JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондриальное дыхание имеет решающее значение для выживания Организменное; Таким образом норма потребления кислорода является отличным показателем митохондриального здоровья. В этом протоколе мы описывают использование коммерчески доступных респирометра измерить базальную и максимальной кислорода расхода в жить, нетронутыми и свободно подвижные Caenorhabditis elegans.

Аннотация

Оптимальные функции митохондрий имеет решающее значение для здорового клеточную активность, особенно в клетках, которые имеют высокие энергетические потребности как в нервной системы и мышц. В соответствии с этим, митохондриальной дисфункции был связан с множеством нейродегенеративных заболеваний и старения в целом. Caenorhabditis elegans были мощной модели системы для выяснения многих тонкостях митохондриальной функции. Митохондриальное дыхание является сильным показателем митохондриальной функции и недавно разработанных respirometers предлагают состояние искусства платформу для измерения дыхания в клетках. В этом протоколе мы предоставляем технику для анализа живой, нетронутыми C. elegans. Этот протокол охватывает период ~ 7 дней и включает в себя шаги для синхронизации C. elegans, (2) подготовка соединений для инъекций и гидратации зонды, уравновешивания загрузки и картридж (3) наркотиков, (4) подготовка анализа червя и выращивания (1) пластины и пробирного запуска и анализ данных (5) после эксперимента.

Введение

Аденозинтрифосфат (АТФ), основным источником клеточной энергии, производится в митохондриях ферментами в электрон-транспортной цепи (и т.д.), расположенный в внутренней митохондриальной мембраны. Пируват, метаболита ключа используется для митохондриального производства АТФ, импортируется в митохондриальной матрицы, где это декарбоксилировали производить ацетил коэнзима A (CoA). Впоследствии ацетил CoA вводит цикл лимонной кислоты, в результате чего образуются Никотинамидадениндинуклеотид (NADH), ключевых электронов молекулы перевозчик. Поскольку электроны от NADH передаются кислорода через и т.д., протонов накапливаться в митохондриальной межмембранное пространства, что приводит к генерации электрохимических градиента через мембрану. Эти протоны затем будет вытекать из межмембранное пространства через этот электрохимических градиент обратно в матрице митохондриальной через поры Протон АТФ-синтазы, вождение его вращения и синтез АТФ1 (рис. 1).

Митохондриальной функции не ограничивается производства энергии, но также имеет решающее значение для гомеостаза кальция, реактивнооксигенных видов (ров) очистки и апоптоз, критически позиционирование их функции в научные здоровья2. Митохондриальной функции может быть оценена с помощью различных анализов, включая но не ограничиваясь анализов, которые измеряют митохондриальной мембранного потенциала, СПС и ROS уровней и митохондриальной кальция концентрации. Однако эти анализы предоставляют один снимок митохондриальной функции и поэтому не может обеспечить всеобъемлющее представление о митохондриального здоровья. Поскольку потребление кислорода во время генерации АТФ зависит от множества последовательных реакций, он служит превосходной индикатор функции митохондрий. Интересно, что результате митохондриальной дисфункции3,,45наблюдались различия в уровнях потребления кислорода.

Нормы потребления кислорода (OCR) живых образцов может быть измерена с помощью методов, которые можно разделить на две группы: Амперометрическое датчики кислорода и на основе порфирина светомассами, которые могут быть закаленных кислорода6. Датчики растворенного в воде кислорода широко использовались для измерения OCR в культивируемых клеток, тканей и в модели систем, таких как C. elegans. Однако, на основе порфирина Люминофоры, содержащие respirometers обладают следующими преимуществами: (1) они позволяют для бок о бок сравнение двух образцов в трех экземплярах, (2) они требуют меньше размер выборки (например, 20 червей за хорошо против ~ 2, 000−5, 000 червей в Палата)7и (3), которые респирометра может быть запрограммирован делать четыре различных составных инъекции на желаемый раз на протяжении выполнения экспериментальной, устраняя необходимость ручного нанесения.

В этом протоколе шаги с помощью порфирина кислорода зондирования респирометра меру OCR в C. elegans живой, нетронутыми, описанные. Хотя есть письменный протокол для использования большого формата, высокая пропускная способность респирометра8, этот протокол был адаптирован для использования с инструментом более дружественные, доступными и меньшего масштаба бюджета. Этот протокол является особенно полезной для оценки разницы в OCR между двух штаммов, где не требуется высокопроизводительного скрининга и его использование будет чрезмерным.

протокол

Примечание: На рисунке 2 обеспечивает Схематический обзор полного протокола.

1. рост и синхронизации нематоды населения9,10

  1. Переноса личинок L4 желаемого генетических особенностей (например, N2 [дикого типа] и sel-12 животных) на нематод роста СМИ (НГМ) плиты (см. таблицу 1 рецепт) свеже семенами с газоном Escherichia coli (ОР50)11. Используйте по крайней мере два 100 мм или три пластины 60 мм для каждого штамма. Инкубируйте червей на соответствующий рост температуры (между 15-25 ° C), для 3-4 дней или до тех пор, пока пластины сосредоточены с большим количеством яиц и беременных червей.
  2. Мыть яйца и червей от пластины примерно 6 мл M9 буфера (см. таблицу 1 для рецепта) на 100 мм пластины нематод и передачи их с стеклянные пипетки Пастера в отдельных 15 мл пробирок для каждого штамма. Спиновые эти трубы вниз на 3 мин на 6,180 x g и аспирата из буфера M9, сохраняя только животных и яйца Пелле.
  3. Добавить 3-4 мл раствора отбеливатель (см. таблицу 1 рецепт) для каждой трубки и периодически Вортекс для 6 минут добавить M9 буфера для заполнения каждой трубы и спина на 6180 х g за 1 мин и удалить супернатант. Повторите это мыть с M9 три раза и переместить Пелле яйца свежие 15 мл трубка, содержащая около 9 мл буфера M9.
  4. Синхронизировать недавно вылупившиеся червей, nutating при 20 ° C для 16 – 48 ч. спина эти трубы вниз на 6180 х g для 1,5 мин и положил синхронизированные L1 животных на отдельных пластин NGM свежезаваренным семенами с газоном ОР50 (приблизительно 6000 – 10 000 животных на 100 мм) и хранить при температуре 20 ° C.
  5. Эти животные достигнет L4 личиночной стадии после ~ 42 ч. В это время, переместите L4 личинки, с помощью платины забрать ОР50 семенами NGM пластины, содержащих 0,5 мг / мл 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR), чтобы предотвратить их от производства потомства.
    Примечание: Убедитесь, что в рамках эксперимента все штаммы синхронизированы для аналогичного количества времени. FUdR лечение стерилизует животных и предотвращает укладки и потомства производство яиц, которые могут повлиять на OCR. Эти стерилизованных животных будут проанализированы на следующий день (день 1 взрослых животных в ~ 66 h) для assay. Сообщается, что FUdR воздействие физиологии и срок службы некоторых мутантных червей. Таким образом это следует принимать во внимание, когда препарат используется для стерилизации12,,1314. Черви могут также стерилизовать средствами феминизации мутации, например fem-1(hc17) или fem-3(e2006). Однако эти мутации могут повлиять митохондриальной функции.

2. Подготовка соединений для инъекций и гидратации зондов

Примечание: Во время запуска assay, измеряются как базальную и максимальной дыхания ставки нематод. Максимальная дыхания срабатывает в животных после добавления карбонильных цианид-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), расцеплять ionophore, что беспокоит митохондриальной мембраны потенциал и, таким образом, синтез АТФ, перевозящих протонов через Митохондриальные мембраны позволяя перекачки протонов, электронов транспорт и потребление кислорода для продолжения4,15 расцеплено от синтез АТФ (рис. 1). Последний шаг в assay включает добавление азид натрия (НАН3), препарат, который подавляет комплексы IV и V в и т.д., позволяя определить не митохондриальное дыхание16 (рис. 1). За день до фактического анализа выполнения можно выполнить следующие действия.

  1. Подготовка 1 мл акций решения FCCP (10 мм диметилсульфоксида [ДМСО]: 1000 x окончательный анализ концентрации) и НАН3 (400 мм в dH2O: 10 x концентрации окончательный анализ) и хранить при температуре от-20 ° C.
    Примечание: Запускать кривой концентрации для оптимизации концентрацию FCCP требуется для получения максимальной реакции OCR для каждого инструмента и лабораторных условиях.
  2. Гидрат датчик картридж, добавив 200 мкл dH2O для каждой скважины (и окружающие водохранилище) в пластине, чтобы датчик, который зонды погружали в dH2O и магазин на ночь при комнатной температуре.
    Примечание: Зонды можно оставить картриджа погружен до 72 ч, но в случае длительного увлажнения, пластины должны быть завернутый в фильме парафина и хранить при 4 ° C. Если не возможна ночевка гидратации, датчик картриджа следует гидратированных для по крайней мере 4 ч до анализа.
  3. Выключить нагревательный элемент в интерфейсе респирометра и хранить инструмент внутри инкубатор 15 ° C на ночь на низкую температуру ядра в инструмент для предотвращения перегрева во время запуска assay животных.
    Примечание: Респирометра оснащен нагревательный элемент, но не может быть охлажден. В пределах 15 ° C-инкубатор Респирометр будет иметь стабильную температуру между 18-22 ° C, которая является здоровая температура для обслуживания C. elegans .

3. наркотиков картриджа и загрузка уравновешивания

  1. Пипетка и отбросить dH2O используется для увлажнения датчик датчики и заменить его с 200 мкл calibrant раствора (рН 7,4) в каждой скважине. Разбавить раствор FCCP до 100 мкм FCCP в dH2O и добавить 20 мкл разбавленного раствора для инъекций порт A датчик картриджа. 22 мкл азид натрия 400 мм, порт B Сеньор картриджа.
  2. Включите респирометра и на главном экране выберите начать; появится страница шаблонов. На странице шаблоны выберите пустой или ранее разработанный шаблон; появится страница группы. На странице группы выберите лунки A и H в качестве фона скважин и назначить оставшиеся 6 скважин в соответствующие группы согласно экспериментальный план.
  3. Нажмите стрелку в правом нижнем углу, чтобы перейти к странице протокола. На странице протокола убедитесь, что выбраны Equilibrate, базальных и инъекции 1 и 2 кнопки. На этой странице, отрегулировать количество чтений базальной OCR, а также максимальной OCR (после инъекций 1 с FCCP) и не митохондриальной OCR (после инъекций 2 с азидом натрия).
    Примечание: Каждое измерение предшествует смеси и ждать шаг и сроки для этих параметров приведены в таблице 2.
  4. Выберите стрелку в нижнем правом углу и появится запрос для загрузки картриджа пластина датчика. Убедитесь, что картридж пластина датчика загружается в правой ориентации, следуя инструкциям на экране быстрое напоминание. Респирометр теперь будет сбалансировать картриджа.
    Примечание: Этот уравновешивания обеспечивает достаточно времени для размещения животных, чтобы быть assayed в соответствующие скважины ячейки листа.

4. Подготовка червь пластины и пробирного запуска

  1. Добавьте 200 мкл буфера M9, в каждый из 8 скважин пластину клеток и в водохранилищах вокруг лунки.
  2. Выберите ~ 100 червей от каждого штамма на unseeded NGM пластин и позволяют отдохнуть на 2-3 мин мокрой конце Платиновый забрать с M9 буфера и выбрать 20 синхронизированы возраст животных в скважины B-G, оставляя пустой фон скважин A и H.
    Примечание: После загрузки каждый хорошо, подождите около 2 мин разрешить животных, чтобы поселиться в нижней части скважины. Кроме того, рекомендуется, что червь номер кривой запускать оптимизировать количество червя за хорошо для каждого инструмента и лабораторных условиях.
  3. В настоящее время Респирометр должен быть откалиброван и, нажав кнопку ОК на экране, пластины, содержащий буфер калибровки выбрасывается и могут быть удалены из Респирометр, в то время как датчик патрон остается внутри инструмента. Замените пластину calibrant пластину, содержащие животных. Загрузить пластины и закрыть дверь, нажав продолжить и позволяют assay для запуска.

5. после эксперимента данных анализа

  1. После завершения выполнения анализа, следуйте указаниям на экране и снимите клеток и датчик картриджа и вставьте флэш-накопитель в USB-порт для сохранения выполнения данных в формате .war. Извлеките картридж с датчика и позволяют животных оседают на дно скважины для около 2 мин место сотовый плит под рассекает микроскопом стерео и подсчитать количество животных в колодец.
  2. Откройте анализ программного обеспечения на компьютере и откройте вкладку нормализацию нормализовать OCR для животных номер. Применять соответствующие этикетки для различных групп на вкладке изменить и экспортировать этот файл как Призма файл для дальнейшего анализа.
    Примечание: Среднее из первых пяти измерений, перед добавлением FCCP базальной OCR, в то время как среднее из пяти измерений после того, как FCCP является максимальное OCR и среднее из пяти последних измерений (должно быть сделано не менее двух измерений) После добавления азид натрия является уровень не митохондриальное дыхание. Assay следует повторить три раза для обеспечения воспроизводимости.

Результаты

С помощью протокола описаного, OCR дикого типа животных и три различных sel-12 мутантных штаммов были определены. SEL-12 кодирует ortholog C. elegans Пресенилин17. Мутации в человека Пресенилин являются наиболее распространенным генетическим аберрации, св?...

Обсуждение

Митохондриальное дыхание является показателем глубокий митохондриальной функции; Поэтому будучи в состоянии измерить уровень потребления кислорода в биологической системе, будь то в лабораторных условиях или в естественных условиях весьма ценным. Respirometers смысле кислорода с помощью ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы признать за его руководство в создании Seahorse XFp в лаборатории д-р Кевин Bittman. Национальные институты здравоохранения грант, что GM088213 поддерживает эту работу.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm, 60 mm Petri dishesKord-Valmark Labware Products2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubesGlobe Scientific6285
15 mL conical tubesCorning430791
22 × 22 mm coverslipGlobe Scientific1404-10
50 mL conical tubesCorning430829
AgarFisher ScientificBP1423-2
Bacto peptoneBD, Bacto211677
Bacto tryptoneBD, Bacto211705
Bacto yeast extractBD, Bacto212705
BleachGeneric
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Fisher ScientificC79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)Abcamab120081
CholesterolFisher ScientificC314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Thomas ScientificC987Y85
Glass Pasteur pipettesKrackeler Scientific6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)Fisher ScientificBP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificBP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-1
Seahorse XFp AnalyzerAgilent
Seahorse XFp FluxPakAgilent103022-100
Sodium AzideSigma-AldrichS2002

Ссылки

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144C elegansOCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены