزن تليها الخبز في 140 درجه مئوية ل 90 دقيقه: PSS هو البوليمر مترافق مع السعه الحجمي التي من المعروف ان تكون حيوية. GOPS هو عبر رابط مختلطة مع PEDOT: PSS لزيادة الاستقرار في وسائل الاعلام المائية (الشكل 2).
  6. بمساعده الإطار الفراغي ، يمكنك قياس الإحداثيات الفراغية لمنطقه الدماغ المرغوبة. علي سبيل المثال ، فان منطقه الاهتمام هي الحصين ، انتيبيواوستريور (AP)-1.8 مم والمقابل (ML) 1.8 ملم من نقطه Bregma علي أساس أطلس الدماغ للفئران32.
    ملاحظه: هذه هي الإحداثيات لنصف الكره الأيمن (الشكل 2).
  7. رقيقه حوالي 1 إلى 2 ملم منطقه قطرها من الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة باستخدام الحفر الأسنان يمكن الاعتماد عليها (انظر جدول المواد) تعيين بسرعة كبيره حتى لا يزال رقيقه ، مصقول جيدا ، غشاء العظام شفافة.
  8. ثم ، إذا كان سمك غشاء العظم رقيقه بما فيه الكفاية (< 200 μm) ، وجعل ثقب صغير مع ملقط رقيقه وأزاله بلطف طبقه رقيقه من العظام33. استخدم الابره المدببة المصنوعة خصيصا لأزاله الجافية. قللي من حجم بضع القحف واستئصال البطن لمنع تطور المخ وتقليل نبضات القلب و/أو الجهاز التنفسي للدماغ.
    ملاحظه: يجب ملء بضع القحف مع قطره من محلول ملحي لمنع التجفيف ومن ثم تعبئتها بانتظام اثناء التجربة (الشكل 2).

3-إدخال مسبار السيليكون متعدد القناات

  1. استخدام الاسلحه المجسمة في زاوية AP طفيفه (20 درجه) لمسبار السيليكون لترك مساحة واسعه لتحديد المواقع من يزرع اثنين آخرين ويكون التسجيل ومواقع الحقن من القطب ، ومضخة أيون ، والماصات الدقيقة أقرب ما يمكن.
    ملاحظه: وغطيت الأقطاب الكهربائية والمحاقن والمضخات الايونيه بقطره من محلول صبغي (1, 1 '-ديوتاديكريل-3 ، 3 ، 3 ' ، 3 '-تيتراميثيلسيارسيبانسيسين بيركلورات [دي دي]) ، لتصور آخر مخصص لأثار الغرس (0.5 ملغم/مل).
  2. ضع مسبار السليكون علي الذراع الفراغي المرفق بحامل مغناطيسي ووضعه بجوار الإطار الفراغي. تعيين زاوية AP (20 درجه) ، ثم قم بتوصيل المسبار إلى المرحلة الراسية والي المسمار الأرض.
  3. خفض ببطء مسبار السيليكون في الحصين بمساعده الذراع الفراغية ميكرون دقيقه أو الجزئي الميكانيكية لتجنب الحركات الجانبية (الشكل 2 والشكل 3).
    1. البدء في تسجيل البرمجيات وسجل-مع الصدارة ، مكبر للصوت متصل ، وجهاز كمبيوتر-إشارات العصبية الكهربائية اثناء تحريك مسبار السيليكون متعددة القناات من اعلي القشرة حتى يتم التوصل إلى موقف البطنية المستهدفة (DV) (- 1,800 ميكرومتر من السطح القشري). تسجيل ومشاهده اشاره الحقل المحلي المحتملة (LFP) اثناء الاختراق علي شاشه الكمبيوتر.
      ملاحظه: السيطرة علي هبوط المسبار بحيث يتحرك ببطء وبشكل مستمر اثناء التسجيل ، ليكون أفضل السيطرة البصرية للاختراق والوصول إلى المنطقة المستهدفة.
    2. استخدام النشاط تموج في طبقه هرمية من تشكيل هيبوكامبال في LFP المسجلة كعلامة علي المنطقة المستهدفة.
      ملاحظه: النشاط تموج مرئية علي واحد أو اثنين من القناات المجاورة من السيليكون متعدد القناات (Si) التحقيق وجود مسافة 100 μm بين مواقع التسجيل (الشكل 4).
    3. تسجيل إشارات LFP من طبقات من القشرة والحصين في وقت واحد من خلال برنامج مكبر للصوت متعدد القناات (انظر جدول المواد) مع مساعده من القناات Si المتعددة (الشكل 4).

4. إدخال Μفيب

  1. ربط أنابيب (انظر جدول المواد) إلى مدخل μفيب وملء المسبار مع 0.05 M GABA الحل. أزاله الأنابيب وإغلاق مدخل مع التفاف الفيلم البارافين. توصيل الكهرباء يؤدي إلى وحده قياس المصدر.
  2. ادخل الجهاز بمساعده الذراع المجسمة بزاوية الوسيط (MP) (20 درجه)... ولا يزال المسبار Si مدرجا خلال العملية برمتها.
    ملاحظه: μفيب مرنه جدا وقد تستفيد من دعم فرشاه الطلاء صغيره ونظيفه للحفاظ علي التوالي حتى تصل إلى سطح الدماغ. بعد هذه الخطوة ، يمكن خفض Μفيب برفق مع الحركات المحورية.
  3. خفض Μفيب ببطء مع الحركات المحورية وعدم السماح لها ينحني اثناء المسار حتى تصل إلى الإحداثي البطني (DV) (-1,200 μm من السطح القشري).
    ملاحظه: في محاولة لوضع الجهازين (Μفيب والسيليكون المسبار) أقرب إلى بعضها البعض قدر الإمكان ، مع الأخذ في الاعتبار المسافة 300 μm من منفذ من غيض Μفيب.
    تحذير: تجنب اي مشاكل ميكانيكيه بين الاجهزه والموصلات الخاصة بهم اثناء الادراج (الشكل 2b و 3b الشكل).

5-اعداد أجهزه لاستقراء المضبوطات

  1. تغيير ابره معدنيه من حقنه (10 μL) (انظر جدول المواد). أزاله الجزء المعدني ابره القابضة ، ووضع وإصلاح الماصات الدقيقة (القطر الخارجي [OD]: 1.2 مم ، القطر الداخلي [ID]: 0.75 مم ، قطر الطرف: 20 – 50 ميكرومتر مع ± 0.5 سم من مستدق الساق) ، ثم استبدل عنصر الابره القابضة.
  2. ضعي الحقنه والماصة المجهرية المرفقة في زاوية 20 درجه لاتنوميديال (LM) لحقن 4AP (50 ملم في السائل النخاعي الاصطناعي [ACSF]).
    تحذير: لا تستخدم الابره المعدنية للحقن أو الماصات المجهرية بطرف أكبر من 50 μm.
  3. رسم 500 nL-1 μL من 50 mM 4AP مع مساعده من مضخة الحقن المجهري الألى.

6. إدخال الماصة الزجاجية المرفقة بحقنه لحقن 4AP

  1. خفض الماصات الزجاجية المرفقة بالحقنة إلى موضع DV الهدف (-1,500 μm) ، ثم حقن 250 nL من الحل 4AP (الشكل 2 والشكل 3). بدء التسجيل باستخدام برنامج التسجيل. مشاهده الشاشة والانتظار لأول ارتفاع انتيركتال تظهر.
  2. بدء التسليم GABA عن طريق μفيب علي الفور مع ظهور ارتفاع انتيركتال الاولي. تسليم GABA عن طريق تطبيق 1 V بين المصدر والهدف ل 100 s تليها 1 s قباله, ل 30 دورات. مع مساعده من تسجيل البرمجيات ، سجل لمده لا تقل عن 2 ساعة.
    ملاحظه: الكتلة الاجماليه من غابا تسليمها حول 1 نانومول (الشكل 5).
  3. في نهاية التجربة ، وأزاله بلطف المجسات المدرجة والمسمار الأرض ، وأزاله الحيوانية من المعدات الفراغية. وكانت الرحيم الحيوانية باستخدام جرعه زائده من المخدرات (ط. p. 100mg/kg pentobarbital). وأكدت الوفاة عن طريق الكف عن التنفس والدورة الدموية.

7. تقييم وضع يزرع

  1. بعد يوثانيزينج الحيوانية ، حقنت انه عبر القلب ، أولا مع 50 مل من المحلول الملحي ومن ثم مع 150 ml من محلول مثبت الجليد الباردة التي تحتوي علي 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1 M الفوسفات العازلة (PB)34.
    تحذير: PFA خطره ويجب التعامل معها بعناية.
  2. قطع الراس الحيوانية ، ومن ثم أزاله الجلد والعضلات من الأعلى والجانبين من الجمجمة. بدءا من ماغنوم ، وجعل الشقوق الجانبية في الجمجمة نحو الاذنين وشق منتصف الخط السهمي ، مع الحرص الشديد علي عدم الاضرار الدماغ. أزاله الجمجمة برفق مع الانتهازي العظام. أزاله الدماغ ، ومن ثم قطع كتله الانسجه من المنطقة من الفائدة (من نقطه Bregma ،-1 إلى-3 مم AP) مع مساعده من مصفوفة الدماغ (انظر جدول المواد).
  3. الغراء كتله الانسجه إلى صاحب العينة من الذبذبات ، ووضع الموقف في ذلك ، وتعيين الذبذبات إلى 40 μm سمك في حمام PB جعل المقاطع الاكليليه 40 μm.
  4. يغسل علي نطاق واسع مع 0.1 M PB. اتبع البروتوكول النسيجي لبروتين الحمضية الليفية الدليميه (GFAP) تلطيخ31.
  5. جبل المقاطع علي الشرائح وتغطيتها مع المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي 2-(4-أميدينوفينيل)-1H-اندول-6-كربوميميددين (DAPI) (انظر جدول المواد).

8. المجهر البؤري

  1. وضع الشرائح مع المقاطع الملونة الاكليليه تحت هدف 20x من المجهر البؤري. حدد المنطقة المستهدفة.
  2. اختيار الاثاره والانبعاثات الأمثل (exc/ems) تصفيه مجموعات للاصباغ علي النحو التالي: DAPI = 358/461 nm ، والندية = 551/569 nm ، و فلوريسئين (انظر جدول المواد) = 490/525 nm.
    ملاحظه: منذ تلطيخ يختلف في القسم ، ومجموعه مناسبه من الحد الأدنى والحد الأقصى من الاثاره والكشف يحتاج إلى تحديد لكل قسم ، حيث المناطق الأقل كثافة والأكثر كثافة علي حد سواء تظهر الانبعاثات.
  3. اختر المنطقة الأقل كثافة واضبط كثافة الليزر والكشف علي القيم العالية ، ثم تحقق من المناطق الأكثر كثافة ما إذا كانت هذه القيم تسبب التشبع الزائد للانبعاثات المكتشفة. إذا كان الأمر كذلك ، خفض القيم وأعاده التحقق منها مع المنطقة الأقل كثافة. كرر هذه الخطوات حتى الوصول إلى اعلي مستوي ممكن من الاكتشاف عند انخفاض معدلات التلطيخ والمستويات السليمة وليس المشبعة في المناطق الملونة للغاية. كرر هذه العملية لجميع الاصباغ.
  4. استخدام وظيفة المسح الضوئي البلاط من المجهر مع 512 x 512 بكسل لكل بلاطه للحصول علي نظره عامه كبيره من مواقع الادراج المسبار مع دقه كافيه للمعالجة بعد المخصصة.

النتائج

باستخدام الاجراء المعروض هنا مع نموذج الصرع 4AP في الفئران تخدير ، يمكن تحقيق السيطرة علي نوبات الصرع في التركيز الصرع. التوطين الدقيق للزراعة (الشكل 2) ساعد علي تسجيل هيبوكامبال المحلية إمكانات المجال (lfps ، الشكل 4) ، للحث علي المضبوطات هيبو...

Discussion

من خلال تطوير بروتوكول تجريبي جديد في نموذج ماوس حاد من الصرع ، يمكن السيطرة علي SLEs بنجاح مع مساعده من Μفيب مزروع في تركيز الصرع. بفضل قدرتها علي تقديم GABA مع الدقة الزمانيه والمكانية, تم التحكم في SLEs المستحثة 4AP في بداية المضبوطات. علاج الصرع ممكن نظريا إذا تم تحقيق السيطرة علي تصريف الشبكة ?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وتعترف C.M.P. بالتمويل المقدم من منحه من الباحثين الدوليين في ويتاكر يديرها معهد التعليم الدولي. وقد رعت A.K. ماري كوري IEF (No. 625372). وتعترف الA.W. بالتمويل المقدم من المجلس الأوروبي للبحوث في اطار برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار 2020 (الاتفاق الخاص بالمنح رقم 716867). وتعترف A.W. بالاضافه إلى ذلك بمبادرة التميز التي أطلقتها جامعه ايكس مرسيليا-A * MIDEX ، وهي برنامج فرنسي "إينفيستيسيمينتس d'Avenir". ويعترف المؤلفون بالدكتور ايلكي اوغوز ، والدكتور سيكا نال ، والدكتور فينسينزو كورستو ، والدكتورة ماري دوناهو ، والدكتور مارك فيرو ، وزسوفيا ماغلوسكي لمشاركتهم في مناقشات مثمرة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4APSigma275875
Alexa Fluor 488Abcamab15007
AmplifierNeuralynx, Montana, USADigital Lynx 4SX
AmplifierAmpliplexKJE-1001
Atlas Stereotaxique Allen Atlas978-0470054086
Borosilica glass pipetteSutterBF120-69-15
Brain MatrixWPI RBMA-200C
Bone trimmerFST16109-14
Confocal microscopeZeissLSM 510
ConnectorINSTECHSC20/15
Coton tigeMonoprixEMD 6107OD
Cover slipMenzel-Glass15747592
DiI Stain Thermo FisherD282
DMSOSigma11412-11
DrillFOREDOMK1070
ForcepsF.S.T.11412-11
GABASigmaA2129
GFAP Monoclonal AntibodyThermofisher53-9892-80
GOPSSigma440167-100M
Hamilton seringe Hamilton 80330
HeadscrewComponent SupplyTX00-2FH
Heating pad Harvard apparatus341446
Injection PumpWPI UMP3-3
KeithleyTektoronix216A
KetamineRenaudin5787419
Magnetic holderNarishigeGJ-1
MiceCharles River612
Motoric manipulatorScientifica, UKIVM
Na2HPO4Sigma255793
NaH2PO4Sigma7558807
NeuroTrace DiI ThermofisherN22880
Paper towelKIMBERLY CLARK7552000
PBSigmaP4417
PEDOT:PSSCLEVIOS81076212
PFAAcros Organic30525-89-4
Rectal temperature probeHarvard apparatus521591
Ropivacaine KABI1260216
SalineSigma7982
ScalpelF.S.TAUST R195806
Seringue BD Medical324826
Serrefine clampF.S.T18050-284 is recommended
Silicon probeNeuroNexus, Michigan, USAA2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frameStoelting51733U
Superfrost SlideThermoScientificJ38000AMNZ
TubingINSTECHLS20
Vaseline Laboratoire Gilbert3518646126611
Vectashield DAPIVector Laboratories, California, USAH-1200-10
Vibratome, Leica VT1200SLeica Microsystems1491200S001
Xylazine Bayer4007221032311

References

  1. Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
  2. Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
  3. Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
  4. Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
  5. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  6. Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
  7. Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
  8. Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
  9. Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
  10. Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
  11. Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
  12. Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  13. Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, (1989).
  14. Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
  15. Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
  16. Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
  17. Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
  18. Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
  19. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  20. Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
  21. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
  22. Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
  23. Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
  24. Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
  25. Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
  26. Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
  27. Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
  28. Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
  29. Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
  30. Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
  31. Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
  32. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , (2012).
  33. Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
  36. Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147 GABA 4 4AP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved