Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

Resumo

Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos

Resumo

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) é uma enzima comum expressada em células procariotas e eucariotas. Ele catalisa a hidrólise de monoésteres de fosfato de muitas moléculas em pH básico e desempenha um papel indispensável no metabolismo de fosfato. Nos seres humanos, eucariótica ALP é um dos sinais de enzimática mais frequentemente utilizados no diagnóstico de várias doenças, tais como colestase e raquitismo. Em S. aureus, ALP é detectado exclusivamente na membrana celular; também é expressa como uma forma secretória também. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na formação de biofilme.

O objetivo deste manuscrito é desenvolver um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP em S. aureus biofilme que não necessita de isolamento da proteína. Usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato, medimos a atividade da ALP em S. aureus biofilme formado em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Atividade baseou-se na formação do produto solúvel reação medido por 405 absorvância nm. A natureza de alta taxa de transferência do método 96 cultura pocos placa fornece um método sensível e reprodutível para ensaios de atividade ALP. O mesmo experimental setup também pode ser estendido para medir outros marcadores moleculares extracelulares relacionados à formação de biofilme.

Introdução

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ubiquitously é expresso em ambas as células procariotas e eucariotas¹. Isso pode catalisar a hidrólise de monofosfato de moléculas diferentes, tais como nucleotídeos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato e anidridos de ácido fosfórico. Em humanos, ALP eucariótica está presente em muitos tecidos, incluindo fígado, ossos, intestino e placenta². Ela desempenha papel importante na fosforilação de proteínas, bem como do crescimento celular, apoptose, processos de células-tronco e mineralização óssea normal. Eucariótica ALP é um indicador chave do soro para a presença de doenças nos ossos, fígado e outros tecidos/órgãos quando elevada^3,4.

ALP procariótica foi detectada em uma variedade de células bacterianas, incluindo e. coli⁵,^6,de S. aureus⁷ e algumas bactérias do rúmen comum no solos⁸. Atividade bacteriana de ALP tem sido usada como um biossensor na detecção de pesticidas, metais pesados⁹ e contaminação bacteriana¹⁰. A expressão constitutiva de ALP tem sido usada para identificar os estafilococos¹¹ e para diferenciar Serratia Enterobacter¹². Sugere-se ainda mais que a produção de ALP constitutiva está correlacionada com patogenicidade em estafilococos¹³. Embora o ALP tem sido estudada em diferentes configurações^3,4, ainda pouco é relatado pela sua atividade e função em culturas de biofilmes.

Um biofilme tem sido documentado para ter uma vida diferente funcionamento bacteriana em comparação com o seu homólogo de vida livre célula bacteriana¹⁴. Em S. aureus, a formação de biofilme foi identificada em uma variedade de condições clínicas e contas para a resistência aos antibióticos e inflamação crônica^15,16. Muitas moléculas tinham sido relatadas para ser encontrado em uma matriz de biofilme como polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios, mas o mecanismo de formação de biofilme não é totalmente compreendida¹⁴. Para entender o papel de ALP na formação de biofilmes, nós cultivadas biofilmes de S. aureus em placas de cultura de pocos 96 e mede a atividade ALP usando pará-nitrofenilfosfato (pNPP).

A molécula pNPP é um substrato de ready-to-use para ALP e tem sido amplamente utilizado para medir a atividade ALP^6,17,18. Este ensaio colorimétrico baseia-se na conversão de pará-nitrofenil fosfato (pNPP) para pará-nitrofenol, resultando em um produto colorido em 405 nm. Comparado a outro ensaio ALP convencional, tais como eletroforese¹⁹, precipitação de aglutininas (WGA) de germe de trigo, do gel de agarose e WGA-HPLC²⁰, este ensaio é altamente específico, sensível, fácil de reproduzir e mais importante, permite para alta taxa de transferência.

Protocolo

1. preparação média

1. Preparar 1 L de Tryptic Soy caldo (TSB): em 1 L de água destilada, adicione 15 g de digerir pancreático de caseína, 5g de papaic digest de farelo de soja, 3 g de cloreto de sódio, 2,5 g de dextrose e 2,5 g de fosfato dipotássico. Esterilize antes do uso.
2. Para Tryptic Soy Agar (TSA), adicione 15 g de ágar-ágar para 1 L de TSB, autoclave. Então deixe esfriar até a temperatura de quarto. Em seguida, despeje em uma proporção de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).
3. Meio de cultura de biofilme: adicionar 10 g de glicose para 1 L de TSB autoclavado. Esterilize por filtração através de um filtro de 0,2 µm.

2. formação de biofilmes de S. aureus na placa de cultura de tecido bem 96

Nota: O biofilme de S. aureus é cultivado como descrito anteriormente,^6,21.

1. Inocular uma colônia individual de S. aureus de TSA em 10 mL de TSB e crescer durante a noite a 37 ° C.
2. Dilua a cultura durante a noite em 10 mL de TSB/glicose (10 g/L) na proporção de 1: 100 (v/v). Vórtice suavemente a mistura para uma concentração consistente.
3. Transferi 200 mL de cultura diluída em um total de 18 poços (mais para grupos experimentais, um controle de não-biofilme que sugerem uma relação com atividade ALP⁶) de um 96 prato bem. Use trigêmeos para cada ponto de tempo: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min. Consulte a etapa 3.2.
4. Incube a placa bem 96 a 37 ° C por 24 h para a formação de biofilme^6,21.
5. Decante o sobrenadante por aspiração.
6. Cada um Lave bem com 1 x solução de tampão fosfato (PBS, pH 7,4), centrifugue por 5 min a 15.000 x g e decante o sobrenadante por aspiração.

3. medida da atividade da ALP em S. aureus biofilme

Nota: Atividade ALP foi medida como descrito^6,18.

1. Adicione 75 mL de substrato ALP tamponado consistindo pNPP comercialmente disponível para cada poço da etapa 2.6 e começar a gravar o tempo. Grave cada ponto do tempo em triplicado.
2. Após a incubação por um tempo variado: 0 min (controle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min respectivamente, adicionam 75 µ l de 5 M NaOH para parar a reação.
3. Centrifugue a placa durante 5 min à 15.000 x g.
4. Transferi 100 µ l do sobrenadante para um novo prato bem 96 para medição colorimétrica.
5. Medir a absorvância de cada bem em 405 nm usando um 96 placa bem leitor. Use o tempo min 0 ponto poços de controle para o ruído de fundo 405 nm.
6. Repita todo o experimento em três individuais 96 placas bem.

Resultados

A Figura 1 mostra um resultado representativo da atividade da ALP de biofilme culturas de S. aureus em placas de cultura de pocos 96. 75 μL de solução de pNPP disponível comercialmente foi adicionado para cada bem e incubados à temperatura ambiente. Após incubação de diferentes épocas (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min, respectivamente) 75 μL de 5 M de NaOH foi adicionado para parar a reação. O produto então foi medido em um...

Discussão

No nosso ensaio, usamos pNPP como o substrato ALP. Esta é uma solução de trabalho projetada para ELISA e a diluição não é necessária. Após a hidrólise por ALP, um produto amarelo desenvolve e pode ser medido em 405 nm. No final da reação enzimática, brevemente centrifugadas a placa bem 96 e transferido o sobrenadante para um prato bem 96 fresco para medir a absorvância usando o leitor de placa. Achamos que essa etapa de centrifugação extra é crítica, pois aumenta a consistência de absorbância em 405 n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................  2.50 Dipotassium phosphate..................2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom