Colorimetrico analisi di alcalino fosfatasi attività in Biofilm di S. aureus

Riepilogo

In questo manoscritto, abbiamo stabilito un metodo di alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina nella coltura di biofilm di S. aureus dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti

Abstract

Fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima comune espresso in cellule sia procariote ed eucariote. Esso catalizza l'idrolisi di monoesteri di fosfato da molte molecole a base pH e svolge un ruolo indispensabile nel metabolismo del fosfato. In esseri umani, eucariotiche ALP è uno dei segnali enzimatici maggiormente utilizzati nella diagnosi di varie malattie, quali la colestasi ed il rachitismo. In S. aureus, ALP è rilevato esclusivamente sulla membrana cellulare; essa si esprime anche come una forma secretiva pure. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la sua funzione nella formazione del biofilm.

Lo scopo di questo manoscritto è quello di sviluppare un'analisi rapida e affidabile per misurare l'attività ALP nel biofilm di S. aureus che non richiedono l'isolamento di proteine. Utilizzando p-nitrofenil fosfato (pNPP) come substrato, abbiamo misurato ALP attività in biofilm di S. aureus formata in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Attività si basava sulla formazione del prodotto solubile reazione misurata di assorbanza di 405 nm. La natura elevato throughput del metodo della piastra di coltura del tessuto ben 96 fornisce un metodo sensibile e riproducibile per analisi di attività ALP. Lo stesso sperimentale istituito può essere esteso anche per misurare altri marcatori molecolari extracellulare legate alla formazione del biofilm.

Introduzione

Fosfatasi alcalina (ALP) è espressa ubiquitariamente in entrambe le cellule procariote ed eucariote¹. Esso può catalizzare l'idrolisi di monofosfato da diverse molecole come nucleotidi, proteine, alcaloidi, esteri fosforici e anidridi di acido fosforico. In esseri umani, ALP eucariotica è presente in molti tessuti compreso fegato, ossa, intestino e placenta². Svolge i ruoli importanti nella fosforilazione della proteina, crescita cellulare, apoptosi, i processi delle cellule staminali come pure normale mineralizzazione scheletrica. Eucariotiche ALP è anche un indicatore chiave del siero per la presenza di malattie in ossa, fegato e altri tessuti/organi quando elevati^3,4.

Prokaryotic ALP è stato rilevato in una varietà di cellule batteriche, tra cui⁵di e. coli, Staphylococcus aureus^6,7 e alcuni comuni batteri ruminali in suoli⁸. Attività batterica ALP è stato usato come un biosensore nella rilevazione di pesticidi, metalli pesanti⁹ e¹⁰di contaminazione batterica. L'espressione costitutiva di ALP è stato utilizzato per identificare gli stafilococchi¹¹ e per differenziare Serratia da Enterobacter¹². Più ulteriormente è suggerito che la produzione costitutiva di ALP è correlato con patogenicità in stafilococchi¹³. Anche se ALP è stato studiato in diverse impostazioni^3,4, ancora poco è segnalato per la sua attività e la funzione nelle culture di biofilm.

Un biofilm è stato documentato per avere una vita batterica in modo diverso funzionamento rispetto ai suoi dissipati cellula batterica controparte¹⁴. In S. aureus, la formazione del biofilm è stata identificata in una varietà di condizioni cliniche e conti per la resistenza agli Antibiotico e l'infiammazione cronica^15,16. Molte molecole erano stati segnalati per essere trovato in una matrice di biofilm come polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi, ma il meccanismo di formazione del biofilm non è pienamente compreso¹⁴. Per comprendere il ruolo di ALP nella formazione del biofilm, abbiamo coltivato i biofilm di S. aureus in 96 piatti di coltura di tessuto ben e misurato l'ALP attività utilizzando para-nitrophenylphosphate (pNPP).

La molecola pNPP è un substrato di ready-to-use per l'Alpe ed è stato ampiamente usato per misurare ALP attività^6,17,18. Questo saggio colorimetrico si basa sulla conversione del para-nitrofenil fosfato (pNPP) a para-nitrofenolo risultante in un prodotto colorato a 405 nm. Rispetto ad altri test ALP convenzionali, come l'elettroforesi¹⁹, germe di grano precipitazione dell'agglutinina (WGA), gel dell'agarosi e WGA-HPLC²⁰, questo test è altamente specifico, sensibile, facile da riprodurre e la maggior parte importante, consente ad alta velocità di trasmissione.

Protocollo

1. preparazione media

1. Preparare 1 L di brodo di soia triptico (TSB): in 1 L di acqua distillata, aggiungere 15 g di digerito pancreatico di caseina, 5 g di papaico di farina di soia, 3 g di cloruro di sodio, 2,5 g di destrosio e 2,5 g di fosfato dipotassico. Sterilizzare prima dell'uso.
2. Per Tryptic Soy Agar (TSA), aggiungere 15 g di agar a 1 L di TSB, autoclave. Poi lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente. Successivamente, versare in un rapporto di 20 mL per piastra di Petri (100 x 15 mm).
3. Terreno di coltura di biofilm: aggiungere 10 g di glucosio a 1 L di TSB in autoclave. Sterilizzare mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,2 µm.

2. formazione di Biofilm di S. aureus nella piastra di coltura del tessuto ben 96

Nota: Il biofilm di S. aureus è coltivato come precedentemente descritto^6,21.

1. Inoculare una colonia individuo di S. aureus da TSA in 10 mL di TSB e crescere durante la notte a 37 ° C.
2. Diluire la cultura pernottamento in 10 mL di TSB/glucosio (10 g/L) con un rapporto di 1: 100 (v/v). Vortice delicatamente a mescolare per una concentrazione costante.
3. Trasferire 200 mL di coltura diluita in un totale di 18 pozzetti (più per gruppi sperimentali, un tale controllo non-biofilm a suggerire una relazione di ALP attività⁶) dalla piastra ben uno 96. Utilizzare triplette per ogni punto di tempo: 0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min. Vedere il punto 3.2.
4. Incubare la piastra ben 96 a 37 ° C per 24 h per biofilm formazione^6,21.
5. Decantare il supernatante dall'aspirazione.
6. Lavare ogni bene con 1 x soluzione tamponata fosfato (PBS, pH 7.4), centrifugare per 5 min a 15.000 x g e decantare il supernatante dall'aspirazione.

3. misurazione dell'attività ALP nel Biofilm di S. aureus

Nota: Attività ALP è stata misurata come descritto^6,18.

1. Aggiungere 75 mL di tampone substrato ALP composto pNPP commercialmente disponibili in ciascun pozzetto da passo 2.6 e iniziare a registrare il tempo. Registrare ogni punto temporale in triplice copia.
2. Dopo incubazione per vario tempo: 0 min (controllo), 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min rispettivamente, aggiungere 75 µ l di NaOH M 5 per arrestare la reazione.
3. Centrifugare la piastra per 5 min a 15.000 x g.
4. Trasferire 100 µ l del surnatante in una nuova piastra ben 96 per misurazione colorimetrica.
5. Misurare l'assorbanza di ciascun bene a 405 nm utilizzando lettore di micropiastra a 96 pozzetti. Utilizzare il tempo 0 min scegliere pozzi controllo per rumore di fondo 405 nm.
6. Ripetere l'intero esperimento in tre singoli 96 pozzetti.

Risultati

La figura 1 Mostra un risultato rappresentativo dell'attività ALP da culture di biofilm di S. aureus in piastre di coltura tissutale ben 96. 75 μL di soluzione di pNPP commercialmente disponibile è stato aggiunto a ogni bene e incubate a temperatura ambiente. Dopo incubazione per diverse volte (0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min, rispettivamente) 75 μL di 5 M NaOH è stato aggiunto per arrestare la reazione. Il prodotto quindi è stato mi...

Discussione

Nella nostra analisi, abbiamo usato pNPP come il substrato ALP. Si tratta di una soluzione di lavoro progettata per ELISA e Nessuna diluizione è necessaria. Dopo l'idrolisi di ALP, un prodotto giallo si sviluppa e può essere misurato a 405 nm. Alla fine della reazione enzimatica, abbiamo brevemente centrifugato la piastra ben 96 e trasferito il surnatante in un piatto ben 96 fresco per misurare l'assorbanza utilizzando il lettore di piastra. Abbiamo trovato che questo passaggio di centrifugazione supplementare è fonda...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................  2.50 Dipotassium phosphate..................2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom