Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Résumé

La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.

Résumé

La fonction mitochondriale optimale est critique pour l’activité cellulaire en bonne santé, en particulier dans les cellules qui ont des exigences de haute énergie comme ceux du système nerveux et musculaire. Compatible avec cela, dysfonctionnement mitochondrial a été associé à une multitude de maladies neurodégénératives et vieillissement en général. Caenorhabditis elegans ont été un système puissant modèle pour élucider les nombreuses subtilités de la fonction mitochondriale. La respiration mitochondriale est un bon indicateur de la fonction mitochondriale et respiromètres récemment développés offrent une plate-forme d’état-of-the-art pour mesurer la respiration dans les cellules. Dans ce protocole, nous fournissons une technique pour analyser live, intact c. elegans. Ce protocole s’étend sur une période d’environ 7 jours et inclut des étapes de croissance (1) et la synchronisation c. elegans, (2) préparation de composés à doser et l’hydratation des sondes, chargement et cartouche l’équilibration du médicament (3), (4) préparation du test de ver plaque et épreuve et analyse des données de test post (5).

Introduction

L’adénosine triphosphate (ATP), la principale source d’énergie cellulaire, est produit dans les mitochondries par les enzymes de la chaîne de transport d’électrons (etc.) situés dans la membrane mitochondriale interne. Un métabolite clé utilisé pour la production d’ATP mitochondriale, le pyruvate est importé dans la matrice mitochondriale où elle est décarboxylée pour produire du coenzyme A (CoA). Par la suite, acétyl-CoA pénètre dans le cycle de Krebs ayant pour résultat la génération de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), une molécule porteuse de clé électronique. Comme les électrons de NADH sont passés à l’oxygène par le CTE, protons s’accumuler dans l’espace intermembranaire mitochondrial, qui se traduit par la génération d’un gradient électrochimique à travers la membrane. Ces protons ensuite découleront de l’espace intermembranaire à travers ce gradient électrochimique dans la matrice mitochondriale par le pore de proton de l’ATP synthase, conduire sa rotation et la synthèse de l’ATP¹ (Figure 1).

La fonction mitochondriale n’est pas limitée à la production d’énergie, mais est également cruciale pour l’homéostasie du calcium, espèces réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage et apoptose, positionnement critique leur fonction organismique santé². La fonction mitochondriale peut être évaluée en utilisant une variété de tests, y compris mais sans s’y limiter à des analyses qui mesurent le potentiel de membrane mitochondrial, les niveaux d’ATP et ROS et concentrations de calcium mitochondrique. Toutefois, ces analyses donnent un aperçu unique de la fonction mitochondriale et donc ne pourraient pas fournir une vision globale de la santé mitochondriale. Étant donné que la consommation d’oxygène pendant la génération d’ATP est tributaire d’une myriade de réactions séquentielles, il sert un indicateur supérieur de la fonction mitochondriale. Fait intéressant, les variations dans les taux de consommation d’oxygène ont été observées à la suite de dysfonctionnement mitochondrial^3,4,5.

Taux de consommation d’oxygène (OCR) des échantillons vivants peuvent être mesurées à l’aide de techniques qui peuvent être largement divisés en deux groupes : ampérométrique sondes d’oxygène et phosphores axée sur la porphyrine qui peuvent être éteint par l’oxygène⁶. Sondes d’oxygène ampérométrique ont été largement utilisés à mesure OCR en cellules, tissus et dans les systèmes de modèle, comme c. elegans. Cependant, les phosphores axée sur les porphyrines contenant respiromètres possèdent les avantages suivants : (1) elles permettent une comparaison côte à côte de deux échantillons en trois exemplaires, (2) ils ont besoin de plus petite taille de l’échantillon (par exemple, 20 vers / puits contre ~ 2, 000−5, 000 vers chez le ⁷de la chambre) et (3) le respiromètre peut être programmé pour faire quatre injections de composés différentes à désiré fois tout au long de la course expérimentale, éliminant le besoin d’application manuelle.

Dans ce protocole, les étapes à suivre pour utiliser un respiromètre de détection oxygène porphyrine-basé à mesure OCR en live, intact c. elegans sont décrit. Bien qu’il y a un protocole écrit pour l’utilisation du format grand, haut débit respiromètre⁸, ce protocole a été adapté pour une utilisation avec un instrument plus d’échelle sympathique, accessible et plus petit budget. Ce protocole est particulièrement utile pour évaluer la différence de l’OCR entre deux souches, où criblage à haut débit n’est pas nécessaire et son utilisation serait excessive.

Protocole

NOTE : La Figure 2 donne un aperçu schématique du protocole complet.

1. la croissance et la synchronisation de la population des nématodes^9,10

1. Transfert L4 larves d’origines génétiques souhaitées (par exemple, N2 [sauvage] et sel-12 animaux) sur des plaques de médias (NGM) croissance nématode (voir le tableau 1 pour la recette) fraîchement ensemencées avec une pelouse d' Escherichia coli (OP50)¹¹. Utilisez au moins deux 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche. Incuber les vers à la température de croissance approprié (entre 15 et 25 ° C) pendant 3 à 4 jours ou jusqu'à ce que les plaques sont concentrés avec grand nombre de œufs et les vers gravides.
2. Lavez les œufs et les vers sur les plaques à l’aide d’environ 6 mL de tampon de M9 (voir le tableau 1 pour la recette) par plaque de 100 mm des nématodes et transfert avec verre pipettes Pasteur en tubes à centrifuger bouteille de 15 mL pour chaque souche. Tournez ces tubes vers le bas pendant 3 min à 6 180 x g et aspirer à la mémoire tampon de M9, conservant simplement le culot d’animaux et d’oeufs.
3. Ajouter 3 à 4 mL de solution d’eau de Javel (voir le tableau 1 pour la recette) à chaque tube et par intermittence vortexer pendant 6 min. ajouter M9 tampon pour remplir chaque tube et tournent à x 6 180 g pendant 1 min et aspirer le surnageant. Ce lavage avec M9 le répète trois fois et déplacez le culot de œuf dans un tube de frais 15 mL contenant environ 9 mL de tampon de M9.
4. Synchroniser les vers fraîchement écloses en oscillant à 20 ° C pendant 16 à 48 h. Spin ces tubes vers le bas à 6 180 x g pendant 1,5 min et déposa les animaux L1 synchronisées sur assiettes individuelles de NGM fraîchement ensemencées avec une pelouse de OP50 (environ 6 000 – 10 000 animaux par plaque de 100 mm) et garder à 20 ° C.
5. Ces animaux atteindra le stade larvaire de L4 après ~ 42 h. A cette époque, déplacer les larves de L4 à l’aide d’une pioche de platine à OP50 ensemencées NGM plaques contenant 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-déoxyuridine (FUdR) pour les empêcher de produire des descendants.
   NOTE : S’assurer que dans une expérience toutes les souches sont synchronisés pour une durée similaire. FUdR traitement stérilise les animaux et empêche la production de pose et de leur descendance oeuf, qui pourrait influencer les OCR. Ces animaux stérilisés on analysera le lendemain (animaux adultes jour 1 à ~ 66 h) pour le dosage. FUdR a été signalé à l’impact de physiologie et la durée de vie de certains vers mutants. Par conséquent, cela devrait prendre en considération lorsque le médicament est utilisé pour la stérilisation^12,13,14. Vers peuvent également être stérilisés par le biais de féminisant mutations telles que fem-1(hc17) ou fem-3(e2006). Toutefois, ces mutations peuvent influer la fonction mitochondriale.

2. préparation des composés à doser et hydratation des sondes

Remarque : Pendant l’épreuve, les deux taux de respiration basale et maximale des nématodes sont mesurés. La respiration maximale est déclenchée chez les animaux lors de l’addition de carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) phénylhydrazone (FCCP), un ionophore découplante qui perturbe le potentiel de membrane mitochondrial et donc la synthèse de l’ATP en transportant les protons à travers la membrane mitochondriale, tout en permettant à proton pompage, transport d’électrons et la consommation d’oxygène de procéder^4,15 dételé de synthèse de l’ATP (Figure 1). La dernière étape dans le test implique l’addition d’azide de sodium (NaN₃), un médicament qui inhibe les complexes IV et V dans l’ETC, permettant de déterminer la respiration mitochondriale-non¹⁶ (Figure 1). Les étapes suivantes peuvent être effectuées la veille de la course de dosage réel.

1. Préparer les solutions de la FCCP 1 mL (10 mM dans le diméthylsulfoxyde [DMSO] : 1000 x la concentration d’essai final) et NaN₃ (400 mM de dH₂O: 10 x concentration dosage final) et les conserver à-20 ° C.
   Remarque : Exécutez une courbe de concentration afin d’optimiser la concentration de FCCP requis pour susciter la réponse maximale d’OCR pour chaque instrument et le laboratoire.
2. Hydrater la cartouche de sonde en ajoutant 200 µL de dH₂O à chaque puits (et le réservoir avoisinante) dans l’assiette, veiller à ce que le capteur de sondes sont submergées dans la dH₂O et conserver pendant la nuit à température ambiante.
   NOTE : La cartouche de sondes peuvent être laissés submergé pendant 72 h mais dans le cas d’une hydratation prolongée, les plaques doivent être enveloppés dans le film de paraffine et stockés à 4 ° C. Si l’hydratation pendant la nuit n’est pas possible, la cartouche de sonde doit être hydratée pendant au moins 4 h avant le dosage.
3. Désactiver l’élément de chauffage dans l’interface de respiromètre et conserver l’appareil à l’intérieur d’un incubateur de 15 ° C durant la nuit à basse température à coeur au sein de l’instrument pour empêcher les animaux de surchauffe pendant l’épreuve.
   Remarque : Le respiromètre est équipé d’un élément chauffant mais ne peut pas être refroidi. Dans un incubateur à 15 ° C, le respiromètre aura une température stable située entre 18 et 22 ° C, qui est une température saine pour l’entretien c. elegans .

3. chargement et cartouche l’équilibration du médicament

1. Pipetter dehors et jeter la dH₂O utilisé pour hydrater le capteur sondes et remplacez-le avec 200 µL de la solution de degré (pH 7,4) dans chaque puits. Diluer la solution mère de FCCP à 100 µM FCCP dH₂O et ajouter 20 µL de la solution diluée au port A injection dans la cartouche de la sonde. Ajouter 22 µL d’azide de sodium 400 mM au port B de la cartouche de senor.
2. Allumer le respiromètre et sur l’écran accueil, sélectionnez Démarrer; la page de modèles s’affiche. Sur la page de modèles, sélectionnez vide ou un modèle déjà conçu ; la page de groupes s’affiche. Sur la page groupes, sélectionnez les puits A et H comme les puits à fond et assigner les autres 6 cupules dans les groupes appropriés selon le plan expérimental.
3. Appuyez sur la flèche sur le coin inférieur droit pour accéder à la page de protocole. Dans la page protocole, vérifiez que les boutons de stabiliser, les noyaux et les Injections 1 et 2 sont sélectionnés. Sur cette page, ajuster le nombre de lectures de OCR basale ainsi que OCR maximale (après injection 1 avec FCCP) et non-mitochondriale OCR (après injection 2 avec l’azoture de sodium).
   Remarque : Chaque mesure est précédée d’un mélange et l’étape d’attente et les délais d’exécution pour ces paramètres sont indiqués dans le tableau 2.
4. Sélectionnez la flèche sur le coin inférieur droit et une invite pour la plaque de cartouche de capteur de charge s’affiche. Veiller à ce que la plaque de cartouche de capteur est chargée dans la bonne orientation, suivant les instructions sur l’écran de rappel rapide. Le respiromètre sera maintenant équilibrer la cartouche.
   NOTE : Cet équilibre donne amplement le temps de placer les animaux à doser dans le puits de la plaque cellulaire.

4. préparation du ver plat et épreuve

1. Ajouter 200 µL de tampon de M9 dans chacun des 8 puits de la plaque cellulaire et dans les réservoirs qui entourent les puits.
2. Ramasser 100 ~ vers de chaque souche sur des plaques de NGM non ensemencées et laisser reposer pendant 2-3 min. mouillé la fin de la pioche de platine avec un tampon M9 et choisir 20 animaux âge synchronisées dans puits B-G, laissant les puits de fond A et H vide.
   Remarque : Après le chargement chacun Eh bien, attendez environ 2 min pour que les animaux puissent s’installer dans le fond des puits. Il est également souhaitable qu’une courbe numéro ver être exécuté afin d’optimiser le nombre de vis sans fin / puits pour chaque instrument et le laboratoire.
3. Maintenant, le respiromètre doit être étalonné et en cliquant sur OK sur l’écran, la plaque contenant un tampon d’étalonnage est éjectée et peut être retirée de la respiromètre, tandis que la cartouche de capteur reste à l’intérieur de l’instrument. Remettez la plaque calibrant avec la plaque contenant les animaux. Plaque de charge et fermer la porte en appuyant sur continuer et permettent le dosage à exécuter.

5. analyse des données post expérience

1. Une fois la série de test est terminée, suivez les invites à l’écran et enlever la plaque cellulaire et la cartouche de sonde et insérer un lecteur flash dans le port USB pour enregistrer les données d’exécution au format .war. Retirez la cartouche de capteur et que les animaux puissent se déposent au fond des puits pour environ 2 min. placer les plaques de la cellule sous une stéréo binoculaire et compter le nombre d’animaux par puits.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse sur l’ordinateur et ouvrez l’onglet de normalisation pour normaliser les OCR à plusieurs animaux. Appliquer des étiquettes correspondant aux différents groupes sous l’onglet modifier et exporter le fichier comme un fichier de prisme pour une analyse ultérieure.
   Remarque : La moyenne des cinq premières mesures, avant l’ajout de FCCP est l’OCR basale, alors que la moyenne des cinq mesures après que addition de FCCP est l’OCR maximale et la moyenne des cinq dernières mesures (minimum de deux mesures devrait être fait) après que addition de l’azoture de sodium est le taux de respiration non-mitochondriale. Le test doit être répété trois fois pour assurer la reproductibilité.

Résultats

En utilisant le protocole décrit dans les présentes, OCR des animaux de type sauvage et trois différents sel-12 mutant souches ont été déterminés. sel-12 encode les orthologues de c. elegans de préséniline¹⁷. Mutations humaine préséniline sont l’aberration génétique plus commune associée au développement de la maladie d’Alzheimer familiale¹⁸. Nos études ont montré des niveaux élevés de calciu...

Discussion

La respiration mitochondriale est un indicateur perspicace de la fonction mitochondriale ; par conséquent, être capable de mesurer les taux de consommation d’oxygène dans un système biologique, si in vitro ou in vivo est extrêmement précieux. Respiromètres détecte les niveaux d’oxygène à l’aide de phosphores axée sur la porphyrine qui s’éteint par l’oxygène ou par l’intermédiaire de capteurs d’oxygène ampérométrique qui reposent sur la génération d’une proportionnelle de courant élect...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm, 60 mm Petri dishes	Kord-Valmark Labware Products	2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes	Globe Scientific	6285
15 mL conical tubes	Corning	430791
22 × 22 mm coverslip	Globe Scientific	1404-10
50 mL conical tubes	Corning	430829
Agar	Fisher Scientific	BP1423-2
Bacto peptone	BD, Bacto	211677
Bacto tryptone	BD, Bacto	211705
Bacto yeast extract	BD, Bacto	212705
Bleach	Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Abcam	ab120081
Cholesterol	Fisher Scientific	C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thomas Scientific	C987Y85
Glass Pasteur pipettes	Krackeler Scientific	6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	Fisher Scientific	BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-1
Seahorse XFp Analyzer	Agilent
Seahorse XFp FluxPak	Agilent	103022-100
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002