قياس الألوان "التحليل من القلوية الفوسفاتيز النشاط" في المذهبة س. بيوفيلم

Summary

في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا

Abstract

الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) إنزيم مشتركة المعرب عنها في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة على حد سواء. أنه يحفز التحلل المائي للفوسفات مونوستيرس من العديد من الجزيئات في الأس الهيدروجيني القاعدي ويلعب دوراً لا غنى عنه في استقلاب الفوسفات. في البشر، وألب حقيقية النواة واحدة من الإشارات الانزيمية الأكثر استخداماً في تشخيص الأمراض المختلفة، مثل ركود صفراوي والكساح. في س. تم الكشف عن المكوّرات، الب حصرا على غشاء الخلية؛ وأعربت هو أيضا كنموذج افرازية، وكذلك. ومع ذلك، يعرف الكثير عن وظيفتها في تشكيل بيوفيلم.

والغرض من هذه المخطوطة هو القيام مقايسة سريعة ويمكن الاعتماد عليها لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم التي لا تتطلب عزل البروتين. استخدام الفوسفات p-نيتروفينيل (بنب) كركيزة، قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم شكلت في لوحات زراعة الأنسجة 96-جيدا. نشاط يستند تشكيل رد فعل للذوبان المنتج تقاس 405 نانومتر امتصاص. طبيعة إنتاجية عالية الأسلوب لوحة 96 زراعة الأنسجة جيدا يوفر طريقة حساسة واستنساخه لفحوصات نشاط حزب العمال الأسترالي. كما يمكن توسيع نفس تجريبي إعداد لقياس المؤشرات الجزيئية خارج الخلية الأخرى المتصلة بتشكيل بيوفيلم.

Introduction

وأعرب الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) هو أوبيكويتوسلي في كل خلايا بدائية وحقيقية النواة¹. فإنه يمكن تحفيز التحلل الأدينوزين من جزيئات مختلفة مثل النيوكليوتيدات والقلويات، استرات الفوسفات والبروتينات أو أملاحه من حامض الفوسفوريك. في البشر، وألب حقيقية النواة الحالية في العديد من الأنسجة بما فيها الكبد والعظام و الأمعاء والمشيمة². وهي تلعب أدواراً هامة في الفسفرة البروتين ونمو الخلايا، والمبرمج، وعمليات الخلايا الجذعية، فضلا عن تمعدن الهيكل العظمى العادي. الب حقيقية النواة أيضا مؤشر مصل رئيسية لوجود أمراض في العظام والكبد والأنسجة/الأجهزة الأخرى عند ارتفاع^3،4.

تم الكشف عن الب بدائية في مجموعة متنوعة من الخلايا البكتيرية، بما في ذلك كولاي⁵و المذهبة س.^6،7 وبعض البكتريا الكرش الشائعة في التربة⁸. وقد استخدمت البكتيرية الب النشاط بيوسينسور في الكشف عن مبيدات الآفات والمعادن الثقيلة⁹ والتلوث البكتيري¹⁰. وقد استخدمت التعبير التأسيسي لحزب العمال الأسترالي لتحديد العنقوديات¹¹ والتفريق بين السراتية عن¹². ومن المقترح كذلك أن التأسيسي الب الإنتاج يرتبط بالقدرة الإمراضية في العنقوديات¹³. على الرغم من أن حزب العمال الأسترالي ودرست في إعدادات مختلفة^3،4، بعد قليل يقال للدالة في الثقافات الأغشية الحيوية والنشاط.

وتم توثيق بيوفيلم لحياة بكتيرية تعمل بشكل مختلف بالمقارنة نظيره الخلايا البكتيرية الشرانق¹⁴. في المذهبة س.، تم التعرف على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية وحسابات لمقاومة المضادات الحيوية والتهاب مزمن^15،16. أبلغ العديد من الجزيئات التي يمكن العثور عليها في مصفوفة بيوفيلم مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون، ولكن هذه الآلية لتشكيل بيوفيلم ليست مفهومة تماما¹⁴. لفهم دور الب في تشكيل بيوفيلم، مثقف الأغشية الحيوية في المذهبة س. في 96 زراعة الأنسجة ولوحات، وقياس النشاط الب باستخدام الفقرة--نيتروفينيلفوسفاتي (بنب).

بنب جزيء هو ركيزة جاهزة للاستخدام لحزب العمال الأسترالي، وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس الب النشاط^6،،من¹⁷¹⁸. يستند هذا الفحص اللونية تحويل فوسفات نيتروفينيل الفقرة (بنب) إلى الفقرة-نيتروفينول أسفر عن منتج ملونة في 405 نانومتر. مقارنة بسائر الإنزيم الب التقليدية، مثل [اغروس] هلام التفريد¹⁹، جرثومة القمح أجلوتينين (WGA) هطول الأمطار، ووغ-[هبلك]²⁰، هذا التحليل محددة للغاية، حساسة، سهلة للتكاثر، ومعظم الأهم من ذلك، يسمح لارتفاع سرعة النقل.

Protocol

1-إعداد متوسطة

1. تحضير 1 لتر من مرق الصويا تريبتيك (TSB): إضافة إلى 1 لتر من الماء المقطر، 15 غرام خلاصة البنكرياس الكازين، 5 غ خلاصة بابيك فول الصويا، والجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام من سكر العنب و 2.5 غرام من فوسفات ديبوتاسيوم. تعقيمها قبل الاستخدام.
2. إضافة لاجار الصويا تريبتيك (TSA)، 15 غراما أجار إلى 1 لتر TSB، اﻷوتوكﻻف. ثم ندعه يبرد وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، صب بنسبة 20 مل في طبق بتري (100 ملم × 15 ملم).
3. بيوفيلم الثقافة المتوسطة: إضافة 10 جرام جلوكوز إلى 1 لتر TSB يعقم. تعقيم بالترشيح باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون.

2-"تشكيل بيوفيلم" S. aureus في لوحة زراعة الأنسجة جيدا 96

ملاحظة: هو مثقف بيوفيلم المذهبة س. كما هو موضح سابقا^6،21.

1. تطعيم مستعمرة فردية واحدة في المذهبة س. من حساب السياحة الفرعي في 10 مل لجان وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل TSB/الجلوكوز (10 غرام/لتر) بنسبة 1: 100 (v/v). الدوامة بلطف مزيج لتركيز متسقة.
3. نقل 200 مل ثقافة المخفف إلى ما مجموعة 18 بئرا (أكثر للمجموعات التجريبية، مثل عنصر تحكم غير بيوفيلم لتشير إلى وجود علاقة ل نشاط حزب العمال الأسترالي⁶) من لوحة واحدة 96 جيدا. استخدم ثلاثة توائم لكل نقطة الوقت: 0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة ودقيقة 75. راجع الخطوة رقم 3.2.
4. احتضان 96 لوحة جيدا في 37 درجة مئوية ح 24 عن بيوفيلم تشكيل^6،21.
5. صب المادة طافية بالطموح.
6. تغسل كل جيدا مع 1 × الحل الفوسفات مخزنة (PBS، درجة الحموضة 7.4)، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 15,000 س ز وصب المادة طافية بالطموح.

3-قياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم

ملاحظة: وتم قياس نشاط حزب العمال الأسترالي ك وصف^6،18.

1. إضافة 75 مل الركازة الب مخزنة تتألف من بنب المتاحة تجارياً لكل بئر من الخطوة 2.6 وبدء تسجيل الوقت. تسجيل كل نقطة الوقت في ثلاث نسخ.
2. بعد حضانة لوقت متنوعة: 0 دقيقة (تحكم) 15 دقيقة، 30 دقيقة، 45 دقيقة، 60 دقيقة و 75 دقيقة على التوالي، إضافة ميليلتر 75 من هيدروكسيد الصوديوم م 5 التوقف عن رد فعل.
3. الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 15,000 س ز.
4. نقل 100 ميليلتر من المادة طافية في لوحة جيدا 96 جديدة للقياس اللونية.
5. قياس امتصاص كل جيدا في 405 نانومتر باستخدام لوحة 96 كذلك القارئ. استخدام الوقت 0 دقيقة نقطة الآبار للسيطرة على 405 الضوضاء الخلفية في شمال البحر الأبيض المتوسط.
6. تكرار التجربة كاملة في ثلاث لوحات جيدا 96 الفردية.

النتائج

ويبين الشكل 1 نتيجة نشاط حزب العمال الأسترالي من الثقافات بيوفيلم في المذهبة س. ممثل في 96 زراعة الأنسجة ولوحات. ميكروليتر 75 من الحلول المتاحة تجارياً بنب أضيفت إلى كل خير والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة للأوقات المختلفة (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 د?...

Discussion

في أعمالنا المقايسة، استخدمنا بنب الركيزة الب. هذا حل عمل المصممة لإليزا ولا تمييع المسبق. بعد التحلل من حزب العمال الأسترالي، يطور منتج أصفر ويمكن أن يقاس في 405 نانومتر. في نهاية رد فعل الانزيمية، نحن بإيجاز تثفيل 96 لوحة جيدا ونقل المادة طافية إلى صفيحة جيدا 96 جديدة لقياس امتصاص استخدام قا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................  2.50 Dipotassium phosphate..................2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom