JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

اشتقاق الفلافونول أمر بالغ الأهمية لتطبيقه في الرعاية الصحية وصناعة الأغذية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للتخليق البيولوجي للفلافونول من الفلافانون ومناقشة الخطوات الحاسمة ومزاياه على النهج الأخرى.

Abstract

الفلافونول هي فئة فرعية رئيسية من الفلافونويدات مع مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية والدوائية. هنا، ونحن نقدم طريقة للتوليف الأنزيمي في المختبر من الفلافونول. في هذه الطريقة ، يتم استنساخ Atf3h و Atfls1، وهما الجينات الرئيسية في المسار التركيبي الحيوي للفلافونول ، ومبالغ فيها في الإشريكية القولونية. يتم تنقية الإنزيمات المؤتلفة عن طريق عمود تقارب ثم يتم إنشاء سلسلة بينزيمية في مخزن اصطناعي محدد. يتم تصنيع اثنين من الفلافونول في هذا النظام كأمثلة ويتم تحديدها من قبل تحليل TLC وHPLC/LC/MS. طريقة يظهر مزايا واضحة في اشتقاق الفلافونول على النهج الأخرى. وهو موفر للوقت والعمالة وعالي الفعالية من حيث التكلفة. رد الفعل من السهل أن يتم التحكم فيها بدقة وبالتالي رفع مستوى الإنتاج الضخم. يمكن تنقية المنتج المستهدف بسهولة بسبب المكونات البسيطة في النظام. ومع ذلك، عادة ما يقتصر هذا النظام على إنتاج الفلافونول من الفلافانون.

Introduction

الفلافونول هي فئة فرعية رئيسية من الفلافونويدات النباتيةوتشارك في تطوير النبات والتصبغ 1،2،3. والأهم من ذلك، تمتلك هذه المركبات مجموعة واسعة من الأنشطةالصحية المفيدة، مثل مكافحة السرطان 4،5،المضادة للأكسدة6،المضادة للالتهابات7،الضدية8،المضادة لارتفاع ضغط الدم9 ، وخصائص استدعاء الذاكرة10، مما يؤدي إلى عدد كبير من الدراسات على هذه الأيض الثانوية المشتقة من النبات. تقليديا، هذه المركبات مشتقة أساسا من استخراج النبات باستخدام المذيبات العضوية. ومع ذلك، نظرا لمحتوياتها منخفضة جدا في النباتات11،12،13،وتكلفة الإنتاج لمعظم الفلافونول لا تزال مرتفعة، مما يفرض قيودا كبيرة على تطبيقها في الرعاية الصحية والغذاء الصناعه.

خلال العقود الماضية، وقد وضعت العلماء عدد لا بأس به من الطرق لاستخلاص الفلافونويدات14،15. ومع ذلك، فإن التركيب الكيميائي لهذه الجزيئات المعقدة تمتلك مجموعة متنوعة من العيوب الجوهرية16. فإنه يتطلب ليس فقط الكواشف السامة وظروف رد الفعل الشديد، ولكن أيضا العديد من الخطوات لإنتاج مركب الفلافونويد الهدف14،17. وعلاوة على ذلك، هناك تحد هام آخر في هذه الاستراتيجية هو التوليف تشيرال لجزيئات الفلافونويد النشطة. ولذلك، فإنه ليس استراتيجية مثالية لإنتاج الفلافونويدات على نطاق تجاري عن طريق التركيب الكيميائي16،17.

في الآونة الأخيرة، وضعت العلماء استراتيجية بديلة واعدة لإنتاج هذه المركبات الطبيعية المعقدة عن طريق الميكروبات الهندسية مع مسار للتخليق البيولوجي الفلافونويد18،19،20، 21 , 22، والتي تم فكها بنجاح في النباتات23. على سبيل المثال، قدم دوان وآخرون مسار احيائي التركيب ية في الخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي لإنتاج kaempferol (KMF)24. مالا وآخرون أنتجت استراغالين، الفلافونول غليكوزيلاتيد، من خلال إدخالفلافانون 3-هيدروكسيلاز (f3h)،فلافونول synthase(fls1)،وUDP-الجلوكوز: الفلافونويد 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 الجينات في الجينات UGT78K1 إيتشيريشيا كوليBL21 (DE3)17. على الرغم من أن هناك عدد غير قليل من النماذج، وليس كل الميكروبات المهندسة وراثيا تنتج المنتجات ذات الأهمية بسبب تعقيد منصة الخلوية، وعدم التوافق بين العناصر الوراثية توليفها بشكل مصطنع والمضيفين، والمثبطة تأثير المنتجات المستهدفة ضد الخلايا المضيفة، وعدم استقرار النظام الخلوي المهندس نفسه16.

وثمة استراتيجية بديلة واعدة أخرى لإنتاج الفلافونويد هي إنشاء سلسلة متعددة الأنزيمات في المختبر. وقد ذكرت تشنغ وآخرون أن الإنتروزين polyketides يمكن توليفها بنجاح عن طريق تجميع مسار الأنزيمية كاملة في وعاء واحد25. هذه الاستراتيجية الاصطناعية خالية من الخلايا يتحايل على القيود المفروضة على مصنع إنتاج الميكروبات، وبالتالي هو ممكن لإنتاج بعض الفلافونويدات في كمية كبيرة16.

في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير بنجاح نظام ثنائي الإنزيم الاصطناعية لتحويل naringenin (NRN) إلى KMF في وعاء واحد16. هنا، ونحن نصف هذا النظام في تفاصيل كبيرة والأساليب التي ينطوي عليها تحليل المنتجات. كما نقدم مثالين يستخدمان هذا النظام لإنتاج KMF من NRN وquercetin (QRC) من eriodictyol (ERD). وبالإضافة إلى ذلك، نناقش الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب والاتجاهات البحثية المستقبلية في التركيب الحيوي للفلافونويدات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عزل مجموع الحمض النووي الريبي من الأنسجة النباتية26،27

  1. تجانس أنسجة النبات.
    1. جمع 100 ملغ من الأنسجة النباتية الطازجة (على سبيل المثال، شتلات 4 أسابيع من أرابيدوبس ثاليانا). تجميد الأنسجة والآفات وقذائف الهاون مع النيتروجين السائل، تليها طحن الأنسجة إلى مسحوق.
    2. أضف 1 مل من كاشف عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدولالمواد) في هاون. سيتم تجميد الكاشف على الفور. تجانس عينة الأنسجة مع الآفة عندما يذوب الكاشف المجمدة.
    3. نقل التجانس إلى أنبوب 1.5 مل، الطرد المركزي العينة في 12،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، ومن ثم نقل محلول التجانس تطهيرها إلى أنبوب جديد آخر 1.5 مل.
    4. حضانة عينة متجانسة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. عزل الجيش الملكي النيبالي الكلي.
    1. إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم إلى التجانس، وغطاء الأنبوب بشكل آمن، يهز الأنبوب بقوة باليد لمدة 15 ث، واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. طرد مركزي العينة في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية ونقل المرحلة المائية العليا عديم اللون إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. وتنقسم العينة إلى ثلاث مراحل بعد الطرد المركزي.
    3. إضافة 0.5 مل من الكحول ايزوبروبيل إلى المرحلة المائية، يهز الأنبوب باليد بطريقة قوية، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    4. طرد مركزي الخليط في 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant.
    5. غسل بيليه RNA مرة واحدة مع 1 مل من الإيثانول 75٪ عن طريق الدوامة، تليها الطرد المركزي في 7500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    6. كرر الخطوة 1.2.5.
    7. الهواء يجف بيليه لمدة 5-10 دقائق وإعادة حل الحمض النووي الريبي في diethylpyrocarbonate (DEPC) معالجة المياه عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، تليها قياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي مع مقياس الطيف الدقيق (انظر جدولالمواد).

2- توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA)28

  1. توليف حبلا الأول من cDNA باستخدام مجموعة (انظر جدول المواد). إعداد نظام رد فعل 20 درجة مئوية كما هو مبين في الجدول 1 واحتضان أنبوب التفاعل في جهاز PCR لمدة 50 دقيقة عند 42 درجة مئوية، تليها إنهاء رد الفعل عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
الكواشفحجم
dNTP ميكس، 2.5mM لكل4.0 ميكرولتر
التمهيدي ميكس2.0 ميكرولتر
قالب RNA1.0 ميكروغرام
عكس النسخ العازلة، 5 ×4.0 ميكرولتر
نسخ عكسي، 200 درجة مئوية/ميكرول1.0 ميكرولتر
RNase خالية H2Oحتى 20.0 ميكرولتر

الجدول 1: النسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي

3- بناء بلازميدات مؤتلفة29

  1. تصميم التمهيديات PCR.
    1. تصميم التمهيديات PCR باستخدام برنامج (انظر جدولالمواد) استنادا إلى تسلسل الجينات الإنزيم الرئيسية التي تم الحصول عليها من قاعدة بيانات GenBank وتوليف التمهيديات من قبل الشركة (انظر جدولالمواد). في نهاية 5 'من التمهيدي، إضافة موقع إنزيم تقييد (على سبيل المثال، باممرحبا أو RI البيئيةفي هذا البروتوكول).
      ملاحظة: ترد المواد التمهيدية المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول2.
تسلسل، 5' → 3'الغرض
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTGACTالتمهيدي إلى الأمام لتضخيم PCR من الجينات Atf3h من أرابيدوبسي ثاليانا. بام يتم وضع موضع الاتصال بموضع الاتصال بموضع الاتصال وإرفاقه للاستنساخ إلى pET32a(+).
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGTCGAالتمهيدي العكسي لتضخيم PCR من الجينات Atf3h من A. thaliana. منظمة التعاون الاقتصادي موقع RI مائل ومتصل للاستنساخ إلى pET32a(+).
AAGGATCCATGGAGGTCGAAGTCCAالتمهيدي إلى الأمام لتضخيم PCR من الجينات Atfls1 من A. thaliana. بام يتم وضع موضع الاتصال بموضع الاتصال بموضع الاتصال وإرفاقه للاستنساخ إلى pET32a(+).
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTATالتمهيدي العكسي لتضخيم PCR من الجينات Atfls1 من A. thaliana. منظمة التعاون الاقتصادي موقع RI مائل ومتصل للاستنساخ إلى pET32a(+).

الجدول 2: المواد التمهيدية Oligonucleotide المستخدمة في الدراسة الحالية

  1. استنساخ الجينات في ناقلات التعبير prokaryotic.
    1. تضخيم الجينات من حبلا الأول من cDNA توليفها باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة (انظر جدول المواد). إعداد نظام تفاعل PCR 100-ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 3 وتشغيل دورة PCR التالية: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة للإزالة الأولية؛ ثم 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية للتخفيف، 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة للصلب، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة للتمديد؛ يليها استطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: وقت التمديد متغير ويتم تحديده من قبل طول الجينات مع البلمرة من حوالي 1000 قاعدة في الدقيقة لمعظم البلمرة الحمض النووي.
    2. تصور منتجات PCR (الأكثر شيوعا 5 μL) على هلام أجاروز 1٪ وتنقية جزء الحمض النووي محددة من المنتجات المتبقية باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي (انظر جدول المواد).
    3. هضم جزء الحمض النووي النقي والمتجه (على سبيل المثال، pET-32a(+)) مع إنزيمات تقييدية (على سبيل المثال، بامهاي أو EcoRI في هذا البروتوكول). إعداد نظام رد فعل 50 درجة مئوية في أنبوب PCR 0.2 مل كما هو موضح في الجدول 4 واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 3 ح. فصل الحمض النووي المهضوم على هلام أغاروز 1٪.
    4. استعادة الفرقة الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام (انظر جدول المواد). مزيد من تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي (انظر جدولالمواد)، تليها قياس تركيز الحمض النووي مع مقياس الطيف الدقيق (انظر جدولالمواد).
    5. يُقلّب جزء الجينات إلى الحمض النووي المتجه الخطي باستخدام الليغاس الحمض النووي T4 (انظر جدولالمواد). إعداد رد فعل الربط في أنبوب 1.5 مل كما هو مبين في الجدول 5 واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2- 3 ساعة.
      ملاحظة: نسبة الأضراس إدراج إلى متجه متغير وتراوحت من 3:1 إلى 10:1.
    6. إضافة 2.5 ميكرولتر من خليط الربط في 50 درجة مئوية من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال، TOP10 أو DH5α)، مزيج بلطف، والحفاظ على أنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    7. إضافة 200 ميكرولتر من السائل LB المتوسطة دون المضادات الحيوية في الأنبوب واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية شاكر في 220 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
الكواشفحجم
Pfu ماستر ميكس، 2 ×50.0 ميكرولتر
التمهيدي إلى الأمام، 10 درجة مئوية4.0 ميكرولتر
عكس التمهيدي، 10 درجة مئوية4.0 ميكرولتر
محمد الني2.0 ميكرولتر
H2O40.0 ميكرولتر

الجدول 3: إنشاء نظام تفاعل تفاعل PCR

الكواشفحجم
جزء الحمض النووي / ناقلات3.0 ميكروغرام
بام مرحبا1.0 ميكرولتر
منظمة التعاون الاقتصادي ري1.0 ميكرولتر
Cutsmart العازلة، 10 ×5.0 ميكرولتر
H2Oحتى 50.0 ميكرولتر

الجدول 4: الهضم المزدوج لشظية/متجه الحمض النووي

الكواشفحجم
ادراجX ميكرولتر (0.09 pmol)
المتجهY μL (0.03 pmol)
الربط العازلة، 10 ×1.0 ميكرولتر
T4 DNA Ligase, 400 U/μL1.0 ميكرولتر
H2Oحتى 10.0 ميكرولتر

الجدول 5: ربط جزء من الجينات بمتجه خطي

  1. فحص المستعمرات الإيجابية.
    1. تلقيح مستعمرة واحدة من لوحة LB إلى 200 ميكرولتر من السائل LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين وحضانة في 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة لمدة 2 - 3 ساعة.
      ملاحظة: بشكل عام، اختيار 4-8 مستعمرات لفحص المستعمرات الإيجابية.
    2. إعداد رد فعل PCR مستعمرة 10 μL مماثلة لتلك الواردة في الخطوة 3.2.1.
      ملاحظة: استخدام 1 μL من ثقافة LB بدلاً من 1 μL من قالب cDNA.
    3. تصور منتجات PCR على هلام أغاروز 1٪. تلقيح الثقافة المتبقية مع نتيجة إيجابية في 3 مل من السائل LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين واحتضان في 37 درجة مئوية شاكر في 250 دورة في الدقيقة لمدة 14 - 16 ساعة.
    4. عزل الحمض النووي بلازميد من الثقافات القولونية المؤتلف ة باستخدام مجموعة miniprep بلازميد (انظر جدول المواد).
    5. تحديد بلازميدات المؤتلف النقية عن طريق تحليل إنزيم تقييد مزدوج (على سبيل المثال، باممرحبا وRI البيئيةفي هذا البروتوكول). إعداد نظام رد فعل 10 درجة مئوية مماثلة لتلك الواردة في الخطوة 3.2.3، تليها الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 3 ح. تصور الفرقة المحددة الصادرة من بلازميد المؤتلف على هلام أغاروز 1٪.
  2. تحقق من تسلسل بلازميدات المؤتلف ة الإيجابية.
    1. إرسال بلازميدات إلى شركة للتسلسل. تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل تسلسل الحمض النووي (راجع جدولالمواد) عن طريق مقارنة التسلسل الذي تم الحصول عليه من شركة التسلسل مع التسلسل المرجعي الذي تم الحصول عليه من قاعدة بيانات GenBank.

4. التعبير عن البروتينات الإنزيم المؤتلف30

  1. تحويل بلازميد المؤتلف الصحيح إلى المختصة E. القولونية BL21 (DE3).
    1. إضافة 0.1 ميكرولتر من بلازميد إلى 10 ميكرولتر من E. القولونية المختصة BL21 (DE3) في أنبوب 1.5 مل على الجليد والحفاظ على الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. صدمة الحرارة الخلايا في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ووضعها على الجليد مرة أخرى لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 200 درجة مئوية من السائل LB المتوسطة دون المضادات الحيوية وحضانة في 37 درجة مئوية شاكر في 220 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    4. نشر 50 درجة مئوية من التحول على لوحة أجار LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. حث على التعبير عن الجينات.
    1. تلقيح 3 - 5 مستعمرات من لوحة في أنبوب يحتوي على 3 مل من وسط السائل LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين وحضانة في 250 دورة في الدقيقة في شاكر 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. نقل كل من ثقافة بين عشية وضحاها في 300 مل من السائل LB المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين وحضانة في 250 دورة في الدقيقة في شاكر 37 درجة مئوية حتى الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر بين 0.4 - 0.6.
    3. إضافة isopropyl β-D-ثيوغالاكتوسيد (IPTG) في الثقافة مع تركيز نهائي من 0.2 mM والحث على التعبير عن الجينات في 250 دورة في الدقيقة، 20 - 22 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.

5. تنقية البروتينات الإنزيم المؤتلف31

  1. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي للثقافة في 4 درجة مئوية، 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
  2. إعادة تعليق بيليه في 15 مل من العازلة اللمعة البكتيرية التي تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100، 1 m EDTA, 10% الجلسرين, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.1 m PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin, and 1 μg/mL pepstatin in 50 mM Tris-Cl (pH 8.0).
  3. Sonicate تعليق البكتيرية لإطلاق البروتينات الإنزيم المؤتلف، تليها الطرد المركزي في 13،000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. حصاد وaliquot supernatant في أنابيب 1.5 مل في 1 مل / أنبوب وتخزينها في -70 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
  5. تطبيق 500 درجة مئوية من الراتنج تنقية له العلامة (انظر جدولالمواد) إلى عمود تقارب فارغة قابلة لإعادة الاستخدام. غسل الراتنج مع أحجام 5 سرير من الماء منزوع الأيونات لتجاهل الإيثانول في حل الأوراق المالية. قم بموازنة الراتنج مع أحجام 10 أسرّة للحاجز الملزم الذي يضم Tris-Cl (20 مم، ودرجة الحموضة 7.9)، وإيميدازول (10 م)، وNaCl (0.5 M).
  6. تطبيق 4 مل من supernatant من الخطوة 5.4 إلى الطين من الراتنج أعلاه وكتلة طرفي العمود مع سدادات.
  7. احتضان الخليط في 4 درجة مئوية على الدوار بسرعة منخفضة لمدة 2 ساعة.
  8. اغسل الراتنج المنضم بالبروتين الانصهاري مع 15 حجم سرير للحاجز الملزم عند درجة حرارة 4 درجة مئوية بمعدل تدفق قدره 1 مل/دقيقة قبل الإلتواء.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من عازلة elution (تحتوي على 20 mM Tris-Cl (درجة الحموضة 7.9)، 500 mM imidazole، 0.5 M NaCl) إلى العمود واحتضان الطين في 4 درجة مئوية على الدوار بسرعة منخفضة لمدة 10 دقائق.
  10. كرر الخطوة 5.5 أربع مرات أخرى.
  11. غسل الراتنج بالتتابع مع 10 أحجام السرير من المياه منزوعة الأيونات و 3 أحجام السرير من الإيثانول 20٪. نقع الراتنج في الإيثانول 20٪. حظر العمود مع سدادات وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  12. قياس تركيز البروتينات النقية عن طريق فحص بروتين برادفورد. تحديد نقاء البروتينات على هلام SDS-PAGE 10٪ وتصور العصابات من قبل اختبار البقع الزرقاء Coomassie.
  13. إضافة الجلسرين إلى محلول البروتين النقي إلى تركيز نهائي من 10٪ لتثبيت نشاط الإنزيم. Aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية.

6. إنتاج الفلافونول من فلافانون في نظام ثنائي الإنزيم فيالمختبر16

  1. إعداد المخازن المؤقتة.
    1. جعل 2X العازلة الاصطناعية دون كبريتات الحديدية تتكون من 200 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.2)، 16.4 مليون متر ألفا-كيتوغلوتاراك حمض، 0.8٪ أسكوربات الصوديوم، و 20٪ الجلسرين. حل 1.938 غرام من قاعدة تريس، 0.640 غرام من أسكوربات الصوديوم، 0.250 غرام من حمض α-ketoglutaric، و 16 مل من الجلسرين إلى 64 مل من الماء منزوع الأيونات. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 بواسطة حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) وإضافة الماء منزوع الأيونات تصل إلى 80 مل. تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
    2. جعل حل مخزون 100X من كبريتات الحديد 2 MM. إذابة 55.6 ملغ من كبريتات الحديد سباعي الهيدرات في 50 مل من الماء منزوع الأيونات، ويحرك، وإضافة الماء تصل إلى 100 مل.
    3. جعل حل الأسهم من الفلافونويد 25 mM. إذابة الفلافونويد في الميثانول جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد نظام الاصطناعية لإنتاج الفلافونول من فلافانون.
    1. إعداد النظام التركيبي كما هو مبين في الجدول 6.
    2. احتضان رد الفعل في 40 درجة مئوية في أنبوب مفتوح 2.0 مل في 600 دورة في الدقيقة (في كتلة الحرارة تهتز) لمدة 40 دقيقة.
    3. إنهاء رد الفعل عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من حمض الخليك و 100 ميكرولتر من خلات الإيثيل.
    4. بعد ساعتين، نقل المراحل العضوية إلى أنابيب 1.5 مل لتجفيف الهواء في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
الكواشفحجم
2 × العازلة الاصطناعية دون كبريتات الحديد50.0 ميكرولتر
25 مليون متر مربع فلافونول2.0 ميكرولتر
2 مليون متر كبريتات الحديد0.5 ميكرولتر
1 ملغ/مل أتف3H2.5 ميكرولتر
1 ملغ/مل أتفلس12.5 ميكرولتر
فلافانون 25 مليون متر2.0 ميكرولتر
H2Oحتى 100.0 ميكرولتر

الجدول 6: النظام التركيبي المستخدم في هذا البروتوكول.

7. تحليل المنتجات رد الفعل

  1. تحليل الطبقات الرقيقة (TLC).
    1. تجمع 5 أنابيب من عينات الفلافونويد من الخطوة 6.2.4 وتأخذ 300 ميكرولتر لتجفيف الهواء. إعادة حل مسحوق الفلافونويد في 160 ميكرولتر من الميثانول. إعداد عينات فلافونويد أصيلة بتركيزات تسلسلية تبلغ 12.5 و25 و50 و100 و200 نانوغرام/ميكرولتر في الميثانول. تحميل 1 ميكرولتر من عينات التفاعل وعينات الفلافونويد أصيلة على لوحات البولي أميد 6.
    2. تشغيل لوحات محملة العينة في نظام المذيبات التي تتألف من الكلوروفورم / الميثانول / خلات الإيثيل / حمض الفورميك بنسبة 5.0:1.5:1.0:0.5.
    3. الهواء يجف لوحات في درجة حرارة الغرفة. رش لوحات مع 1٪ محلول الإيثانولمنكلوريدمن كلوريد الألومنيوم (AlCl 3)، تليها تجفيف الهواء مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    4. بعد ثلاثين دقيقة، تصور البقع على لوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر واتخاذ الصور.
    5. تحليل القيمة الرمادية لكل بقعة على الصور باستخدام برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال، ImageJ v1.51j8 في هذا البروتوكول).
      1. افتح البرنامج ImageJ. انقر فوق ملف > فتح لفتح الصورة لتحليلها.
      2. انقر فوق اليسار معظم Rectangular أداة التحديد في واجهة المستخدم ImageJ. يُعرض مخطط المنطقة ذات الاهتمام (ROI) figure-protocol-17744 في الصورة باستخدام الماوس واضغط لتسمية عائد الاستثمار الأول.
      3. حرك التحديد المستطيل مع الماوس مباشرة إلى figure-protocol-17925 عائد الاستثمار التالي واضغط لتسمية عائد الاستثمار الثاني.
      4. كرر الخطوة السابقة لتسمية كافة ROIs الأخرى.
      5. اضغط figure-protocol-18122 لإنشاء قطع تعريف لكافة ROIs في نافذة منبثقة.
        ملاحظة: في هذا الوقت، سيتم تنشيط "أداة تحديد الخط المستقيم" في واجهة مستخدم ImageJ تلقائياً.
      6. استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خطوط أساسية لتحديد منطقة مغلقة لكل ذروة اهتمام.
      7. تنشيط أداة العصا بالنقر فوق الرمز المطابق في واجهة مستخدم ImageJ. انقر داخل الذروة لعرض النتائج لكافة القمم في نافذة منبثقة.
    6. جعل منحنى قياسي المستندة إلى TLC من الفلافونويد الأصلي عن طريق رسم القيم الرمادية من الخطوة 7.1.5.7 مقابل تركيزات الفلافونويد المقابلة من الخطوة 7.1.1. ثم، حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول وفقا للصيغة الناتجة.
  2. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) والكروماتوغرافيا السائلة/قياس الطيف الكتلي (LC/MS)
    1. معالجة العينات من الخطوة 7.1.1 بالتتابع من خلال 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    2. قم بتحميل العينات في نظام HPLC/LC/MS (انظر جدولالمواد) وفصل العينات عند 30 درجة مئوية باستخدام عمود C18 (4.6 × 150 مم؛ i.d., 5 μm). Elute العمود في 1.0 مل / دقيقة بتدرج من 10 - 85٪ (V / v) acetonitrile (ACN) في الماء (0 - 10 دقيقة، 10 - 25٪ ACN؛ 10 - 35 دقيقة، 25 -50٪ ACN؛ 35 - 45 دقيقة، 50 - 85٪ ACN؛ 45 - 50 دقيقة، 85 - 10٪ ACN؛ 50 - 60 دقيقة ، 10٪ ACN) ورصد امتصاص eluate من 200 إلى 800 نانومتر. إجراء تحليل LC/MS في وضع أيون سلبي مع تدفق النيتروجين التجفيف من 10 L /min عند 300 درجة مئوية وتدفق غاز غمد من 7 لتر / دقيقة عند 250 درجة مئوية وجمع البيانات باستخدام برنامج مدمج (انظر جدولالمواد).
    3. استخراج كروماتوجرافات طول موجة واحدة لحساب مناطق الذروة من عينات التفاعل ومركبات الفلافونويد الأصيلة باستخدام برنامج (انظر جدولالمواد).
      1. افتح برنامج التحليل النوعي وانقر فوق ملف > فتح ملف البيانات. حدد الملف (الملفات) المراد تحليله في إطار ملف البيانات المفتوح ثم انقر فوق فتح لفتح الملف (الملفات).
      2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في إطار esults R Chromeatogram ثمhromatograms Xtract C Eفي قائمة منبثقة.
      3. افتح مربع الحوار Extract Chromatograms. في القائمة نوع ، انقر فوق مخططات كروماتوغرام أخرى. في مربع التحرير والسرد كاشف، حدد DAD1. ثم انقر فوق موافق لعرض نتائج HPLC في إطار نتائج hromatogram C.
      4. انقر فوق رمز Mالسنوي integration الراسية في الجزء العلوي من إطار نتائج hromatogram C. رسم خط أساس للذروة المطلوبة لتحليل التكامل اليدوي مع الماوس.
      5. انقر فوق عرض > قائمة ذروة التكامل لعرض النتائج.
    4. جعل منحنى قياسي المستندة إلى HPLC من الفلافونويد الأصلي عن طريق رسم مناطق الذروة من الخطوة 7.2.3.5 مقابل تركيزات الفلافونويد المقابلة من الخطوة 7.2.1. ثم، حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول وفقا للصيغة الناتجة.
    5. تحليل بيانات MS للكتلة الدقيقة من مركبات الفلافونويد باستخدام برنامج (انظر جدول المواد).
      1. كرر الخطوات 7-2-3-1 - 7-2-3-3.
      2. انقر فوق الرمز تحديد النطاق على شريط الأدوات نتائج hromatogram C.
      3. حدد ذروة الفائدة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في النطاق المحدد وانقر فوق استخراج طيف MS في القائمة المنبثقة لعرض النتائج في إطار نتائج طيف MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

F3H و FLS1 هما الإنزيمات الرئيسية الهامة في تحويل فلافانون إلى فلافونول في النباتات كما هو مبين في الشكل 1. تطوير نظام التركيب الحيوي في المختبر لإنتاج الفلافونول من الفلافانون، Atf3h (انضمام GenBank لا. NM_114983.3) وAtfls1 (انضمام GenBank رقم تم استنساخ الجينات NM_12095...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويركز عدد لا بأس به من الدراسات على اشتقاق الفلافونول بسبب تطبيقها المحتمل في الرعاية الصحية والصناعات الغذائية. ومع ذلك، فإن استخراج النباتات التقليدية باستخدام المذيبات العضوية والتوليف الكيميائي تمتلك عيوبا جوهرية، مما يحد من استخدامها في إنتاج الفلافونول. هنا، نبلغ عن طريقة مفصلة ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل جامعة يانغتشو المعين خصيصا أستاذ الصناديق الناشئة، جيانغسو المعين خصيصا أستاذ صناديق بدء التشغيل، ستة مشاريع قمم المواهب في مقاطعة جيانغسو (منحة رقم 2014-SWYY-016)، ومشروع ممول من قبل البرنامج الأكاديمي ذو الأولوية تطوير مؤسسات جيانغسو للتعليم العالي (الطب البيطري). نشكر مركز الاختبار في جامعة يانغتشو لتحليلات HPLC وMS من الفلافونويدات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717APCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systemAgilent Technologies, IncN/Aan equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aa software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetinSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyolShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry SystemLabconco Corporation7740020an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging SystemShanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd.Tanon-
2500		an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparation of plasmids
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aa software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLan equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringeninSigma-Aldrich Co. LLCN5893substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencingGENEWIZ SuzhouN/Asequencing of recombinant plasmids
primer synthesisGENEWIZ SuzhouN/Asynthesis of PCR primers
quercetinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.Q111273final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0016ligation of an insert into a linearized vector DNA
TrizolThermo Fisher Scientific15596018isolation of total RNA
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aa software for analysis of HPLC data

References

  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved