La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nella messa a fuoco epilettica previene le convulsioni nei topi

Riepilogo

La sfida della ricerca sull'epilessia è sviluppare nuovi trattamenti per i pazienti in cui la terapia classica è inadeguata. Utilizzando un nuovo protocollo — con l'aiuto di un sistema di somministrazione di farmaci impiantabili — siamo in grado di controllare le convulsioni in topi anestetizzati dalla consegna elettroforetica di GABA nella messa a fuoco epilettica.

Abstract

L'epilessia è un gruppo di disturbi neurologici che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. Anche se il trattamento con farmaci è utile nel 70% dei casi, gravi effetti collaterali influenzano la qualità della vita dei pazienti. Inoltre, un'alta percentuale di pazienti epilettici è resistente ai farmaci; nel loro caso, neurochirurgia o neurostimolazione sono necessari. Pertanto, l'obiettivo principale della ricerca sull'epilessia è quello di scoprire nuove terapie che sono in grado di curare l'epilessia senza effetti collaterali o prevenire le convulsioni ricorrenti in pazienti resistenti ai farmaci. NeuroEngineering fornisce nuovi approcci utilizzando nuove strategie e tecnologie per trovare soluzioni migliori per curare i pazienti epilettici a rischio.

Come dimostrazione di un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di epilessia del topo, viene utilizzato un sistema di somministrazione di farmaci elettroforetici diretto in situ. Vale a dire, una sonda neurale che incorpora una pompa a ioni microfluidica (μFIP) per la somministrazione di farmaci on-demand e la registrazione simultanea dell'attività neurale locale è impiantata e dimostrata in grado di controllare la crisi indotta da 4-aminopiridina (indotta da 4AP) l'attività dell'evento (SLE). La concentrazione di acido γ-aminobutirrico (GABA) è mantenuta nella gamma fisiologica dal controllo preciso della consegna di GABA per raggiungere un effetto antiepilettico nella messa a fuoco convulsiva, ma non causare esplosioni di rimbalzo indotta da iperinibizione. Il metodo consente sia il rilevamento di attività patologica e l'intervento per fermare le convulsioni, fornendo neurotrasmettitori inibitorio direttamente al focus epilettico con preciso controllo spaziotemporale.

Come risultato degli sviluppi al metodo sperimentale, SLEs possono essere indotti in un modo altamente localizzato che consente il controllo delle convulsioni dalla consegna di GABA precisamente sintonizzati all'inizio della crisi.

Introduzione

L'epilessia è il quarto disturbo neurologico più comune: circa l'1% della popolazione soffre di epilessia, e circa un terzo delle persone colpite ha convulsioni ricorrenti. Nella maggior parte dei casi, le convulsioni possono essere controllate con farmaci. Tuttavia, il trattamento farmacologico deve essere impostato per ogni paziente individualmente, dove il dosaggio corretto può richiedere anni per trovare^1,2. Inoltre, la maggior parte del farmaco ha gravi effetti collaterali che riducono la qualità della vita^3,4,5,6,7. Infine, nel 30% dei casi i pazienti sono resistenti ai farmaci, e nel caso di un singolo locus generatore di convulsioni costante, solo la neurochirurgia resettiva può attenuare il verificarsi di convulsioni⁸. Pertanto, una grande iniziativa nella ricerca moderna sull'epilessia è quella di scoprire nuove strategie che possono prevenire le convulsioni ricorrenti nei pazienti a rischio, riducendo al contempo la necessità di terapie farmacologiche forti e interventi chirurgici reinvettivi invasivi.

Crisi epilettiche si verificano quando c'è uno squilibrio all'interno di circuiti eccitatori e inibitorie sia in tutto il cervello (epilessia generalizzata) o in una parte localizzata del cervello (epilessia focale), tale che i neuroni scaricano in modo anormale^{9 , 10} il ^{, 11}. farmaci antiepilettici possono agire in due modi diversi nella prevenzione delle convulsioni: o diminuire l'eccitazione o migliorare l'inibizione¹². In particolare, possono modificare l'attività elettrica delle cellule neuronali influenzando i canali ionici nella membrana cellulare¹³ o agiscono sulla trasmissione chimica tra i neuroni influenzando il neurotrasmettitore inibitorio GABA o il eccitatorio glutammato nelle sinapsi^14,15. Per alcuni farmaci, la modalità di azione è sconosciuta¹⁸. Inoltre, i trattamenti farmacologici hanno un effetto continuo sui pazienti e non possono adattarsi alle dinamiche di prevalenza delle convulsioni. Idealmente, i farmaci con meccanismi di azione specifici agirebbero sui processi epilettici sottostanti. Un trattamento ottimale non toccherà il cervello Interictally ma avrebbe agito immediatamente quando un sequestro inizia a svilupparsi. A differenza di ciò, in tutti i casi di epilessia, il farmaco ora significa un trattamento sistematico, che colpisce tutto il cervello e tutto il corpo del paziente⁹.

Le convulsioni epilettiche possono comparire molti anni dopo l'insulto iniziale, come il trauma cerebrale. Il periodo tra l'insulto iniziale e il verificarsi delle prime convulsioni spontanee è caratterizzato da notevoli riorganizzazioni molecolari e cellulari, tra cui la morte neuronale con la scomparsa di connessioni di rete neuronale e assonale germogliare/neosinaptogenesi con la comparsa di nuove connessioni^19,20,21. Una volta che le convulsioni diventano ricorrenti, la loro frequenza e gravità tendono ad aumentare, coinvolgendo più regioni cerebrali. È importante distinguere i siti di insorgenza convulsiva (regioni epilettogene) dalle reti di propagazione, poiché le regole della Genesi e della propagazione delle convulsioni possono differire. La ricerca condotta sul tessuto umano e i modelli sperimentali di epilessia hanno fornito dati importanti riguardanti la riorganizzazione dei circuiti e la loro capacità di generare convulsioni²⁰,^{21,22, 23}. Tuttavia, è difficile determinare se queste riorganizzazioni siano risposte adattive o se siano causalmente correlate all'epilettitesi o alla genesi del sequestro e alla propagazione¹².

Pertanto, localizzare la messa a fuoco epilettica e l'applicazione di farmaci antiepilettici localmente sono una delle principali sfide nella ricerca dell'epilessia contemporanea. Diversi esperimenti che utilizzano modelli animali di epilessia e alcuni studi clinici miravano a trovare l'insorgenza degli eventi convulsivi e a definire i meccanismi di base nel cervello^24,25,26,27. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo sperimentale che utilizza l'epilessia indotta da 4AP modello^28,29,30,31 in una preparazione acuta del topo, che permette l'inserimento preciso di tre dispositivi nella zona data dell'ippocampo, dove l'attività di rete in vivo è manipolata in modo altamente localizzato. L'iniezione localizzata di 4AP da parte di una micropipetta di vetro aiuta a indurre gli SLEs epilettici in un punto localizzato nell'ippocampo, mentre con l'aiuto della nuova sonda μFIP a base polimerica il controllo dell'attività convulsiva si ottiene simultaneamente registrando il neuronale l'attività elettrica con i siti di registrazione del dispositivo. L'attività del campo locale hippocampal è monitorata anche con una sonda in silicio multicanale in modo specifico strato nella corteccia e nell'ippocampo simultaneamente.

Le sonde μFIP recentemente inventate funzionano utilizzando un campo elettrico applicato per spingere i farmaci caricati immagazzinati in un canale microfluidico attraverso una membrana di scambio ionico (IEM) e verso il tessuto circostante (Figura 1). L'IEM trasporta selettivamente solo un tipo di ione (catione o anione) e, quindi, lavora per limitare la diffusione passiva nello stato "spento" e il trasporto di specie cariche opacemente dal tessuto circostante nel dispositivo. Il campo elettrico viene creato su richiesta applicando una piccola tensione (< 1 V) tra l'elettrodo sorgente che è interno al canale microfluidico e un elettrodo target che è esterno al dispositivo (in questo caso, la vite a testa sul modello animale). Il tasso di erogazione del farmaco è proporzionale alla tensione applicata e alla corrente misurata tra gli elettrodi di origine e di destinazione. La precisa accordabilità della somministrazione di farmaci è uno dei principali vantaggi del μFIP. Un altro vantaggio critico, rispetto ai sistemi di erogazione di farmaci fluidici o basati sulla pressione, è che nel μFIP c'è solo un aumento di pressione trascurabile all'uscita di erogazione del farmaco poiché i farmaci vengono consegnati attraverso l'IEM senza la loro soluzione Carrier.

C'è una piccola quantità di perdite passive di GABA quando il μFIP è "spento", ma questo è stato trovato non per effetto SLEs. I μFIP sono fatti su misura seguendo i metodi di microfabbricazione convenzionali che abbiamo riferito in precedenza³¹.

Dal momento che un modo di prevenire le convulsioni ricorrenti è il blocco delle scariche di rete all'inizio o anche prima del primo evento convulsivo, il metodo presentato per la consegna del neurotrasmettitore inibitorio GABA nella messa a fuoco epilettica ha grande potenziale terapeutico per il controllo delle convulsioni in pazienti con epilessia focale. Dal momento che il GABA è un substrato endogeno, lascia proprietà neuronali intrinseche invariate in concentrazioni fisiologiche. L'applicazione locale di bassi livelli di GABA influenzerà solo le cellule naturalmente reattivo all'inibizione, e causerà solo effetti simili all'inibizione fisiologica, contrariamente alla stimolazione cerebrale profonda (DBS), che ha azioni non specifiche stimolando tutte le cellule della rete neuronale nel suo ambiente, causando una risposta mista che coinvolge sia l'eccitazione che l'inibizione. In conclusione, il metodo proposto fornisce un approccio più specifico al controllo delle convulsioni rispetto alla DBS.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida etiche dell'Institut de Neurosciences des Systèmes e approvate dai comitati etici locali e dagli uffici veterinari.

Nota: Diciassette topi maschi adulti OF1 sono stati utilizzati per gli esperimenti. I topi sono stati intrappolati in un ciclo di luce/buio di 12 ore con cibo e acqua disponibili ad libitum.

1. anestesia

1. Iniettare intraperitonealmente una miscela di chetamina e xylazina (100 mg/kg di peso corporeo e 10 mg/kg di peso corporeo, rispettivamente) per anestetizzare l'animale.
2. Controllare il livello di anestesia osservando la frequenza respiratoria e sbattere e controllando la risposta del mouse al dolore.
   Nota: quando la respirazione del mouse diventa regolare, non si può osservare alcun soffio, e l'animale non reagisce ai pizzicchi di coda, l'anestesia è abbastanza profonda per continuare.
   1. Collocare l'animale su un tampone riscaldante programmabile elettricamente. Coprire la sonda di temperatura rettale con un prodotto a base di gelatina di petrolio (vedere la tabella dei materiali) e posizionarla delicatamente nel retto (1 – 2 cm di profondità) del mouse per controllarne la temperatura corporea. Mantenere una temperatura corporea compresa tra 36,5 e 37,5 ° c durante le procedure chirurgiche e le registrazioni sperimentali.
   2. Monitorare il livello di anestesia controllando i riflessi del mouse, movimenti di baffi, e la sua frequenza di respirazione. Tenendo conto del livello di anestesia registrato almeno ogni 30 min, somministrare una piccola dose di un cocktail di chetamina-xylazina (20 – 50 μL, la stessa concentrazione usata come prima) per via intramuscolare.

2. chirurgia/craniotomia

1. Fissare la testa del mouse in una cornice stereotassica. Utilizzando un ago da 30 G, iniettare la ropivacaina analgesica locale (5 μL, 7,5 mg/mL, vedere la tabella dei materiali) per via sottocutanea nel sito di incisione pianificato. Consenti 5 min perché abbia effetto.
2. Fai una linea mediana tagliata dritta nella pelle sopra il cranio con un bisturi. Tirare delicatamente la pelle verso i lati con pinze sottili e fissarla da parte con i morsetti serraffico del bulldog per lasciare il cranio esposto per ulteriori lavori.
3. Pulire il cranio della fascia con un bisturi o uno strumento simile. In caso di sanguinamento superficiale, rimuovere il sangue con tamponi di cotone o piccoli pezzi di tovagliolo di carta.
4. Prendere un poli (3, 4-etilendiamossitofene) polistirene solfonato (PEDOT: PSS)-vite di terra rivestita (dimensioni: #00, diametro: 0,047 in, lunghezza: 1/8 in, Vedi tabella dei materiali) con un filo saldato e collegarlo con un connettore al headstage amplificatore.
5. Inumidire il cranio nella sede del foro desiderata e praticare un foro ad alta velocità utilizzando una punta di trapano rotonda fine (con un diametro di 0,4 mm) sul cranio sopra il cervelletto fino a quando la dura è visibile. Mettere la vite di terra nel foro e avvitarlo con un cacciavite di precisione fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto.
   Nota: La vite a testa è stata rivestita con un PEDOT: soluzione PSS contenente 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) in peso seguita da cottura a 140 ° c per 90 min. PEDOT: PSS è un polimero coniugato con una capacitanza volumetrica notoriamente biocompatibile. GOPS è un cross-linker mescolato con PEDOT: PSS per aumentare la stabilità dei mezzi acquosi (Figura 2).
6. Con l'aiuto del telaio stereotassico, misurare le coordinate stereotassiche per la regione del cervello desiderata. Ad esempio, la regione di interesse è l'ippocampo, antero-posteriore (AP)-1,8 mm e mediolaterale (ML) 1,8 mm dal punto bregma basato sull'atlante cerebrale per topi³².
   Nota: Queste sono le coordinate per l'emisfero destro (Figura 2).
7. Sottile un'area di circa 1 a 2 mm di diametro del cranio sopra la regione bersaglio utilizzando un trapano dentale affidabile (Vedi tabella dei materiali) impostato ad una velocità veloce fino a quando una membrana ossea sottile, ben lucidata e trasparente rimane.
8. Quindi, se lo spessore della membrana ossea è abbastanza sottile (< 200 μm), fare un piccolo foro con pinze sottili e rimuovere delicatamente lo strato sottile dell'osso³³. Utilizzare ago a punta hook su misura per rimuovere la dura. Minimizzare le dimensioni della craniotomia e della durotomia per prevenire lo sviluppo di edemi e minimizzare le pulsazioni cardiache e/o respiratorie del cervello.
   Nota: La craniotomia deve essere riempita con una gocciolina di soluzione salina per evitare l'essiccazione e poi regolarmente ricarizzata durante l'esperimento (Figura 2).

3. inserimento della sonda in silicio multicanale

1. Utilizzare bracci stereotassici in un lieve angolo AP (20 °) per la sonda in silicio per lasciare ampio spazio per il posizionamento degli altri due impianti e per avere la registrazione e i siti di iniezione dell'elettrodo, della pompa ionica e della micropipetta il più vicino possibile.
   Nota: Elettrodi, siringhe e pompe ioniche sono stati coperti con una goccia di soluzione DiI macchia (1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetrametillindocarbocianina perclorato [DiI]), per la visualizzazione post hoc delle tracce di impianto (0,5 mg/ml DiI in dimetilsolfossido).
2. Posizionare la sonda di silicio sul braccio stereotassico attaccato a un supporto magnetico e posizionarlo accanto al telaio stereotassico. Impostare l'angolo AP (20 °), quindi collegare la sonda allo stage e alla vite di massa.
3. Abbassare lentamente la sonda di silicio nell'ippocampo con l'aiuto del braccio stereotassico preciso del micron o di un micromanipolatore motorizzato per evitare movimenti laterali (Figura 2 e Figura 3).
   1. Avviare il software di registrazione e registrare — con lo stage, l'amplificatore collegato e un computer — segnali neuronali elettrici mentre si muove la sonda di silicio multicanale dalla parte superiore della corteccia fino a raggiungere la posizione di destinazione dorsoventrale (DV) (- 1.800 μm dalla superficie corticale). Registrare e guardare il segnale potenziale di campo locale (LFP) durante la penetrazione sullo schermo del computer.
      Nota: Controllare la discesa della sonda in modo che si muove lentamente e continuamente durante la registrazione, per avere un migliore controllo visivo per la penetrazione e per raggiungere la zona bersaglio.
   2. Utilizzare l'attività ondulata nello strato piramidale della formazione hippocampal nel LFP registrato come marcatore della zona bersaglio.
      Nota: L'attività ondulazione è visibile su uno o due canali adiacenti della sonda a silicio multicanale (si) avente una distanza di 100 μm tra i siti di registrazione (Figura 4).
   3. Registra i segnali LFP dagli strati della corteccia e dell'ippocampo simultaneamente attraverso il software dell'amplificatore multicanale (Vedi tabella dei materiali) con l'aiuto delle sonde si multicanale (Figura 4).

4. inserimento di μFIP

1. Collegare i tubi (vedere la tabella dei materiali) all'ingresso del μFIP e riempire la sonda con 0,05 soluzione di GABA M. Rimuovere i tubi e chiudere l'ingresso con involucro di pellicola di paraffina. Collegare i cavi elettrici all'unità di misura sorgente.
2. Inserire il μFIP con l'aiuto del braccio stereotassico ad un angolo di mediolaterale (MP) (20 °). La sonda si rimane inserita durante l'intero processo.
   Nota: μfip è molto flessibile e può trarre vantaggio dal supporto di un pennello piccolo e pulito per mantenerlo dritto fino a raggiungere la superficie cerebrale. Dopo questo passo, μFIP può essere abbassato delicatamente con movimenti assiali.
3. Abbassare lentamente il μFIP con movimenti assiali e non lasciarlo mai piegare durante la traiettoria fino a raggiungere la coordinata dorsoventrale (DV) (-1.200 μm dalla superficie corticale).
   Nota: Provate a mettere i due dispositivi (μFIP e sonda di silicio) il più vicino possibile, considerando la distanza di 300 μm della presa dalla punta μFIP.
   Attenzione: evitare eventuali problemi meccanici tra i dispositivi e i relativi connettori durante l'inserimento (Figura 2B e Figura 3B).

5. preparazione dei dispositivi per l'induzione convulsiva

1. Cambiare l'ago metallico della siringa (10 μL) (vedere tabella dei materiali). Rimuovere la parte metallica dell'ago, posizionare e fissare la micropipetta (diametro esterno [OD]: 1,2 mm, diametro interno [ID]: 0,75 mm, diametro punta: 20 – 50 μm con ± 0,5 cm di tapering del gambo), quindi sostituire l'elemento di fissaggio dell'ago.
2. Posizionare la siringa e la micropipetta borosilicato allegata ad un angolo di 20 ° lateromediale (LM) per l'iniezione di 4AP (50 mM nel liquido cerebrospinale artificiale [ACSF]).
   Attenzione: Non utilizzare l'ago metallico della siringa o una micropipetta con una punta superiore a 50 μm.
3. Disegnare 500 nL – 1 μL di 50 mM 4AP con l'ausilio di una pompa di microiniezione automatizzata.

6. inserimento della pipetta di vetro attaccata ad una siringa per iniezione 4AP

1. Abbassare la micropipetta di vetro attaccata alla siringa alla posizione DV mirata (-1.500 μm), quindi iniettare 250 nL della soluzione 4AP (Figura 2 e Figura 3). Avviare la registrazione con il software di registrazione. Guarda lo schermo e attendi che venga visualizzato il primo picco interictale.
2. Avviare la consegna di GABA da μFIP immediatamente con l'aspetto del primo picco interictale. Consegnare GABA applicando 1 V tra sorgente e bersaglio per 100 s seguiti da 1 s off, per 30 cicli. Con l'aiuto del software di registrazione, registrare per un minimo di 2 h.
   Nota: La massa totale del GABA consegnato è di circa 1 nmol (Figura 5).
3. Alla fine dell'esperimento, rimuovere delicatamente le sonde inserite e la vite di terra, e rimuovere l'animale dall'apparecchiatura stereotassica. Gli animali sono stati eutanizzati utilizzando un sovradosaggio di farmaco (i. p. 100mg/kg pentobarbital). La morte fu confermata dalla cessazione del respiro e dalla circolazione.

7. valutazione del posizionamento degli impianti

1. Dopo l'eutanizzazione dell'animale, profumi esso transcardially, prima con 50 ml di soluzione salina e poi con 150 ml di un ghiaccio-freddo soluzioni fissative contenenti 4% paraformaldeide (PFA) in 0,1 M fosfato tampone (PB)³⁴.
   Attenzione: PFA è pericoloso e deve essere manipolato con cautela.
2. Decapitate l'animale, quindi rimuovete la pelle e il muscolo dalla parte superiore e dai lati del cranio. Partendo dal foramen magnum, fare incisioni laterali nel cranio verso le orecchie e un'incisione di linea mediana sagittale, facendo molta attenzione a non danneggiare il cervello. Rimuovere delicatamente il cranio con un trimmer osseo. Rimuovere il cervello, e poi tagliare un blocco di tessuto dalla regione di interesse (dal punto bregma,-1 a-3 mm AP) con l'aiuto di una matrice cerebrale (Vedi tabella dei materiali).
3. Incollare il blocco di tessuto al supporto del campione di un VIBRATOME, mettere il supporto in esso, e impostare il VIBRATOME a 40 μm di spessore in un bagno PB fare 40 μm sezioni coronali.
4. Lavare abbondantemente con 0,1 M PB. Seguire il protocollo istologico per la colorazione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP)³¹.
5. Montare le sezioni sulle diapositive e coprirle con un supporto di montaggio contenente 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carbossilina (DAPI) (vedere tabella dei materiali).

8. microscopia confocale

1. Posizionare le diapositive con le sezioni coronali macchiate sotto un obiettivo 20x di un microscopio confocale. Selezionare l'area di destinazione.
2. Scegliere i set di filtri di eccitazione e di emissione (EXC/EMS) ottimali per i coloranti come segue: DAPI = 358/461 Nm, DiI = 551/569 Nm, e fluoresceina (Vedi tabella dei materiali) = 490/525 nm.
   Nota: Poiché la colorazione varia per sezione, una corretta gamma di eccitazione e rilevazione minima e massima deve essere determinata per ogni sezione, dove le regioni meno dense e più dense mostrano entrambe le emissioni.
3. Scegliere la regione meno densa e impostare l'intensità e il rilevamento del laser su valori elevati, quindi verificare nelle regioni più dense se questi valori causano la sovrasaturazione dell'emissione rilevata. In tal caso, abbassare i valori e ricontrollarli con la regione meno densa. Iterare questi passaggi fino ad arrivare al rilevamento più alto possibile a livelli di colorazione Bassi e livelli appropriati, non troppo saturi in aree altamente macchiate. Ripetere questo processo per tutti i coloranti.
4. Utilizzare la funzione di scansione delle piastrelle del microscopio con 512 x 512 pixel per piastrella per ottenere una panoramica ampia dei siti di inserimento della sonda con una risoluzione adeguata per l'elaborazione post-hoc.

Risultati

Utilizzando la procedura presentata qui con un modello di epilessia 4AP in topi anestetizzati, il controllo delle crisi epilettiche può essere raggiunto nel focus epilettico. La localizzazione precisa degli impianti (Figura 2) ha contribuito a registrare potenziali di campo hippocampal locale (lfps, Figura 4), per indurre piccole convulsioni ippocampali e per fornire GABA all'inizio della crisi. La localizzazione degli impianti ...

Discussione

Sviluppando un nuovo protocollo sperimentale in un modello acuto di topo di epilessia, le SLEs potrebbero essere controllate con successo con l'aiuto di un μFIP impiantato nel focus epilettico. Grazie alla sua capacità di fornire GABA con precisione temporale e spaziale, le SLEs indotta da 4AP sono state controllate all'inizio delle convulsioni. Il trattamento dell'epilessia è teoricamente possibile se il controllo delle scariche di rete neurale viene raggiunto nel luogo dell'inizio della crisi. Il protocollo presenta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311