La entrega electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el enfoque epiléptico previene las convulsiones en ratones

Resumen

El reto de la investigación de la epilepsia es desarrollar tratamientos novedosos para los pacientes donde la terapia clásica es inadecuada. El uso de un nuevo protocolo — con la ayuda de un sistema de administración de fármacos implantables — somos capaces de controlar las convulsiones en ratones anestesiados por la entrega electroforética de GABA en el foco epiléptico.

Resumen

La epilepsia es un grupo de trastornos neurológicos que afecta a millones de personas en todo el mundo. Aunque el tratamiento con medicamentos es útil en el 70% de los casos, los efectos secundarios graves afectan la calidad de vida de los pacientes. Por otra parte, un alto porcentaje de pacientes epilépticos son farmacorresistentes; en su caso, se necesita neurocirugía o neuroestimulación. Por lo tanto, el objetivo principal de la investigación de la epilepsia es descubrir nuevas terapias que sean capaces de curar la epilepsia sin efectos secundarios o prevenir convulsiones recurrentes en pacientes farmacorresistentes. La neuroingeniería proporciona nuevos enfoques mediante el uso de nuevas estrategias y tecnologías para encontrar mejores soluciones para curar a los pacientes epilépticos en riesgo.

Como demostración de un novedoso protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de epilepsia, se utiliza un sistema de administración de fármacos electroforéticos directos in situ. Es decir, una sonda neuronal que incorpora una bomba de iones de microfluidos (μFIP) para la entrega de fármacos bajo demanda y la grabación simultánea de la actividad neuronal local se implanta y se demuestra que es capaz de controlar las convulsiones inducidas por 4-aminopyridina (inducida por 4AP) como actividad del evento (SLE). La concentración de ácido γ-aminobutírico (GABA) se mantiene en el rango fisiológico por el control preciso de la entrega de GABA para alcanzar un efecto antiepiléptico en el foco de convulsiones pero no causar explosiones de rebote inducida por sobreinhibición. El método permite tanto la detección de la actividad patológica como la intervención para detener las convulsiones mediante la entrega de neurotransmisores inhibitorios directamente al foco epiléptico con control espaciotemporal preciso.

Como resultado de los desarrollos para el método experimental, SLEs se puede inducir de una manera altamente localizada que permite el control de las convulsiones por la entrega de GABA afinado con precisión en el inicio de la convulsión.

Introducción

La epilepsia es el cuarto trastorno neurológico más común: alrededor del 1% de la población sufre de epilepsia, y alrededor de un tercio de los afectados presentan convulsiones recurrentes. En la mayoría de los casos, las convulsiones se pueden controlar con medicamentos. Sin embargo, el tratamiento farmacológico debe establecerse para cada paciente individualmente, donde la dosificación adecuada puede tomar años para encontrar^1,2. Además, la mayoría de los medicamentos tiene efectos secundarios graves que reducen la calidad de vida^3,4,5,6,7. Por último, en el 30% de los casos los pacientes son resistentes a la medicación, y en el caso de un locus único generador de convulsiones, sólo la neurocirugía resectiva puede atenuar la ocurrencia de convulsiones⁸. Por lo tanto, una iniciativa importante en la investigación de la epilepsia moderna es descubrir nuevas estrategias que pueden prevenir las convulsiones recurrentes en pacientes en riesgo, reduciendo la necesidad de terapias farmacológicas fuertes y cirugías resectivas invasivas.

Las convulsiones epilépticas ocurren cuando hay un desequilibrio dentro de los circuitos excitatorios e inhibitorios en todo el cerebro (epilepsia generalizada) o en una parte localizada del cerebro (epilepsia focal), de tal manera que las neuronas se descargan de forma anormal^{9 , 10 , 11}. los fármacos antiepilépticos pueden actuar de dos maneras diferentes en la prevención de convulsiones: disminución de la excitación o aumento de la inhibición¹². Específicamente, pueden o bien modificar la actividad eléctrica de las células neuronales afectando a los canales de iones en la membrana celular¹³ o actuar sobre la transmisión química entre las neuronas al afectar el neurotransmisor inhibitorio GABA o el excitatorio glutamato en las sinapsis^14,15. Para algunos medicamentos, el modo de acción es desconocido¹⁸. Además, los tratamientos farmacológico tienen un efecto continuo en los pacientes y no pueden adaptarse a la dinámica de prevalencia de las convulsiones. Idealmente, los fármacos con mecanismos específicos de acción actuarían sobre los procesos epilépticos subyacentes. Un tratamiento óptimo no tocaría el cerebro interictally pero actuaría inmediatamente cuando una convulsión empiece a desarrollarse. En contraste con eso, en todos los casos de epilepsia, la medicación ahora significa un tratamiento sistemático, afectando todo el cerebro y todo el cuerpo del paciente⁹.

Las convulsiones epilépticas pueden aparecer muchos años después del insulto inicial, como el trauma cerebral. El período entre el insulto inicial y la ocurrencia de las primeras convulsiones espontáneas se caracteriza por considerables reorganizaciones moleculares y celulares, incluyendo la muerte neuronal con la desaparición de las conexiones de red neuronal y axonal brotación/neosinaptogénesis con la aparición de nuevas conexiones^19,20,21. Una vez que las convulsiones se vuelven recurrentes, su frecuencia y severidad tienden a aumentar, involucrando más regiones cerebrales. Es importante distinguir los sitios de aparición de convulsiones (regiones epileptogénicas) de las redes de propagación, ya que las normas de la génesis y la propagación de las convulsiones pueden diferir. Las investigaciones realizadas sobre el tejido humano y los modelos experimentales de epilepsia han proporcionado datos importantes sobre la reorganización de los circuitos y su capacidad para generar convulsiones^{20,21,22, 23}. sin embargo, es difícil determinar si estas reorganizaciones son respuestas adaptativas o si están relacionadas causalmente con la epileptogénesis o el embargo Génesis y la propagación¹².

Por lo tanto, localizar el enfoque epiléptico y la aplicación de fármacos antiepilépticos localmente son uno de los principales desafíos en la investigación de la epilepsia contemporánea. Varios experimentos con modelos animales de epilepsia y algunos estudios clínicos apuntan a encontrar la aparición de los eventos convulsivos y definir los mecanismos subyacentes en el cerebro^24,25,26,27. Con este fin, desarrollamos un nuevo protocolo experimental utilizando el modelo de epilepsia inducida por 4AP²⁸,^29,30,31 en una preparación aguda del ratón, que permite la inserción precisa de tres dispositivos en el área dada del hipocampo, donde la actividad de la red in vivo se manipula de una manera altamente localizada. La inyección localizada de 4AP por una micropipeta de vidrio ayuda a inducir los SLEs epilépticos en un lugar localizado en el hipocampo, mientras que con la ayuda de la nueva sonda μFIP basada en polímeros, el control de la actividad convulsiva se logra simultáneamente registrando el actividad eléctrica con los sitios de grabación del dispositivo. La actividad de campo local hippocampal también se supervisa con una sonda de silicio multicanal de una manera específica de la capa en la corteza y en el hipocampo simultáneamente.

Las sondas μFIP recientemente inventadas funcionan mediante el uso de un campo eléctrico aplicado para empujar los fármacos cargados almacenados en un canal de microfluidos a través de una membrana de intercambio de iones (IEM) y hacia el tejido circundante (figura 1). El IEM transporta selectivamente sólo un tipo de iones (cationes o aniones) y, por lo tanto, trabaja para limitar la difusión pasiva en el estado "apagado" y el transporte de especies cargadas de forma opuesta del tejido circundante al dispositivo. El campo eléctrico se crea bajo demanda aplicando un pequeño voltaje (< 1 V) entre el electrodo de origen que es interno al canal de microfluidos y un electrodo de destino que es externo al dispositivo (en este caso, el tornillo de cabeza en el modelo animal). La tasa de entrega de fármacos es proporcional a la tensión aplicada y la corriente medida entre los electrodos de origen y de destino. La tunabilidad precisa de la administración de fármacos es una de las principales ventajas de la μFIP. Otra ventaja crítica, en comparación con los sistemas de administración de fármacos a base de fluidos o de presión, es que en el μFIP sólo hay un aumento de presión insignificante en la salida de suministro de fármacos, ya que los fármacos se entregan a través del IEM sin su solución portadora.

Hay una pequeña cantidad de fuga pasiva de GABA cuando el μFIP es "apagado", pero esto fue encontrado para no efecto SLEs. Los μFIP son hechos a medida siguiendo los métodos convencionales de microfabricación que hemos reportado anteriormente³¹.

Dado que una manera de prevenir las convulsiones recurrentes es el bloqueo de las descargas de la red en el principio o incluso antes del primer evento convulsivo, el método presentado para entregar el neurotransmisor inhibitorio GABA en el enfoque epiléptico tiene gran potencial terapéutico para el control de las convulsiones en pacientes con epilepsia focal. Puesto que el GABA es un sustrato endógeno, deja propiedades neuronales intrínsecas sin cambios en las concentraciones fisiológicas. La aplicación local de bajos niveles de GABA sólo afectará a las células naturalmente sensibles a la inhibición, y sólo causará efectos similares a la inhibición fisiológica, contrariamente a la estimulación cerebral profunda (DBS), que tiene acciones inespecíficas estimulando todas las células de la red neuronal en su entorno, causando una respuesta mixta que involucra tanto la excitación como la inhibición. En conclusión, el método propuesto proporciona un enfoque más específico para el control de las convulsiones que el DBS.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas del Institut de NEUROSCIENCES des Systèmes y aprobados por los comités éticos y las oficinas veterinarias locales.

Nota: Diecisiete ratones masculinos adultos of1 fueron utilizados para los experimentos. Ratones fueron atrapados a un 12 h ciclo de luz/oscuridad con alimentos y agua disponible ad libitum.

1. anestesia

1. Inyectar intraperitonealmente una mezcla de ketamina y xilazina (100 mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal, respectivamente) para anestesiar el animal.
2. Compruebe el nivel de anestesia observando la frecuencia respiratoria y batiando y comprobando la respuesta del ratón al dolor.
   Nota: cuando la respiración del ratón se vuelve regular, no se puede observar ningún batido, y el animal no reacciona a los pinzones de la cola, la anestesia es lo suficientemente profunda para continuar.
   1. Coloque el animal en una almohadilla térmica programable eléctricamente. Cubra la sonda de temperatura rectal con un producto a base de vaselina (ver tabla de materiales) y colóquelo suavemente en el recto (1 – 2 cm de profundidad) del ratón para monitorear su temperatura corporal. Mantener una temperatura corporal entre 36,5 y 37,5 ° c durante los procedimientos quirúrgicos y grabaciones experimentales.
   2. Controle el nivel de anestesia comprobando los reflejos del ratón, los movimientos de los bigotes y su frecuencia de respiración. Teniendo en cuenta el nivel de anestesia registrado al menos cada 30 minutos, dar una pequeña dosis de un cóctel de ketamina-xilazina (20 – 50 μL, la misma concentración utilizada como antes) por vía intramuscular.

2. cirugía/craneotomía

1. Fije la cabeza del ratón en un marco estereotaxico. Con una aguja de 30 G, inyectar la ropivacaína analgésica local (5 μL, 7,5 mg/mL, ver tabla de materiales) por vía subcutánea en el lugar de la incisión planificada. Permita 5 min para que surtan efecto.
2. Haz una línea media recta en la piel por encima del cráneo con un bisturí. Tire suavemente de la piel hacia los lados con fórceps finos y sujetar a un lado con pinzas de serrefine Bulldog para dejar el cráneo expuesto para más trabajo.
3. Limpie el cráneo de la fascia con un bisturí o cualquier otro instrumento similar. En caso de sangrado superficial, retire la sangre con hisopos de algodón o trozos pequeños de toalla de papel.
4. Tomar un poli (3,4-etilendiamoxitiofeno) sulfonato de poliestireno (PEDOT: PSS)-recubierto tornillo de tierra (tamaño: #00, diámetro: 0,047 in, longitud: 1/8 in, ver tabla de materiales) con un alambre soldado y conectarlo con un conector a la cabecera del amplificador.
5. Humedezca el cráneo en el sitio de perforación deseado y taladre un orificio a alta velocidad usando una broca fina redonda (con un diámetro de 0,4 mm) en el cráneo por encima del cerebelo hasta que la dura sea visible. Coloque el tornillo de tierra en el orificio y atornille con un destornillador de precisión hasta que llegue a la parte superior del cerebelo.
   Nota: El tornillo de cabeza estaba recubierto de DIP con un PEDOT: solución PSS que contiene 1% 3-glycidyloxypropil) trimethoxysilane (GOPS) por peso seguido de hornear a 140 ° c para 90 min. PEDOT: PSS es un polímero conjugada con una capacitancia volumétrica que se sabe que es biocompatible. GOPS es un enlazador cruzado mezclado con PEDOT: PSS para aumentar la estabilidad en medios acuosos (figura 2).
6. Con la ayuda del marco estereotaxico, mida las coordenadas estereotaxicas para la región cerebral deseada. Por ejemplo, la región de interés es el hipocampo, anteroposterior (AP)-1,8 mm y mediolateral (ML) 1,8 mm desde el punto bregma basado en el Atlas del cerebro para ratones³².
   Nota: Estas son las coordenadas para el hemisferio derecho (figura 2).
7. Delgada un área de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro del cráneo por encima de la región objetivo usando un taladro dental confiable (ver tabla de materiales) fijado a una velocidad rápida hasta que una membrana ósea delgada, bien pulida y transparente permanezca.
8. Luego, si el espesor de la membrana ósea es lo suficientemente delgado (< 200 μm), haga un pequeño orificio con fórceps finos y quite suavemente la capa delgada del hueso³³. Utilice una aguja con punta de gancho hecha a medida para quitar la duramadre. Minimice el tamaño de la craneotomía y la durectomía para prevenir el desarrollo de edemas y minimizar las pulsaciones cardíacas y/o respiratorias del cerebro.
   Nota: La craneotomía debe llenarse con una gota de solución salina para prevenir el secado y luego rellenarla regularmente durante el experimento (figura 2).

3. inserción de la sonda de silicio multicanal

1. Utilice brazos estereotaxicos en un ligero ángulo AP (20 °) para que la sonda de silicio deje un espacio amplio para el posicionamiento de los otros dos implantes y para que la grabación y los sitios de inyección del electrodo, la bomba de iones y la Micropipetas estén lo más cerca posible.
   Nota: Electrodos, jeringas, y bombas de iones fueron cubiertos con una gota de solución de mancha DiI (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 '-tetrametilindocarbocyanine perclorato [DiI]), para la visualización post hoc de las trazas de implantación (0,5 mg/ml DiI en dimetilsulfóxido).
2. Coloque la sonda de silicio en el brazo estereotaxico unido a un soporte magnético y colóquelo junto al marco estereotaxico. Fije el ángulo del AP (20 °), y después conecte la sonda con el headstage y con el tornillo de tierra.
3. Baje lentamente la sonda de silicio en el hipocampo con la ayuda del brazo estereotaxico micrón-preciso o un micromanipulador motorizado para evitar movimientos laterales (figura 2 y figura 3).
   1. Inicie el software de grabación y grabe — con la cabecera, el amplificador conectado y un ordenador — señales neuronales eléctricas mientras mueve la sonda de silicio multicanal desde la parte superior de la corteza hasta alcanzar la posición dorsoventral (DV) de destino (- 1.800 μm de la superficie cortical). Grabe y observe la señal potencial de campo local (LFP) durante la penetración en la pantalla del ordenador.
      Nota: Controle el descenso de la sonda para que se mueva lenta y continuamente durante la grabación, para tener un mejor control visual para la penetración y para alcanzar la zona objetivo.
   2. Utilice la actividad de ondulación en la capa piramidal de la formación del hipocampo en la LFP grabada como un marcador de la zona de destino.
      Nota: La actividad de ondulación es visible en uno o dos canales vecinos de la sonda de silicio multicanal (si) que tiene una distancia de 100 μm entre los sitios de grabación (figura 4).
   3. Registre las señales LFP de las capas de la corteza y el hipocampo simultáneamente a través del software del amplificador multicanal (ver tabla de materiales) con la ayuda de las sondas multicanal si (figura 4).

4. inserción de μFIP

1. Conecte los tubos (vea la tabla de materiales) a la entrada del μFIP y llene la sonda con la solución GABA 0,05 M. Retire los tubos y cierre la entrada con envoltura de película de parafina. Conecte los cables eléctricos a la unidad de medida de origen.
2. Inserte el μFIP con la ayuda del brazo estereotaxico en un ángulo mediolateral (MP) (20 °). La sonda si permanece insertada durante todo el proceso.
   Nota: μfip es muy flexible y puede beneficiarse del apoyo de un pincel pequeño y limpio para mantenerlo recto hasta que llegue a la superficie del cerebro. Después de ese paso, μFIP se puede bajar suavemente con movimientos axiales.
3. Baje el μFIP lentamente con movimientos axiales y nunca deje que se doble durante la trayectoria hasta que alcance la coordenada dorsoventral (DV) (-1.200 μm de la superficie cortical).
   Nota: Trate de poner los dos dispositivos (μFIP y sonda de silicio) tan cerca el uno del otro como sea posible, teniendo en cuenta la distancia de 300 μm de la salida de la punta μFIP.
   PRECAUCIÓN: Evite cualquier problema mecánico entre los dispositivos y sus conectores durante la inserción (figura 2B y figura 3B).

5. preparación de dispositivos para la inducción de convulsiones

1. Cambiar la aguja metálica de la jeringa (10 μL) (ver tabla de materiales). Retire la pieza metálica de sujeción de agujas, coloque y fije la micropipeta (diámetro exterior [OD]: 1,2 mm, diámetro interior [ID]: 0,75 mm, diámetro de la punta: 20 – 50 μm con ± 0,5 cm de la varilla del vástago) y, a continuación, sustituya el elemento de sujeción de agujas.
2. Colocar la jeringa y la micropidula de borosilicato adjunta a un ángulo de 20 ° lateromedial (LM) para la inyección de 4AP (50 mM en líquido cefalorraquídeo artificial [ACSF]).
   PRECAUCIÓN: No utilice la aguja metálica de la jeringa ni una micropila con una punta de más de 50 μm.
3. Dibuje 500 nL – 1 μL de 50 mM 4AP con la ayuda de una bomba de microinyección automatizada.

6. inserción de la Piera de vidrio unida a una jeringa para inyección de 4AP

1. Baje la Micropipetas de vidrio unida a la jeringa a la posición DV (-1.500 μm) y, a continuación, inyecte 250 nL de la solución 4AP (figura 2 y figura 3). Empiece a grabar con el software de grabación. Mire la pantalla y espere a que aparezca la primera espiga interictal.
2. Iniciar la entrega de GABA por μFIP inmediatamente con la aparición de la primera espiga interictal. Entregar GABA aplicando 1 V entre la fuente y el objetivo para 100 s seguido de 1 s apagado, para 30 ciclos. Con la ayuda del software de grabación, grabar por un mínimo de 2 h.
   Nota: La masa total del GABA entregado es alrededor de 1 nmol (figura 5).
3. Al final del experimento, quite suavemente las sondas insertadas y el tornillo de tierra, y retire el animal del equipo estereotaxico. Los animales fueron eutanizados usando una sobredosis de drogas (i. p. 100mg/kg pentobarbital). La muerte fue confirmada por el cese del aliento y la circulación.

7. evaluación de la colocación de los implantes

1. Después de la eutanasia del animal, perfumar transcardialmente, primero con 50 mL de suero salino y luego con 150 mL de una solución fijadora helada-fría que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) en 0,1 M de tampón de fosfato (PB)³⁴.
   PRECAUCIÓN: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.
2. Decapitar al animal, y luego remover la piel y el músculo de la parte superior y los lados del cráneo. A partir del foramen magnum, hacer incisiones laterales en el cráneo hacia las orejas y una incisión de la línea media sagital, teniendo mucho cuidado de no dañar el cerebro. Retire suavemente el cráneo con una recortadora ósea. Remover el cerebro, y luego cortar un bloque de tejido de la región de interés (desde el punto bregma,-1 a-3 mm AP) con la ayuda de una matriz cerebral (ver tabla de materiales).
3. Pegue el bloque de tejido en el soporte de la muestra de un vibratomo, coloque el soporte en él, y ajuste el vibratomo a 40 μm de espesor en un baño de PB hacer 40 μm secciones coronales.
4. Lavar extensamente con 0,1 M PB. Siga el protocolo histológico para la tinción de proteína ácida fibrilar gliales (GFAP)³¹.
5. Monte las secciones en las diapositivas y cúbralos con un soporte de montaje que contenga 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI) (ver tabla de materiales).

8. microscopía confocal

1. Coloque las diapositivas con las secciones coronales manchadas bajo un objetivo de 20x de un microscopio confocal. Seleccione la región de destino.
2. Elija los conjuntos de filtros óptimos de excitación y emisión (EXC/EMS) para los tintes de la siguiente manera: DAPI = 358/461 nm, DII = 551/569 nm, y fluoresceína (ver tabla de materiales) = 490/525 nm.
   Nota: Dado que la tinción varía según la sección, se debe determinar un rango adecuado de excitación y detección mínimas y máximas para cada sección, donde las regiones menos densas y más densas muestran la emisión.
3. Elija la región menos densa y establezca la intensidad y la detección del láser en valores altos y, a continuación, verifique en las regiones más densas si estos valores provocan una sobresaturación de la emisión detectada. Si es así, baje los valores y vuelva a revisarlos con la región menos densa. Repita estos pasos hasta llegar a la detección más alta posible con niveles de tinción bajos y niveles adecuados, no excesivamente saturados en áreas muy manchadas. Repita este proceso para todos los tintes.
4. Utilice la función de escaneo de azulejos del microscopio con 512 x 512 píxeles por azulejo para obtener una amplia visión general de los sitios de inserción de la sonda con una resolución adecuada para el procesamiento post hoc.

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí con un modelo de epilepsia 4AP en ratones anestesiados, el control de las convulsiones epilépticas se puede lograr en el enfoque epiléptico. La localización precisa de los implantes (figura 2) ayudó a registrar potenciales de campo local hipocampal (LFPs, figura 4), para inducir pequeñas convulsiones hipocampales y para entregar GABA en el inicio de la convulsión. La localizació...

Discusión

Mediante el desarrollo de un nuevo protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de la epilepsia, SLEs podría ser controlado con éxito con la ayuda de un μFIP implantado en el foco epiléptico. Gracias a su capacidad para entregar GABA con precisión temporal y espacial, SLEs inducida por 4AP fueron controlados en el inicio de las convulsiones. El tratamiento de la epilepsia es teóricamente posible si se logra el control de las descargas de la red neuronal en el lugar del inicio de la convulsión. El protocolo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311