색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

요약

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립

초록

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. 미 에 균, ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.

이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.

서문

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포¹편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반²를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표^3,4.

간결한 ALP 토양⁸에서 대장균⁵, S. 구 균^6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균성 ALP 활동은 농약, 중 금속⁹ 및 세균 오염¹⁰의 검출 바이오 센서로 사용 되었습니다. ALP의 제정 식 포도 상 구 균¹¹ 을 식별 하 고 Serratia Enterobacter¹²에서 차별화 하는 데 사용 되었습니다. 그것은 추가 제정 ALP 생산 포도 상 구 균¹³pathogenicity와 상관은 좋습니다. ALP 다른 설정^3,4, 공부는 비록 아직 약간 biofilms 문화에 그것의 기능과 활동에 대 한 보고 됩니다.

Biofilm는 그것의 자유 롭 살아있는 세균성 세포 대응¹⁴에 비해 다르게 작동 세균성 생활을 문서화 되었습니다. S. 구 균, biofilm의 형성 다양 한 임상 조건 및 항 생 저항 및 만성 염증^15,16에 대 한 계정에서에서 확인 되었습니다. 많은 분자 등 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질, biofilm 매트릭스에서 찾을 수 보고 왔다 하지만 biofilm 형성의 메커니즘은 완전히 이해¹⁴. Biofilm 형성에서 ALP의 역할을 이해 하려면 우리 미 균 biofilms 96 잘 조직 배양 접시에 배양 하 고 파라-nitrophenylphosphate (pNPP)를 사용 하 여 높은 산 활동 측정.

분자 pNPP 높은 산에 대 한 준비-사용 기판 이며 ALP 활동^6,,1718측정에 널리 사용 되었습니다. 이 색도계 분석 결과 파라 nitrophenyl 인산 염 (pNPP)의 변환에 파라-nitrophenol 405에서 색된 제품의 결과를 기반으로 nm. 와 같은 agarose 젤 전기 이동 법¹⁹, 밀 세균 agglutinin (WGA) 강 수, WGA HPLC²⁰이 분석 결과 매우 구체적인 다른 기존의 ALP 분석 결과에 비해, 민감한, 쉽게 재현, 그리고 가장 중요 한 것은, 허용 높은 처리량입니다.

프로토콜

1. 매체 준비

1. 1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.
2. TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비율로 붓는 다.
3. Biofilm 문화 매체: 압력가 TSB의 1 리터에 포도의 10 g를 추가. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 여과 하 여 소독.

2. 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 Biofilm 형성

참고: S. 구 균 biofilm는 앞에서 설명한^6,21으로 교양 이다.

1. TSB의 10 mL에 TSA에서 S. 구 균 에의 한 개별 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 성장
2. 1: 100 (v/v) 비율로 TSB/포도 당 (10 g/L)의 10 mL에 숙박 문화를 희석. 일관 된 농도 대 한 혼합을 부드럽게 소용돌이.
3. 한 96 잘 접시에서 18 우물 (실험 그룹, ALP 활동⁶관계 제안 비 biofilm 컨트롤에 대 한 더 많은)의 총에 희석 문화의 200 mL를 전송. 세 쌍둥이 사용 하 여 각 시간 포인트: 0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분. 3.2 단계를 참조 하십시오.
4. Biofilm 형성^6,2124 h에 대 한 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.
5. 열망 하 여는 상쾌한을 가만히 따르다.
6. 각 씻어 잘 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS, pH 7.4) x 1, 15000 x g 에 5 분 동안 원심과 포부에 의해는 상쾌한 가만히 따르다.

3. S. 구 균 Biofilm에서 ALP 활동의 측정

참고: ALP 활동 설명된^6,18로 측정 되었다.

1. 버퍼링 된 ALP 기판 단계 2.6에서에서 각 잘 상용 pNPP의 구성의 75 mL를 추가 하 고 시간 기록을 시작 합니다. 3 중에 각 시간 포인트를 기록 합니다.
2. 다양 한 시간에 대 한 부 화 후: 0 분 (제어), 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분 각각 75 µ L 반응을 중지를 5 M NaOH의 추가.
3. 15000 x g에 5 분 동안 접시 원심
4. 색도계 측정을 위한 새로운 96 잘 접시에 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.
5. 각각의 흡 광도 측정 405 nm를 사용 하 여에서 잘 한 96 잘 접시 리더. 0 분 시간을 사용 하 여 405 nm 배경 잡음에 대 한 제어를 우물을 가리킨.
6. 3 개별 96 잘 접시에서 전체 실험을 반복 합니다.

결과

그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 ...

토론

우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................  2.50 Dipotassium phosphate..................2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom