그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

요약

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

초록

미토 콘 드리 아 기능을 최적의 건강 한 세포 활동, 특히 높은 에너지 요구 같은 신 경계와 근육에 있는 셀에에서 대 한 중요 하다. 일관 된,이 미토 콘 드 리아 기능 장애 신경 퇴행 성 질환 및 일반적으로 노화의 무수와 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 elucidating 미토 콘 드 리아 기능의 많은 복잡 한에 대 한 강력한 모델 시스템 되었습니다. 미토 콘 드리 아 호흡 미토 콘 드리 아 기능의 강한 지시자 이다 고 최근에 개발 된 respirometers 세포에서 호흡을 측정 하는 최신의 플랫폼을 제공 합니다. 이 프로토콜, 라이브, 그대로 C. 선 충을 분석 하는 기술을 제공 합니다. 이 프로토콜 ~ 7 일의 기간에 걸쳐 (1) 성장 하 고 주입 하는 화합물의 C. 선 충, (2) 준비 및 프로브, (3) 약물 로드 및 카트리지 평형, 웜 분석 결과의 준비 (4) 수 분의 동기화에 대 한 단계를 포함 하 고 플레이트 및 실행, 분석 결과 (5) 후 실험 데이터 분석.

서문

아데노신 3 인산 염 (ATP), 세포 에너지의 주요 소스는 미토 콘 드리 아에 안 미토 콘 드리 아 막에 위치한 전자 전송 체인 (등)에서 효소에 의해 생산 됩니다. 어디 그것 decarboxylated 아 세 틸 보 효소 A (CoA)를 생산 하는 미토 콘 드리 아 모체로 pyruvate, 미토 콘 드리 아의 ATP 생산을 위해 활용 하는 주요 대사 산물 가져옵니다. 그 후, 아 세 틸 CoA 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)는 주요 전자 캐리어 분자의 세대의 결과로 구 연산 산 성 주기를 입력 합니다. NADH에서 전자는 등을 통해 산소에 전달 됩니다, 양성자 전기 화학 기온 변화도의 세대에서 막에 걸쳐 결과 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에 구축. 이러한 양성자 것입니다 다음 회전 그리고 ATP¹ (그림 1)의 합성 ATP synthase의 양성자 기 공 통해 미토 콘 드리 아 모체로 다시이 전기 화학 기온 변화도 걸쳐 intermembrane 공간에서 흐른다.

미토 콘 드 리아 기능 에너지 생산에 국한 되지 않습니다 하지만 칼슘 항상성, 반응성 산소 종 (선생님), 청소 및 apoptosis, organismal 건강²에 그들의 기능을 비판적으로 위치에 대 한 중요 한 또한 이다. 미토 콘 드 리아 기능 분석 실험를 포함 하 여 그 미토 콘 드리 아 막 잠재력 측정 분석, ATP 및 선생님 수준, 그리고 미토 콘 드리 아 칼슘 농도에 국한 되지 않는 다양 한을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 그러나, 이러한 분석 미토 콘 드 리아 기능의 단일 스냅숏으로 제공 하 고 따라서 미토 콘 드리 아 건강에 대 한 포괄적인 보기를 제공 하지 않을 수 있습니다. ATP 생성 하는 동안 산소 소비 순차적 반응의 무수 한 의존 때문에, 그것은 미토 콘 드리 아 기능의 우수한 지표 역할. 흥미롭게도, 산소 소비 속도 있는 변이 결과로 미토 콘 드 리아 기능 장애^3,,45관찰 되었습니다.

생활 샘플의 산소 소비 속도 (OCR) 기술을 광범위 하 게 두 그룹으로 분할 될 수 있다 사용 하 여 측정 될 수 있다: amperometric 산소 센서와 포 르 피 린 기반 형광체 산소⁶침묵 될 수 있습니다. Amperometric 산소 센서 측정 OCR 배양된 세포, 조직, 그리고 모델 시스템, C. 선 충등을 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, respirometers를 포함 하는 포 르 피 린 기반 형광체 다음과 같은 이점을: (1) 그들은 허용 3 중, 2 개의 샘플을 나란히 비교 (2) 그들은 작은 샘플 크기를 요구 (예를 들어, 잘 ~ 2, 000−5, 대 당 20 벌레 000 벌레는 상공 회의소)⁷, 그리고 (3)는 respirometer에서 4 개의 다른 복합 주사 할 프로그래밍 될 수 있다 수동 응용 프로그램에 대 한 필요성을 제거 실험 실행에 걸쳐 시간을 원하는.

이 프로토콜에는 포 르 피 린 기반 산소 감지 respirometer 라이브, 그대로 C. 선 충 에서 측정 OCR 사용 하 여 관련 된 단계는 설명된. 그러나 거기에 대형, 높은 처리량 respirometer⁸의 사용에 대 한 서 면된 프로토콜이이 프로토콜을 더 많은 예산 친절 하 고, 작은 규모 장비 사용에 대 한 적응 되었습니다. 이 프로토콜은 특히 OCR 두 긴장, 높은 처리량 검사는 필요 하지 않습니다와 그것의 사용은 과도 한 것 간의 차이 평가 하기 위한 유용 합니다.

프로토콜

참고: 그림 2 는 전체 프로토콜의 개요 개요를 제공합니다.

1. 성장과 선 충 인구^9,10 의 동기화

1. 원하는 유전 배경의 L4 애벌레를 전송 (예: N2 [야생 유형] 및 sel 12 동물) 갓 대장균 (OP50)¹¹의 잔디와 시드 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시 (제조 법에 대 한 표 1 참조)에. 두 개 이상의 100 m m 또는 3 개의 60 m m 플레이트를 사용 하 여 각 변형에 대 한. 3-4 일 또는 격판덮개는 계란과 벗 벌레의 큰 수로 집중 될 때까지 적절 한 성장 온도 (15-25 ° C) 사이 벌레를 품 어.
2. 계란과 M9 버퍼의 약 6 mL를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 벌레 세척 (제조 법에 대 한 표 1 참조) 선 충 및 전송의 100 mm 접시 당 그들 각 변형에 대 한 개별 15ml 원심 분리기 튜브로 파스퇴르 펫을 유리. 6,180 x g와 M9 버퍼, 단지 동물과 계란 펠 릿을 유지 밖으로 aspirate에서 3 분 다운이 튜브를 회전 합니다.
3. 표 백제 솔루션의 3-4 mL를 추가 (제조 법에 대 한 표 1 참조) 각 튜브와 간헐적으로 6 분 추가 M9 버퍼 채우기 각 튜브 6,180 x g 1 분 동안에 회전 하 고 상쾌한 발음에 대 한 소용돌이. M9이이 세척 3 번 반복을 계란 펠 릿을 M9 버퍼의 약 9 mL를 포함 하는 신선한 15 mL 튜브.
4. 1.5 분 6,180 x g에서 nutating 16-48 h. 회전 20 ° C에 의해 갓 부 화 한 벌레가이 튜브 아래로 동기화 하 고 갓 OP50의 잔디와 시드 개별 NGM 접시에 동기화 된 L1 동물을 내려 (약 100 m m 당 6000-10000 동물) 20 ° c.에 계속 하 고
5. 이 동물 후 ~ 42 h L4 애벌레 단계에 도달 한다. 이 시점에서 OP50에 백 금 선택을 사용 하 여 L4 애벌레 시드 NGM 이동 접시 포함 된 0.5 mg/mL 5-플 루 오로-2'-deoxyuridine (FUdR) 자손을 생산에서 그들을 방지 하기 위해.
   참고: 실험 내 모든 종자가 비슷한 양의 시간에 대 한 동기화는 다는 것을 확인 하십시오. FUdR 치료 동물 sterilizes OCR에 영향을 미칠 수 있는 달걀 누워 및 자손 생산을 방지 한다. 이러한 멸 균된 동물 분석 결과 대 한 다음 날 (~ 66 h 1 일 성인 동물) 분석 됩니다. FUdR은 생리학 특정 돌연변이 벌레의 수명에 미치는 영향에 보고 되었습니다. 따라서,이 취해야 한다 고려 사항으로 살 균^12,,1314에 대 한 약물을 사용 하는 경우. 벌레도 feminizing 돌연변이 fem-1(hc17) 또는 fem-3(e2006) 등의 방법으로는 멸 균 수 있습니다. 그러나, 이러한 돌연변이 미토 콘 드 리아 기능 영향을 줄 수 있습니다.

2. 주입 하는 화합물과 프로브 수 분의 준비

참고: 실행 하는 분석 결과 중 선 충의 두 기저와 최대한 호흡 속도 측정 됩니다. 최대한 호흡 동물 생성 시안-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP)의 추가에 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하는 연결을 푸는 ionophore 따라서 양성자를 운반 하 여 ATP 합성에서 시작 미토 콘 드 리아 멤브레인을 통해 양성자를 펌핑 하면서 전자 수송과 산소 소비^4,15 진행 상태로 ATP 합성 (그림 1)에서. 나트륨 아 지 드 (NaN₃)의 추가 포함 하는 분석 결과 마지막 단계 복합물 IV와 V 하나 비-미토 콘 드리 아 호흡¹⁶ (그림 1)을 확인 하려면 허용 등을 억제 하는 약물. 다음 단계는 실제 분석 결과 실행 전에 하루 수행할 수 있습니다.

1. 준비 1 mL는 FCCP의 재고 솔루션 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO]에서 10 mM: 최종 분석 결과 농도 x 1000)-20 ° c.에가 게와 할머니₃ (dH₂소개할 10 최종 분석 결과 농도 x 400 mM)
   참고: 실행 FCCP의 농도 최적화 하는 농도 곡선 각 악기 및 실험실 설정에 대 한 최대한 OCR 응답을 유도 하는 데 필요한.
2. 센서 프로브는 dH₂O 및 실 온에서 하룻밤 저장소에 잠긴 되도록 각 잘 (그리고 주변 저수지), 접시에 dH₂O의 200 µ L을 추가 하 여 센서 카트리지 하이드 레이트.
   참고: 프로브를 남아 있을 수 있는 카트리지 최대 72 h에 대 한 침수 하지만 장기간된 수 분의 경우 판 한다 파라핀 필름에 싸서 4 ° c.에 저장 숙박 수 화 불가능, 센서 카트리지 분석 결과 전에 적어도 4 h 하이드레이션 해야.
3. Respirometer 인터페이스 내에서 히터를 끄고 하룻밤 분석 결과 실행 동안 과열에서 동물을 방지 하기 위해 악기 내에서 낮은 코어 온도를 15 ℃ 인큐베이터 안에 악기를 저장.
   참고:는 respirometer가 열 요소를 갖추고 있지만 냉각 될 수 없습니다. 15 ° C 배양 기 내는 respirometer C. 선 충 유지 보수에 대 한 건강 온도 18-22 ° C 사이의 안정적인 온도 가질 것 이다.

3. 마약 로드 및 카트리지 평형

1. 밖으로 플라스틱 그리고 dH₂센서를 수 화 하는 데 사용 하는 O 조사 하 고 각 잘에서 calibrant 솔루션 (pH 7.4)의 200 µ L를 삭제. DH₂O 100 µ m FCCP FCCP 재고 솔루션을 희석 하 고 센서 카트리지에서 주입 포트 A에 희석된 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다. 세 뇨 르 카트리지 포트 B 400 m m 나트륨 아 지 드의 22 µ L를 추가 합니다.
2. respirometer를 켜고 홈 스크린 선택 시작; 서식 파일 페이지에 표시 됩니다. 서식 파일 페이지에서 빈 또는; 이전에 디자인된 서식 파일 선택 그룹 페이지에 표시 됩니다. 그룹 페이지에서 배경 우물으로 웰 스 A와 H를 선택 하 고 실험 계획에 따라 적절 한 그룹에 나머지 6 웰 스를 할당 합니다.
3. 프로토콜 페이지에가 서 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 밀어. 프로토콜 페이지에서 평형, 기초 및 주사 1과 2 단추 선택 되어 있는지 확인 합니다. 이 페이지에서 조정 (FCCP와 주입 1) 후 기저 OCR로 최대한 OCR 판독의 수 및 비-미토 콘 드리 아 (사출 2 나트륨 아 지 드와 함께) 후 OCR.
   참고: 각 측정 앞에 혼합 하 고 대기 단계 및 이러한 매개 변수에 대 한 시간 프레임 표 2에 나와 있습니다.
4. 오른쪽 아래 모서리에 있는 화살표를 선택 하 고 센서 카트리지 접시를 로드 하 라는 메시지가 나타납니다. 센서 카트리지 접시 지침 알림 프롬프트 화면에 오른쪽 방향으로 로드를 확인 합니다. respirometer 카트리지를 equilibrate 지금 것입니다.
   참고:이 평형 동물 세포 격판덮개의 적절 한 우물으로 분석을 배치 하는 충분 한 시간을 제공 합니다.

4. 웜 플레이트 및 분석 결과 실행 준비

1. 각 셀 판의 8 우물의 우물 주변 저수지에 M9 버퍼의 200 µ L를 추가.
2. Unseeded NGM 접시에 각 스트레인에서 ~ 100 웜 선택과 M9 버퍼와 2-3 분 젖은 백 금 선택의 끝에 휴식 하 고 우물 B-G, 배경 웰 스 A와 H를 빈 떠나는로 20 나이 동기화 동물을 선택 수 있습니다.
   참고: 후 각 음, 약 2 분을 기다릴 우물의 바닥에 침전 하는 동물을 허용. 그것은 또한 웜 번호 곡선 각 악기 및 실험실 설정 잘 당 웜 수를 최적화 하기 위해 실행 될 것이 좋습니다.
3. 지금까지,는 respirometer를 보정 해야 합니다 하 고 클릭 하 여 확인 화면에, 교정 버퍼를 포함 하는 접시 나옵니다 악기 내부 센서 카트리지 유지 하는 동안 respirometer에서 제거할 수 있습니다. 동물을 포함 하는 접시에 calibrant 플레이트를 바꿉니다. 플레이트 로드 고 문을 계속 타격 하 여 닫고 실행 분석 결과 허용 합니다.

5. 후 실험 데이터 분석

1. 분석 결과 실행 완료 되 면 화면에 나타나는 메시지에 따라 셀 판 및 센서 카트리지를 제거 하 고.war 형식에서 실행된 데이터를 저장 하는 USB 포트에 플래시 드라이브를 삽입. 센서 카트리지를 제거 하 고 약 2 분 장소 스테레오 해 부 현미경 아래 셀 접시 대 한 우물의 바닥에 정착을 잘 당 동물의 수를 세 동물 허용.
2. 컴퓨터에 분석 소프트웨어 열고 동물 수 OCR 정상화 정규화 탭을 엽니다. 수정 탭의 다양 한 그룹에 대 한 적절 한 레이블을 적용 하 고 파일 추가 분석을 위해 프리즘 파일로 내보냅니다.
   참고: 처음 5 측정, FCCP의 추가 5 측정 후 FCCP 추가 최대한 OCR의 평균 동안 기저 OCR 전에의 평균 및 마지막 5 측정 (최소 두 측정 할 수)의 평균 후에 나트륨 아 지 드 추가 비-미토 콘 드리 아 호흡 속도입니다. 분석 결과 재현성을 보장 하기 위해 세 번을 반복 한다.

결과

프로토콜을 사용 하 여 여기, OCR 야생 유형 동물 및 3 명의 다른 sel 12 돌연변이 종자 결정의 설명. sel-12 presenilin¹⁷의 선 충 C. ortholog을 인코딩합니다. 인간의 presenilin에 돌연변이 가족 Alzheimer의 질병¹⁸의 개발과 관련 된 가장 일반적인 유전 착오. 우리의 연구는 야생 타입 동물³에 비해 돌연변이 동물

토론

미토 콘 드리 아 호흡은 통찰력 있는 미토 콘 드 리아 기능; 따라서, 생체 외에서 또는 vivo에서 생물 학적 시스템에 산소 소비 속도 측정할 수 있는 매우 귀중 한입니다. Respirometers 산소 또는 산소 압력 전기 전류 비례의 생성에 의존 하는 amperometric 산소 센서를 통해 침묵 얻을 포 르 피 린 기반 형광체를 사용 하 여 산소 레벨을 감지 한다. 클라크 전극 후자의 범주에 폭포와 C. 선 충에 호흡을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm, 60 mm Petri dishes	Kord-Valmark Labware Products	2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes	Globe Scientific	6285
15 mL conical tubes	Corning	430791
22 × 22 mm coverslip	Globe Scientific	1404-10
50 mL conical tubes	Corning	430829
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2
Bacto peptone	BD, Bacto	211677
Bacto tryptone	BD, Bacto	211705
Bacto yeast extract	BD, Bacto	212705
Bleach	Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Abcam	ab120081
Cholesterol	Fisher Scientific	C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thomas Scientific	C987Y85
Glass Pasteur pipettes	Krackeler Scientific	6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-1
Seahorse XFp Analyzer	Agilent
Seahorse XFp FluxPak	Agilent	103022-100
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002