JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التنفس المتقدرية أمر حاسم لبقاء العضوي؛ ولذلك، معدل استهلاك الأوكسجين مؤشرا ممتازا للصحة المتقدرية. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف استخدام ريسبيروميتير المتاحة تجارياً لقياس القاعدية ومعدلات استهلاك الأوكسجين القصوى في العيش، سليمة، وبحرية متحركة ايليجانس كاينورهابديتيس.

Abstract

الوظيفة المتقدرية الأمثل حاسم بالنسبة للنشاط الخلوي صحية، خاصة في الخلايا التي تحتوي على متطلبات الطاقة العالية مثل تلك الموجودة في الجهاز العصبي والعضلات. يتفق مع هذا، ارتبط خلل mitochondrial بعدد وافر من أمراض الأعصاب والشيخوخة بشكل عام. وقد ايليجانس كاينورهابديتيس نظام نموذجي قوية لتوضيح تعقيدات كثيرة للوظيفة المتقدرية. التنفس المتقدرية يعد مؤشرا قويا للوظيفة المتقدرية ووضعت مؤخرا ريسبيروميتيرس منهاجا الدولة للفنون لقياس التنفس في الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تقنية لتحليل سليمة، والعيش C. ايليجانس. هذا البروتوكول يمتد لفترة ~ 7 أيام ويتضمن خطوات لتنمو وتزامن C. ايليجانس، (2) إعداد المركبات بالحقن وترطيب المسابير، (3) المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة، (4) إعداد المقايسة دودة (1) لوحة والمقايسة تشغيل، وتحليل البيانات بعد التجربة (5).

Introduction

وتنتج الإنزيمات في سلسلة نقل الإلكترون (إلخ) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، المصدر الرئيسي للطاقة الخلوية، في الميتوكوندريا. بيروفات، المستقلب رئيسية المستخدمة لإنتاج ATP المتقدرية، يتم استيراده في المصفوفة الميتوكوندريا حيث أنها ديكاربوكسيلاتيد لإنتاج أسيتيل مرافق إنزيم أ (CoA). وبعد ذلك، يدخل أسيتيل CoA دورة حمض الستريك أدى إلى توليد نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH)، جزيء إلكترون رئيسية الناقل. كما يتم تمرير الإلكترونات من NADH إلى الأوكسجين عبر إلخ، والبروتونات بناء في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى توليد التدرج الكهروكيميائية عبر الغشاء. ثم ستتدفق هذه البروتونات من الفضاء intermembrane عبر هذا التدرج الكهروكيميائية العودة إلى المصفوفة المتقدرية عن طريق المسام بروتون من synthase ATP، القيادة التناوب وتركيب ATP1 (الشكل 1).

الوظيفة المتقدرية لا يقتصر على إنتاج الطاقة ولكن أيضا أمر حاسم لاستتباب الكالسيوم والأكسجين التفاعلية الأنواع (روس) المسح والمبرمج، حاسمة لتحديد المواقع وظيفتها في الصحة العضوي2. ويمكن تقييم الوظيفة المتقدرية باستخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التحليلات التي تقيس غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومستويات ATP وروس، وتركيزات الكالسيوم المتقدرية. بيد أن هذه الاختبارات توفر لقطة واحدة من الوظيفة المتقدرية ولذلك قد لا يوفر نظرة شاملة لصحة المتقدرية. نظراً لاستهلاك الأوكسجين أثناء توليد ATP يعتمد على عدد وافر تفاعلات متسلسلة، هو بمثابة مؤشر متفوقة من الوظيفة المتقدرية. من المثير للاهتمام، وقد لوحظت اختلافات في معدلات استهلاك الأوكسجين نتيجة خلل mitochondrial3،،من45.

ويمكن قياس معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) للعينات الحية باستخدام التقنيات التي يمكن تقسيم إلى مجموعتين: أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار وفوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي يمكن أن تطفئ بالأكسجين6. وقد استخدمت على نطاق واسع أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار لتدبير التعرف الضوئي على الحروف في استزراع الخلايا، الأنسجة، وفي نظم نموذجية، مثل C. ايليجانس. ومع ذلك، تمتلك فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحتوي على ريسبيروميتيرس بالمزايا التالية: (1) أنها تسمح بإجراء مقارنة جنبا إلى جنب من عينتين في ثلاث نسخ، (2) أنها تتطلب حجم عينة أصغر (مثل الديدان 20 كل بئر مقابل ~ 2، 000−5، 000 الديدان الدائرة)7، و (3) ريسبيروميتير يمكن برمجتها للقيام بأربع حقن مركبة مختلفة في المطلوب مرات في جميع أنحاء تشغيل تجريبي، مما يلغي الحاجة للتطبيق اليدوي.

في هذا البروتوكول، وهي الخطوات المتضمنة في استخدام ريسبيروميتير الاستشعار الأوكسجين البورفيرين المستندة إلى تدبير التعرف الضوئي على الحروف في العيش، سليمة C. ايليجانس وصف. بينما هناك بروتوكول مكتوب لاستخدام بشكل كبير، الإنتاجية العالية ريسبيروميتير8، تم تكييفها للاستخدام مع أداة ودية وسهلة المنال، وأصغر من حجم ميزانية أكثر هذا البروتوكول. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص لتقييم الفرق بين السلالات اثنين، حيث الفرز الفائق غير مطلوب وسيكون استعماله المفرط في التعرف الضوئي على الحروف.

Protocol

ملاحظة: الرقم 2 لمحة تخطيطي للبروتوكول بالكامل.

1-النمو والمزامنة من السكان السلكية9،10

  1. نقل اليرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة (مثلاً، N2 [نوع البرية] والحيوانات sel-12) على لوحات وسائل الإعلام (NGM) نمو السلكية (انظر الجدول 1 للوصفة) المصنفة حديثا مع حشيش الإشريكيّة القولونية (OP50)11. استخدام اثنين على الأقل 100 ملم أو ثلاث لوحات 60 ملم لكل سلالة. احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسب (بين 15-25 درجة مئوية) لمدة 3-4 أيام أو حتى لوحات تتركز مع عدد كبير من البيض والديدان جرابيد.
  2. أغسل البيض والديدان قبالة لوحات باستخدام حوالي 6 مل من المخزن المؤقت M9 (انظر الجدول 1 للوصفة) كل لوحة 100 مم من الديدان الخيطية ونقل لهم مع الزجاج الماصات باستور في أنابيب الطرد المركزي 15 مل الفردية لكل سلالة. وتدور هذه الأنابيب إلى أسفل لمدة 3 دقائق في 6,180 س ز و aspirate خارج المخزن المؤقت M9، والإبقاء فقط الحيوانات والبيض بيليه.
  3. إضافة 3-4 مل من محلول التبييض (انظر الجدول 1 للوصفة) لكل أنبوبة ودوامه للحد الأدنى 6 M9 إضافة المخزن المؤقت لملء كل أنبوبة وتدور في س 6,180 ز لمدة 1 دقيقة ونضح المادة طافية بشكل متقطع. كرر هذا يغسل مع M9 ثلاث مرات ونقل بيليه البيض إلى أنبوب 15 مل طازجة التي تحتوي على حوالي 9 مل M9 المخزن المؤقت.
  4. مزامنة الديدان الطازجة مظلل نوتاتينج في 20 درجة مئوية حاء 16-48 تدور هذه الأنابيب أسفل في 6,180 ز x 1.5 دقيقة واخماد الحيوانات L1 متزامنة على لوحات NGM الفردية المصنفة حديثا مع حشيش OP50 (حوالي 6,000-10,000 الحيوانات كل لوحة 100 ملم) وتبقى عند 20 درجة مئوية.
  5. هذه الحيوانات وسوف تصل إلى مرحلة اليرقات L4 بعد ح ~ 42. وفي هذا الوقت، نقل اليرقات L4 اختيار البلاتين إلى OP50 باستخدام المصنف NGM لوحات تحتوي على 0.5 ملغ/مل 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر) لمنعها من إنتاج ذرية.
    ملاحظة: تأكد من أن جميع سلالات متزامنة داخل تجربة لفترة مماثلة من الزمن. العلاج فودر يعقم الحيوانات ويمنع إنتاج البيض زرع وذرية، التي يمكن أن تؤثر على التعرف الضوئي على الحروف. سيتم تحليل هذه الحيوانات معقمة في اليوم التالي (يوم 1 الحيوانات الكبار في ح ~ 66) للمقايسة. وقد أبلغ فودر تؤثر فسيولوجيا وعمر بعض الديدان متحولة. ولذلك، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند استخدام المخدرات للتعقيم12،،من1314. كما يمكن تعقيم الديدان بالوسائل بتأنيث الطفرات مثل fem-1(hc17) أو fem-3(e2006). ومع ذلك، قد تؤثر هذه الطفرات الوظيفة المتقدرية.

2-إعداد المركبات بالحقن والماء من المسابر

ملاحظة: أثناء فحص تشغيل، يتم قياس معدلات التنفس القاعدية والقصوى على حد سواء للخيطيات. يتم تشغيل التنفس القصوى في الحيوانات عند إضافة الكربونيل السيانيد-4 (تريفلورميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، يفصل ionophore التي تزعج غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومن ثم توليف ATP بنقل البروتونات عبر غشاء الميتوكوندريا، بينما يسمح لضخ البروتون، نقل الإلكترون، واستهلاك الأوكسجين المضي قدما4،15 فصل من التوليف ATP (الشكل 1). الخطوة النهائية في الإنزيم ينطوي على إضافة أزيد الصوديوم (نان3)، دواء الذي يحول دون المجمعات الرابع والخامس في إلخ، مما يسمح أحد لتحديد التنفس غير المتقدرية16 (الشكل 1). الخطوات التالية التي يمكن أن يؤديها في اليوم قبل تشغيل الفحص الفعلي.

  1. إعداد 1 مل الحلول المخزون من فككب (10 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]]: 1000 × تركيز التحليل النهائي) ومن نان3 (400 ملم في dH2o: 10 × تركيز التحليل النهائي) ومخزن في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تشغيل منحنى تركيز لتحسين تركيز فككب المطلوبة للحصول على أقصى استجابة التعرف الضوئي على الحروف لكل صك وإعداد مختبر.
  2. هيدرات خرطوشة الاستشعار بإضافة 200 ميليلتر من dH2س لكل بئر (والخزان المحيطة بها) في اللوحة، التأكد من أن أجهزة الاستشعار المسابير مغمورة في dH2س ومخزن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: خرطوشة يمكن أن تترك المسابير المغمورة ليصل إلى 72 ساعة لكن في حالة ترطيب فترة طويلة، ينبغي أن تكون ملفوفة في الفيلم البارافين اللوحات والمخزنة في 4 درجات مئوية. إذا لم يكن ممكناً ترطيب بين عشية وضحاها، ينبغي رطب خرطوشة استشعار لمالا يقل عن 4 ح قبل الفحص.
  3. إيقاف عنصر التدفئة داخل واجهة ريسبيروميتير وتخزين الصك داخل حاضنة 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى انخفاض درجة الحرارة الأساسية داخل أداة لمنع الحيوانات من الانهاك أثناء الفحص تشغيل.
    ملاحظة: ريسبيروميتير مجهزة بعنصر تسخين لكن لا يبرد. ضمن حاضنة 15 درجة مئوية، سيكون ريسبيروميتير درجة حرارة مستقرة بين 18 – 22 درجة مئوية، ودرجة حرارة صحية لصيانة C. ايليجانس .

3-المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة

  1. "الماصة؛" بها وتجاهل dH2س المستخدمة لهيدرات الاستشعار تحقيقات واستبدالها ب 200 ميليلتر من الحل كاليبرانت (الرقم الهيدروجيني 7.4) في كل بئر. تمييع الحل فككب الأسهم إلى 100 ميكرومتر فككب في dH2س وإضافة 20 ميليلتر من الحل المخفف لحقن المنفذ A في خرطوشة الاستشعار. إضافة 22 ميليلتر من أزيد الصوديوم 400 مم إلى منفذ ب خرطوشة سينور.
  2. تشغيل في ريسبيروميتير وفي الشاشة الرئيسية حدد البدء؛ سوف تظهر صفحة قوالب. على صفحة قوالب، حدد قالب مصمم مسبقاً؛ أو فارغ سوف تظهر صفحة المجموعات. على صفحة "مجموعات"، حدد الآبار A و H الآبار الخلفية وتعيين الآبار 6 المتبقية في المجموعات المناسبة وفقا لخطة تجريبية.
  3. دفع السهم الموجود في الزاوية اليمنى السفلي للذهاب إلى صفحة البروتوكول. في الصفحة "بروتوكول"، تأكد من تحديد الأزرار اكويليبراتيو القاعدية و حقن 1 و 2 . في هذه الصفحة، ضبط عدد القراءات القاعدية التعرف الضوئي على الحروف، فضلا عن التعرف الضوئي على الحروف القصوى (بعد حقن 1 مع فككب) وغير المتقدرية التعرف الضوئي على الحروف (بعد حقن 2 مع أزيد الصوديوم).
    ملاحظة: كل قياس مسبوقاً بواسطة مزيج والخطوة الانتظار والأطر الزمنية لهذه المعلمات مبينة في الجدول 2.
  4. حدد السهم الموجود في الزاوية السفلية اليمنى وسوف تظهر موجه لتحميل لوحة خرطوشة أجهزة الاستشعار. التأكد من تحميل لوحة خرطوشة أجهزة الاستشعار في الاتجاه الصحيح، اتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة تذكير الفوري. الآن سوف ريسبيروميتير أن حجته الخرطوشة.
    ملاحظة: هذه الموازنة توفر متسع من الوقت لوضع الحيوانات ليكون جزيئي في آبار مناسبة للوحة الخلية.

4-إعداد لوحة دودة والمقايسة تشغيل

  1. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت M9 في كل من 8 آبار لوحة الخلية وفي خزانات المياه المحيطة بالآبار.
  2. اختيار الديدان ~ 100 من كل سلالة على لوحات NGM المصنف والسماح للراحة لدقيقة 2-3 الرطب نهاية اختيار البلاتين مع المخزن المؤقت M9 وانتقاء الحيوانات متزامنة من سن 20 إلى الآبار ب-ز، ترك الآبار الخلفية A و H فارغة.
    ملاحظة: بعد تحميل كل حسنا، الانتظار حوالي 2 دقيقة للسماح للحيوانات للاستقرار في الجزء السفلي من الآبار. من المستصوب أيضا أن يتم تشغيل منحنى رقم دودة لتحسين عدد الدودة الواحدة وكذلك لكل صك وإعداد مختبر.
  3. الآن، ينبغي أن تكون محسوبة ريسبيروميتير وعن طريق النقر فوق موافق على الشاشة، يتم إخراج اللوح الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمعايرة ويمكن إزالتها من ريسبيروميتير، في حين يبقى الخرطوشة استشعار داخل الصك. استبدال لوحة كاليبرانت مع اللوحة التي تحتوي على الحيوانات. تحميل لوحة وإغلاق الباب بضرب متابعة والسماح مقايسة لتشغيل.

5-تحليل البيانات تجربة ما بعد

  1. بمجرد اكتمال تشغيل الفحص، اتبع المطالبات التي تظهر على الشاشة وإزالة لوحة الخلية واستشعار خرطوشة وإدراج محرك أقراص محمول بمنفذ USB لحفظ بيانات التشغيل بتنسيق.war. إزالة خرطوشة الاستشعار والسماح للحيوانات إلى تسوية إلى الجزء السفلي من الآبار لحوالي 2 دقيقة بوضع لوحات الخلية تحت ستيريو تشريح مجهر وإحصاء عدد الحيوانات كل بئر.
  2. فتح برنامج التحليل على جهاز الكمبيوتر وفتح علامة التبويب التطبيع تطبيع التعرف الضوئي على الحروف لعدد الحيوانات. تطبيق تسميات مناسبة لمختلف الفئات تحت علامة التبويب تعديل وتصدير الملف كملف المنشور لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: متوسط القياسات الخمس الأولى، قبل إضافة فككب هو التعرف الضوئي على الحروف القاعدية، بينما متوسط القياسات الخمس بعد إضافة فككب OCR القصوى ومتوسط القياسات الخمس الأخيرة (وينبغي أن يتم الحد الأدنى من اثنين من القياسات) بعد إضافة أزيد الصوديوم هو معدل التنفس غير الميتوكوندريا. يجب تكرار الفحص ثلاث مرات التأكد من إمكانية تكرار نتائج.

النتائج

استخدام البروتوكول الموضحة هنا، التعرف الضوئي على الحروف من الحيوانات البرية نوع وثلاثة مختلفة sel-12 المسخ تم تحديد سلالات. بترميز sel-12 أورثولوج C. ايليجانس presenilin17. الطفرات في بريسينيلين البشرية هي انحراف الوراثية الأكثر شيوعاً المقترنة بتطوير ...

Discussion

التنفس المتقدرية مؤشرا الثاقبة من الوظيفة المتقدرية؛ ولذلك، أن تكون قادرة على قياس معدلات استهلاك الأكسجين في نظام البيولوجي، سواء في المختبر أو في الحية قيمة للغاية. بمعنى ريسبيروميتيرس مستويات الأوكسجين باستخدام فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحصل على مروي بالأكسجين أو عن طري...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يود أن ينوه الدكتور كيفين Bittman لقيادته في إنشاء XFp فرس البحر في المختبر. المعاهد الوطنية "للصحة" منح GM088213 تؤيد هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm, 60 mm Petri dishesKord-Valmark Labware Products2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubesGlobe Scientific6285
15 mL conical tubesCorning430791
22 × 22 mm coverslipGlobe Scientific1404-10
50 mL conical tubesCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptoneBD, Bacto211677
Bacto tryptoneBD, Bacto211705
Bacto yeast extractBD, Bacto212705
BleachGeneric
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Fisher ScientificC79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Glass Pasteur pipettesKrackeler Scientific6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Seahorse XFp AnalyzerAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Sodium AzideSigma-AldrichS2002

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144 C OCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved