Электрофоновая доставка γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) в эпилептический фокус предотвращает судороги у мышей

Резюме

Проблема эпилепсии исследования заключается в разработке новых методов лечения для пациентов, где классическая терапия является недостаточным. С помощью нового протокола-с помощью имплантируемой системы доставки лекарств-мы в состоянии контролировать припадки в обезболированных мышей электрофореотической доставки ГАМК в эпилептический фокус.

Аннотация

Эпилепсия представляет собой группу неврологических расстройств, которые затрагивают миллионы людей во всем мире. Хотя лечение с помощью лекарств полезно в 70% случаев, серьезные побочные эффекты влияют на качество жизни пациентов. Кроме того, высокий процент больных эпилепсией лекарственно устойчивы; в их случае необходима Нейрохирургия или нейростимуляция. Таким образом, основная цель исследований эпилепсии заключается в том, чтобы обнаружить новые методы лечения, которые либо способны лечить эпилепсией без побочных эффектов, либо предотвращать рецидивирующие припадки у лекарственно устойчивых пациентов. Нейроинженерия предоставляет новые подходы с помощью новых стратегий и технологий, чтобы найти лучшие решения для лечения эпилептических пациентов в опасности.

В качестве демонстрации романа экспериментальный протокол в острой мыши модель эпилепсии, прямой на месте электрофоореотической системы доставки наркотиков используется. А именно, нейронный зонд, включающий микрофлюидный ионный насос (Мкпоон) для доставки наркотиков по требованию и одновременной записи локальной нервной деятельности, имплантируется и демонстрируется, чтобы быть способным контролировать индуцированный 4-аминоопидин (4AP-индуцированный) захват мероприятия (СКВ). Концентрация γ-аминомасляная кислота (ГАМК) хранится в физиологическом диапазоне, точный контроль доставки ГАМК для достижения противоэпилептического эффекта в захвате фокус, но не вызывает гиперингибирование индуцированной отскок всплесков. Метод позволяет обнаруживать патологическую активность и вмешательство для прекращения судорог путем доставки тормозных нейромедиаторов непосредственно в эпилептический фокус с точным пространческим контролем.

В результате разработок в экспериментальном методе, SLEs могут быть вызваны в высоко локализованные образом, что позволяет захват контроля точно настроенной ГАМК доставка на начало захвата.

Введение

Эпилепсия является четвертым наиболее распространенным неврологическим расстройством: около 1% населения страдает эпилепсией, и около одной трети пострадавших имеют периодические припадки. В большинстве случаев, припадки могут контролироваться с помощью лекарств. Тем не менее, медикаментозного лечения необходимо установить для каждого пациента индивидуально, где надлежащее дозирование может занять годы, чтобы найти^1,2. Кроме того, большинство лекарств имеет серьезные побочные эффекты, которые снижают качество жизни^3,4,5,6,7. Наконец, в 30% случаев пациенты устойчивы к лекарствам, а в случае постоянного единственного захвата генератора локуса, только резсективная Нейрохирургия может смягчить возникновение судорог⁸. Таким образом, Главная инициатива в современных исследованиях эпилепсии заключается в том, чтобы обнаружить новые стратегии, которые могут предотвратить рецидивирующие припадки у пациентов, находящихся в опасности, при одновременном снижении необходимости сильного медикаментозного лечения и инвазивных ресективных операций.

Эпилептические припадки возникают, когда есть дисбаланс в возбуждающих и тормозных схем либо по всему мозгу (обобщенные эпилепсии) или в локализованной части головного мозга (координационных эпилепсии), такие, что нейроны разряда в ненормальной моды^{9 , 10 , 11}. противоэпилептические препараты могут действовать двумя различными способами в профилактике ареста: либо снижение возбуждения или усиление ингибирования¹². В частности, они могут либо изменить электрическую активность нейрональных клеток, влияя на ионные каналы в клеточной мембране¹³ или действовать на химическую передачу между нейронами, влияя на тормозящий НЕЙРОМЕДИАТОР ГАМК или возбуждающих Глутамат в синапсах^14,15. Для некоторых лекарств, режим действия неизвестен¹⁸. Кроме того, медикаментозного лечения оказывают непрерывное воздействие на пациентов и не может адаптироваться к распространенности динамики судорог. В идеале, препараты с конкретными механизмами действия будут действовать в зависимости от основных эпилептических процессов. Оптимальное лечение не коснется мозга interictally, но будет действовать сразу же, когда захват начинает развиваться. В отличие от этого, во всех случаях эпилепсии, лечение в настоящее время означает систематическое лечение, затрагивающих весь мозг и весь организм пациента⁹.

Эпилептические припадки могут появиться через много лет после первоначального оскорбления, такие как травма головного мозга. Период между первоначальным оскорблением и возникновением первых спонтанных изъятий характеризуется значительными молекулярными и клеточными реорганизациями, включая нейрональные смерти с исчезновением нейрональных сетевых соединений и аксональных Прорастание/неининтепатогенез с появлением новых соединений^19,20,21. Как только припадки становятся повторяющимися, их частота и тяжесть, как правило, увеличиваются, вовлекая больше областей мозга. Важно отличать места захвата начала (эпилептогенного зоны) от сетей распространения, по мере того как правила генезиса захвата и распространения могут отличать. Исследования, выполненные на ткани человека и экспериментальные модели эпилепсии предоставили важные данные о реорганизации схем и их способность генерировать припадки^{20,21,22, 23}. Однако трудно определить, являются ли эти реорганизации адаптивными реакциями или же они связаны с епилептоженесис или изъятием и распространением¹².

Таким образом, локализация эпилептического фокуса и применение противоэпилептических препаратов на местном уровне являются одной из основных проблем в современных исследованиях эпилепсии. Несколько экспериментов с использованием животных моделей эпилепсии и некоторых клинических исследований, направленных на поиск наступления событий захвата и определить основные механизмы в мозге^24,25,26,27. С этой целью, мы разработали новый экспериментальный протокол с использованием 4ap-индуцированной эпилепсии модель^28,29,30,31 в острой мыши подготовки, которая позволяет точную вставки из трех устройств в данной области гиппокампа, где сетевая активность в естественных условиях манипулируют в весьма локализованные образом. Локализованные инъекции 4AP на стеклянной микропипетке помогает индуцировать эпилептические SLEs в локализованной месте в гиппокампе, в то время как с помощью романа полимерных основе Мкмфпа контроля захвата деятельности достигается одновременно путем записи нейронов электрической активности с записью сайтов устройства. Гиппокампа местной деятельности поле также контролируется с помощью мультиканальной кремния зонд в слой-специфического образом в коре головного мозга и в гиппокампе одновременно.

Недавно изобретенные датчики Мкпоон работают с помощью прикладного электрического поля для толчка заряженных препаратов, хранящихся в микрофлюидодическом канале через ионный обмен мембраны (IEM) и наружу к окружающим тканям (рис. 1). IEM выборочно транспортирует только один тип Иона (катион или анион) и, таким образом, работает, чтобы ограничить как пассивную диффузию в "выключном" состоянии, так и транспортировку противоположно заряженных видов из окружающей ткани в устройство. Электрическое поле создается по требованию, применяя небольшое напряжение (< 1 V) между исходным электродом, который является внутренним к микрофлюидному каналу, и целевым электродом, который является внешним к устройству (в данном случае, головной винт на животной модели). Скорость доставки лекарственных средств пропорциональна прикладному напряжению и измеряемой текущей между источником и целевыми электродами. Точная возможность доставки лекарственных препаратов является одним из основных преимуществ Мкмфк. Еще одним важным преимуществом, по сравнению с fluiудической или давлением на основе системы доставки наркотиков, является то, что в мкмпоон есть только незначительное увеличение давления на выходе поставки наркотиков, как наркотики поставляются через IEM без их перевозчика решения.

Существует небольшое количество пассивной утечки ГАМК, когда Мкмфв является "выключен", но это было обнаружено не эффект SLEs. Мкмфв производится на заказ после обычных методов микроизготовления, которые мы сообщали ранее³¹.

Поскольку одним из способов предотвращения периодических изъятий является блокада сетевых разрядов в самом начале или даже до первого случая захвата, представленный метод для доставки тормозных нейромедиаторов ГАМК в эпилептический фокус имеет большое Терапевтический потенциал для контроля захвата у пациентов с очаговых эпилепсии. Так как ГАМК является эндогенного субстрата, он оставляет внутренние нейронные свойства без изменений в физиологических концентрациях. Местное применение низких уровней ГАМК будет только влиять на клетки естественно реагировать на ингибирование, и только вызвать аналогичные эффекты для физиологического ингибирования, в отличие от глубокой стимуляции мозга (ГСМ), который имеет неспецифичные действия, стимулируя все клетки нейронной сети в своей среде, вызывая неоднозначную реакцию с участием как возбуждение и ингибирование. В заключение, предлагаемый метод предусматривает более конкретный подход к контролю захвата, чем ГСМ.

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с этическими принципами Института нейробиологии и одобрены местными этическими комитетами и ветеринарными управлениям.

Примечание: Семнадцать взрослых мужчин OF1 мышей были использованы для экспериментов. Мышей были обучены 12 ч света/темный цикл с пищей и водой доступны ad libitum.

1. анестезия

1. Вводят интрапертально смесь кетамина и ксилазина (100 мг/кг массы тела и 10 мг/кг массы тела соответственно) для обезболиния животного.
2. Проверьте уровень анестезии, наблюдая частоту дыхания и взбивания и проверяя реакцию мыши на боль.
   Примечание: когда дыхание мыши становится регулярным, не взбивая можно наблюдать, и животное не реагирует на хвост щепотки, анестезия достаточно глубоко, чтобы продолжить.
   1. Поместите животное на электрически программируемый Нагревательный коврик. Обложка ректальной температуры зонд с вазелин на основе продукта (см. таблицу материалов) и поместить его осторожно в прямую кишку (1-2 см глубиной) мыши, чтобы контролировать его температуру тела. Поддержание температуры тела между 36,5 и 37,5 ° c во время хирургических процедур и экспериментальных записей.
   2. Контролируйте уровень анестезии, проверяя рефлексы мыши, движения усов и частоту дыхания. С учетом уровня анестезии, зафиксировала хотя бы каждые 30 мин, дают небольшую дозу кетамина-Ксилазина (20 – 50 мкл, такая же концентрация используется как и раньше) внутримышечно.

2. хирургия/Краниотомия

1. Закрепите головку мыши в стерео-такте. С помощью 30 G иглы, инъекционные местные болеутоляющее ропивакаин (5 мкл, 7,5 мг/мл, см. таблицу материалов) подкожно на запланированном месте разреза. Разрешить 5 минут для того, чтобы принять эффект.
2. Сделать прямую разрез средней линии в коже над черепом с помощью скальпеля. Осторожно потяните кожу в сторону с тонкой щипцами и зажимать ее в сторону с бульдогом serrefine зажимы оставить череп подвергается для дальнейшей работы.
3. Очистите череп фасции скальпелем или любым подобным инструментом. В случае поверхностного кровотечения, удалите кровь ватные тампоны или небольшие кусочки бумажного полотенца.
4. Возьмите поли (3, 4-этилендиокситиофен) полистирола сульфонат (PEDOT: ПСВ)-покрытием заземлением (размер: #00, диаметр: 0,047 в, длина: 1/8 в, см. таблицу материалов) с припаяны проволоки и подключить его с разъемом для усилителя headstage.
5. Смочите череп в нужном месте отверстия и просверлите отверстие на высокой скорости, используя штраф, круглый бур бит (с диаметром 0,4 мм) на черепе над мозжечком, пока твердая оболочка не видна. Положите землю винт в отверстие и винт в с точностью отвертки, пока не достигнет вершины мозжечка.
   Примечание: Головной винт был окутываться с PEDOT: раствор для поддержки, содержащий 1% 3-глиЦидилоксипропил) триметоксицилайн (GOPS) по весу с последующим выпечкой при температуре 140 ° с для 90 min. PEDOT: ПСВ является сопрягается полимер с объемной емкости, что, как известно, биосовместимостью. GOPS является кросс-Linker смешивается с PEDOT: СЗВ для повышения стабильности в сетях СМИ (рис. 2).
6. С помощью стерео-тактной рамы измеряйте стеретаксические координаты нужной области мозга. Например, область интереса гиппокампа, андонастерии (AP)-1,8 мм и медиолатеральная (ML) 1,8 мм от точки Брегма на основе атласа мозга для мышей³².
   Примечание: Это координаты правого полушария (рис. 2).
7. Тонкие примерно от 1 до 2 мм диаметр области черепа выше целевого региона с использованием надежного стоматологического дрель (см. таблицу материалов) установлен на быстрой скорости, пока тонкая, хорошо отполирована, прозрачная костная мембрана остается.
8. Затем, если толщина костной мембраны достаточно тонкая (< 200 мкм), сделайте маленькое отверстие с помощью тонких щипцов и аккуратно удалите тонкий слой кости³³. Использование пользовательских-сделал крюк наконечником иглы для удаления твердой оболочки. Свести к минимуму размер краниотомии и дуротомии, чтобы предотвратить развитие элизмы и свести к минимуму сердечную и/или дыхательную пульсацию головного мозга.
   Примечание: Краниотомия должна быть заполнена капелька физиологического раствора для предотвращения сушки, а затем регулярно пополнен во время эксперимента (рис. 2).

3. Вставка из мультиканальных кремниевых зонда

1. Использование стереоттаксического оружия в небольшом ракурсе AP (20 °) для кремниевого зонда, чтобы оставить достаточное пространство для позиционирования двух других имплантатов и иметь запись и места инъекции электрода, ионного насоса, и микропипетки как можно ближе.
   Примечание: Электроды, шприцы и ионные насосы были покрыты каплей раствора для окрашивания (1, 1 '-диоктадытил-3, 3, 3 ', 3 '-тетрамэтилиннокарбонианин перхлорат [дии]), для специальной визуализации следов имплантации (0,5 мг/мл в диметилсульфоксид).
2. Поместите кремниевый зонд на стереактаковую руку, прикрепленный к магнитному держателю, и поместите его рядом с стереактаксной рамкой. Установите угол AP (20 °), а затем подключите зонд к headstage и к наземным винтом.
3. Медленно опустите зонд кремния в гиппокамп с помощью микрон-точный стереактаковая рука или моторизованный микроманипулятор, чтобы избежать боковых движений (рис.2 и Рисунок 3).
   1. Инициировать запись программного обеспечения и записи-с headstage, подключенный усилитель, и компьютер-электрические сигналы нейронов при перемещении Мультиканальный кремния зонд из верхней части коры головного мозга, пока целевые дорсобрюшной (DV) положение достигается (- 1 800 мкм из корковой поверхности). Запись и смотреть локальный потенциал поля сигнала (LFP) во время проникновения на экране компьютера.
      Примечание: Управляйте спуском зонда так, чтобы он двигался медленно и непрерывно во время записи, чтобы иметь лучший визуальный контроль для проникновения и для достижения целевой зоны.
   2. Используйте пульсацию в пирамидальной прослойки образования гиппокампла в записанной LFP в качестве маркера целевой зоны.
      Примечание: Пульсация активность видна на одном или двух соседних каналах Мультиканальный кремний (Si) зонд, имеющий 100 мкм расстояние между местами записи (рис. 4).
   3. Записывать сигналы LFP из слоев коры и гиппокампа одновременно с помощью программного обеспечения мультиканальных усилителей (см. таблицу материалов) с помощью мультиканальных зондов (рис. 4).

4. Включение Мкмфв

1. Подключите трубы (см. таблицу материалов) на входе Мкмфм и заполнить зонд с 0,05 M ГАМК решение. Снимите трубы и закройте залив парафиновое обертывание пленкой. Подключение электрических приводит к исходной единицы измерения.
2. Вставьте Мкпоон с помощью стерепотаксической руки на медиолатеральной (MP) угол (20 °). Зонд Si остается вставленным в течение всего процесса.
   Примечание: мкпоон является очень гибким и может извлечь выгоду из поддержки малых и чистых кисть, чтобы держать его прямо, пока не достигнет поверхности мозга. После этого шага, Мкмфв может быть снижена мягко с осевой движений.
3. Медленно опустите Мкмфд с осевой движениями и никогда не позволяйте ему сгибаться во время траектории, пока она не достигнет координат дорсобрюшной (DV) (-1 200 мкм из корковой поверхности).
   Примечание: Попробуйте поместить два устройства (МКС и кремния зонда) как можно ближе друг к другу, как это возможно, с учетом 300 мкм расстояние от розетки до кончика Мкмфк.
   Осторожно: Избегайте механических проблем между устройствами и их разъемы во время вставки (Рисунок 2b и Рисунок 3b).

5. Подготовка приборов для индукции захвата

1. Изменение металлической иглы шприца (10 мкл) (см. таблицу материалов). Удалите иглу-удерживающуюся металлическую часть, поместите и зафиксируйте микропипетку (наружный диаметр [OD]: 1,2 мм, внутренний диаметр [ID]: 0,75 мм, диаметр наконечника: 20 – 50 мкм с ± 0,5 см сужающейся хвостовика), а затем замените иглу-удерживающийся элемент.
2. Положение шприца и прилагаемой боросиликационной микропипетки при температуре 20 ° лагомидиал (Л.М.) угол для инъекции 4AP (50 mM в искусственном спинномозговой жидкости [ACSF]).
   Осторожно: Не используйте металлическую иглу шприца или микропипетку с наконечником больше, чем 50 мкм.
3. Нарисуйте 500 БЛ ХЛ-1 мкл 50 мм 4AP с помощью автоматизированного микроинъекции насоса.

6. Вставка из стекла пипетки прилагается к шприца для инъекции 4AP

1. Опустите стеклянную микропипетку, прикрепленную к шприца, к позиции DV (-1 500 мкм), а затем впрыскивают 250 БЛ ХЛ решения 4AP (рис. 2 и Рисунок 3). Начало записи с программным обеспечением записи. Посмотрите на экран и подождите, пока появится первый межцикальный всплеск.
2. Начало доставки ГАМК по Мкмпоон сразу с появлением первого межцикитальный всплеск. Доставка ГАМК, применяя 1 V между источником и мишенью для 100 s следуют 1 s Off, для 30 циклов. С помощью программного обеспечения записи, запись в течение как минимум 2 ч.
   Примечание: Общая масса поставляемые ГАМК составляет около 1 нмоль (рис.5).
3. В конце эксперимента аккуратно удалите вставленные зонды и наземный винт и удалите животное из стереутакзческого оборудования. Животные были умерщвлены с помощью передозировки препарата (i. p. 100mg/kg Пентобарбитал). Смерть была подтверждена прекращением дыхания и циркуляции.

7. Оценка размещения имплантатов

1. После усыманиния животного, перметит его транскардиально, сначала с 50 мл физиологического раствора, а затем с 150 мл ледяно-холодного фиксационного раствора, содержащего 4% параформальдегид (дфа) в 0,1 м фосфорном буфере (ПБ)³⁴.
   Осторожно: Фа является опасной и с ней необходимо обращаться с осторожностью.
2. Обезглавить животное, а затем удалить кожу и мышцы сверху и по бокам черепа. Начиная от отверстия Магнум, сделайте боковые разрезы в черепе к ушам и разрез средней линии сагитталь, принимая большую заботу, чтобы не повредить мозг. Аккуратно удалите череп костным триммер. Удалить мозг, а затем вырезать блок ткани из области интересов (от точки Брегма,-1 до-3 мм AP) с помощью матрицы мозга (см. таблицу материалов).
3. Приклейте тканевой блок к держателю образца вибратомы, положите в него стенд, и установите вибратому к толщине 40 мкм в ванне ПБ сделать 40 мкм корональных секций.
4. Промыть экстенсивно с 0,1 м ПБ. Следуйте гистологический протокол для глиальных фибриллярных кислотных белков (ГФПД) окрашивание³¹.
5. Установите секции на слайдах и покройте их монтажных средств, содержащих 2-(4-амидинофенил)-1H-индол-6-carboxamidine (DAPI) (см. таблицу материалов).

8. конфокальная микроскопия

1. Поместите слайды с окрашенных корональных разделов под 20x цель конфокального микроскопа. Выберите область цели.
2. Выбрать оптимальное возбуждение и выбросы (EXC/EMS) наборы фильтров для красителей следующим образом: DAPI = 358/461 Нм, дии = 551/569 Нм, и флуоресцеин (см. таблицу материалов) = 490/525 Нм.
   Примечание: Так как окрашивание варьируется в зависимости от раздела, необходимо определить надлежащий диапазон минимального и максимального возбуждения и обнаружения для каждого раздела, где наименее плотные и наиболее плотные регионы показывают выбросы.
3. Выберите наименее плотная область и установите интенсивность и обнаружение лазера на высокие значения, а затем проверьте в самых плотных регионах, являются ли эти значения причиной перенасыщения обнаруженного излучения. Если это так, опустите значения и перепроверьте их с наименее плотной области. Повторять эти шаги, пока не прибудет в максимально возможной обнаружения при низком уровне окрашивания и надлежащего, не перенасыщенные уровни в сильно окрашенных областях. Повторите этот процесс для всех красителей.
4. Используйте функцию сканирования плитки микроскопа с 512 x 512 пикселей на плитку, чтобы получить большой обзор участков вставки зонда с адекватным разрешением для после специальной обработки.

Результаты

Используя процедуру, представленную здесь, с моделью эпилепсии 4AP у обезболированных мышей, контроль эпилептических припадков может быть достигнут в эпилептических фокус. Точная локализация имплантатов (рис.2) помогла записать гиппокампал локальных п...

Обсуждение

Разрабатывая новый экспериментальный протокол в острой мыши модели эпилепсии, SLEs может быть успешно контролируется с помощью Мкмфм имплантированных в эпилептический фокус. Благодаря своей способности поставлять ГАМК с временной и пространственной точностью, 4AP-индуцированные SLEs кон...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311