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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La derivazione di un flavonolo è fondamentale per la sua applicazione nel settore sanitario e dell'industria alimentare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la biosintesi di un flavonolo da un flavanone e discutiamo i passi cruciali ei suoi vantaggi rispetto ad altri approcci.

Abstract

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi con una varietà di attività biologiche e farmacologiche. Qui, forniamo un metodo per la sintesi ezimatica in vitro di un flavonolo. In questo metodo, Atf3h e Atfls1, due geni chiave nel percorso biosintetico dei flavonomi, sono clonati e sovraespressi in Escherichia coli. Gli enzimi ricombinanti vengono purificati tramite una colonna di affinità e quindi una cascata bienzimatica viene stabilita in uno specifico buffer sintetico. Due flavonomi sono sintetizzati in questo sistema come esempi e determinati dalle analisi TLC e HPLC/LC/MS. Il metodo mostra evidenti vantaggi nella derivazione dei flavonoli rispetto ad altri approcci. Si tratta di risparmio di tempo e manodopera e altamente conveniente. La reazione è facile da controllare con precisione e quindi scalare per la produzione di massa. Il prodotto di destinazione può essere purificato facilmente grazie ai semplici componenti del sistema. Tuttavia, questo sistema è di solito limitato alla produzione di un flavonolo da un flavanone.

Introduzione

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi vegetali e sono coinvolti nello sviluppo e nella pigmentazione delle piante1,2,3. Ancora più importante, questi composti possiedono una vasta gamma di attività per la salute-benefica, come anti-cancro4,5, anti-ossidativo6, anti-infiammatorio7, antiobesità8, anti-ipertensivo9 , e le proprietà di richiamo della memoria10, portando ad un gran numero di studi su questi metaboliti secondari derivati dalle piante. Tradizionalmente, questi composti sono principalmente derivati dall'estrazione delle piante utilizzando solventi organici. Tuttavia, a causa del loro bassissimo contenuto negli impianti11,12,13, il costo di produzione per la maggior parte dei flavonomi rimane elevato, che impone grandi restrizioni sulla loro applicazione nel settore sanitario e alimentare industria.

Nel corso degli ultimi decenni, gli scienziati hanno sviluppato un certo numero di metodi per derivare flavonoidi14,15. Tuttavia, la sintesi chimica di queste molecole complicate possiede una varietà di svantaggi intrinseci16. Richiede non solo reagenti tossici e condizioni di reazione estreme, ma anche molti passi per produrre un composto flavonoide bersaglio14,17. Inoltre, un'altra sfida importante in questa strategia è la sintesi chirale delle molecole flavonoidi attive. Pertanto, non è una strategia ideale per produrre flavonoidi su scala commerciale tramite sintesi chimica16,17.

Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato una promettente strategia alternativa per produrre questi complicati composti naturali progettando microbi con un percorso per la biosintesi flavonoide18,19,20, 21 Mieto , 22, che è stato decifrato con successo nelle piante23. Ad esempio, Duan ealtri ha introdotto una via biosintetica nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae per produrre kaempferol (KMF)24. Malla et al. ha prodotto astragalina, un flavonolo glicosillato glicosylato, introducendo i geniflavanone 3-idrossislasi (f3h), la sinteassi di flavonol (fls1) e UDP-glucosioide:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 Escherichia coliBL21(DE3)17. Anche se ci sono un bel po 'di paradigmi, non tutti i microbi geneticamente ingegnerizzati producono i prodotti di interesse a causa della complessità di una piattaforma cellulare, l'incompatibilità tra elementi genetici artificialmente sintetizzati e ospiti, l'inibitorio effetto dei prodotti di destinazione rispetto alle cellule ospiti e l'instabilità di un sistema cellulare ingegnerizzato stesso16.

Un'altra promettente strategia alternativa per la produzione di flavonoidi è quella di stabilire una cascata multienzimatica in vitro. Cheng et al. hanno riferito che i poliketi enterocin possono essere sintetizzati con successo assemblando un percorso enzimatico completo in un vaso25. Questa strategia sintetica senza cellule aggira le restrizioni di una fabbrica di produzione microbica ed è quindi fattibile per produrre alcuni flavonoidi in grande quantità16.

Recentemente, abbiamo sviluppato con successo un sistema sintetico bienzima per convertire la naringenina (NRN) in KMF in un vaso16. Qui, descriviamo questo sistema in dettagli e i metodi coinvolti nell'analisi dei prodotti. Presentiamo anche due esempi che utilizzano questo sistema per produrre KMF da NRN e quercetina (QRC) da eriodictyol (ERD). Inoltre, discutiamo i passaggi cruciali di questo metodo e le future direzioni di ricerca nella biosintesi dei flavonoidi.

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Protocollo

1. Isolare l'RNA totale dai tessuti vegetali26,27

  1. Omogeneizzare i tessuti vegetali.
    1. Raccogliere 100 mg di un tessuto vegetale fresco (ad esempio, piantine di 4 settimane dall'Arabidopsis thaliana). Congelare il tessuto e un pestello e malta con azoto liquido, seguito da macinare il tessuto in polvere.
    2. Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento DELL'RNA (vedere Tabella deimateriali) nel mortaio. Il reagente verrà congelato immediatamente. Omogeneizzare il campione di tessuto con il pestello quando il reagente congelato si scioglie.
    3. Trasferire l'omolminato in un tubo da 1,5 mL, centrifugare il campione a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, quindi trasferire la soluzione omogenea sgomberata in un altro tubo fresco da 1,5 mL.
    4. Incubare il campione omogeneizzato a temperatura ambiente per 5 min.
  2. Isolare l'RNA totale.
    1. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio all'omogeneità, chiudere il tubo in modo sicuro, agitare il tubo vigorosamente a mano per 15 s e incubare il campione a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi e trasferire la fase acquosa superiore incolore in un tubo fresco da 1,5 mL. Il campione si separa in tre fasi successive alla centrifugazione.
    3. Aggiungere 0,5 mL di alcool isopropile alla fase acquosa, agitare il tubo a mano in modo vigoroso e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 min.
    4. Centrifugare la miscela a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante.
    5. Lavare il pellet di RNA una volta con 1 mL del 75% di etanolo mediante vortice, seguito dalla centrifugazione a 7.500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    6. Ripetere il passaggio 1.2.5.
    7. Asciugare l'aria del pellet per 5-10 minuti e riscioglierla nell'acqua trattata con dietirobicarbonato (DEPC) pipetting su e giù, seguita misurando la concentrazione totale di RNA con un microspettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).

2. Sintetizzare IL DNA complementare (cDNA)28

  1. Sintetizzare il primo filamento di cDNA utilizzando un kit (vedere Tabella dei materiali). Impostare un sistema di reazione a 20 gradi, come mostrato nella tabella 1 e incubare il tubo di reazione in uno strumento PCR per 50 min a 42 gradi centigradi, seguito terminando la reazione a 85 gradi centigradi per 5 min.
Reagentivolume
dNTP Mix, 2,5 mM ciascuno4,0 ll
Primer Mix2,0 ll
Modello RNA1,0 g di g
Buffer tratrascrizione inversa, 54,0 ll
Transcriptasi inversa, 200 U/L1,0 lL
RNase-Free H2Ofino a 20,0 l.

Tabella 1: Trascrizione inversa dell'RNA totale in cDNA

3. Costruire plasmichi ricombinanti29

  1. Progettare primer PCR.
    1. Progettare i primer PCR utilizzando un software (vedi Tabella dei materiali) basato sulle sequenze dei geni enzimatici chiave ottenuti dal database GenBank e sintetizzare i primer da un'azienda (vedi Tabella dei materiali). Alla fine 5' del primer, aggiungere un sito enzimatico di restrizione (ad esempio, BamHI o EcoRI in questo protocollo).
      NOTA: i primer utilizzati in questo studio sono riportati nella tabella 2.
Sequenza, 5' e 3'di proposito
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACTPrimer in avanti per amplificazione PCR del gene Atf3h dall'Arabidopsis thaliana. Bam Il sito HI è in corsivo e collegato per la clonazione in pET32a.
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTGGTCGAPrimer inverso per amplificazione PCR del gene Atf3h da A. thaliana. Eco Il sito RI è in corsivo e collegato per la clonazione in pET32a.
AAGGATCCATGGAGGTCGAAGAGTCCAPrimer in avanti per amplificazione PCR del gene Atfls1 da A. thaliana. Bam Il sito HI è in corsivo e collegato per la clonazione in pET32a.
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTATPrimer inverso per amplificazione PCR del gene Atfls1 da A. thaliana. Eco Il sito RI è in corsivo e collegato per la clonazione in pET32a.

Tabella 2: Primer Oligonucleotidi utilizzati nello studio attuale

  1. Clonare i geni in un vettore di espressione procariotica.
    1. Amplificare i geni dal primo filamento del cDNA sintetizzato utilizzando una polimerasi del DNA ad alta fedeltà (vedere Tabella dei materiali). Impostare un sistema di reazione PCR da 100 gradi come mostrato nella tabella 3 ed eseguire il seguente ciclo PCR: 94 c per 2 min per la denaturazione iniziale; poi 35 cicli di 94 s per 30 s per la denaturazione, 55 gradi centigradi per 2 min per l'annealing e 72 s per 1 min per l'estensione; seguita da un'allungamento finale a 72 gradi centigradi per 10 min. Raffreddare la miscela di reazione a 12 gradi centigradi.
      NOTA: Il tempo di estensione è variabile e determinato dalla lunghezza del gene con polimerizzazione di circa 1000 basi al centesimo per la maggior parte delle polimerasi del DNA.
    2. Visualizzate i prodotti PCR (più comunemente 5 l) su un gel di garose dell'1% e purificate il frammento specifico di DNA dai restanti prodotti utilizzando un kit di pulizia del DNA (vedere Tabella dei materiali).
    3. Digerire il frammento di DNA purificato e il vettore (ad es., pET-32a() con enzimi di restrizione (ad esempio, BamHI o EcoRI in questo protocollo). In un tubo PCR da 0,2 mL, come mostrato nella tabella 4, disponete di un sistema di reazione da 50 mL, incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 3 h. Separare il DNA digerito su un gel di agarose dell'1%.
    4. Recuperare la banda di DNA utilizzando un kit di estrazione gel (vedere Tabella dei materiali). Purificare ulteriormente il DNA utilizzando un kit di pulizia del DNA (vedi Tabella deimateriali), seguito misurando la concentrazione di DNA con un microspettrofotometro (vedi Tabella dei materiali).
    5. Ligate il frammento di gene nel DNA vettoriale linearizzato utilizzando una ligase del DNA T4 (vedere Tabella dei materiali). Impostare una reazione di legatura in un tubo da 1,5 mL come mostrato nella tabella 5 e incubare il tubo a temperatura ambiente per 2 - 3 h.
      NOTA: il rapporto molare di un inserto a un vettore è variabile e varia da 3:1 a 10:1.
    6. Aggiungete 2,5 l della miscela di ligazione in 50 gradi di cellule Escherichia coli chimicamente competenti (ad esempio, TOP10 o DH5), mescolate delicatamente e conservate il tubo sul ghiaccio per 30 minuti.
    7. Aggiungete 200 l di mezzo lB liquido senza antibiotici nel tubo e incubate il tubo in uno shaker di 37 gradi centigradi a 220 giri per una notte di 1 h- 100 L.
Reagentivolume
Pfu Master Mix, 250,0 L
Primer in avanti, 10 M4,0 ll
Primer inverso, 10 M4,0 ll
Cdna2,0 ll
H2O40,0 lL

Tabella 3: Impostazione di un sistema di reazione PCR

Reagentivolume
Frammento/Vettore del DNA3,0 g
Bam ciao1,0 lL
Eco RI1,0 lL
Buffer Cutsmart, 10 anni5,0 L
H2Ofino a 50,0 l.

Tabella 4: Doppia digestione di un frammento/vettore di DNA

Reagentivolume
inserireX (0,09 pmol)
vettore mY (0,03 pmol)
Buffer di ligazione, 10 anni1,0 lL
T4 DNA Ligase, 400 U/L1,0 lL
H2Ofino a 10,0 l.

Tabella 5: Legatura di un frammento genico in un vettore linearizzato

  1. Schermate colonie positive.
    1. Inoculare una singola colonia dalla piastra LB in 200 l. di mezzo Liquido LB contenente 100 g/mL di annicillina e incubare a 37 , 250 rpm per 2 - 3 h.
      NOTA: In generale, scegliere 4 - 8 colonie per lo screening delle colonie positive.
    2. Impostare una reazione PCR colonia 10-l simile a quella nel passaggio 3.2.1.
      NOTA: Utilizzare 1 l di coltura LB invece di 1 l del modello cDNA.
    3. Visualizza i prodotti PCR su un gel di agarose dell'1%. Inoculare la coltura rimanente con un risultato positivo in 3 mL di liquido LB medio contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare in uno shaker a 37 gradi centigradi a 250 rpm per 14 - 16 h.
    4. Isolare il DNA plasmide dalle colture ricombinanti di E. coli utilizzando un kit di miniprep plasmico (vedere Tabella dei materiali).
    5. Identificare i plasmidi ricombinanti purificati mediante un'analisi degli enzimi a doppia restrizione (ad esempio, BamHI ed EcoRI in questo protocollo). Impostare un sistema di reazione a 10 gradi simile a quello del passo 3.2.3, seguito da incubazione a 37 gradi centigradi per 3 h. Visualizza la banda specifica rilasciata dal plasmide ricombinante su un gel di agarose dell'1%.
  2. Verificare le sequenze di plasmidi ricombinanti positivi.
    1. Mandate i plasmidi a un'azienda per il sequenziamento. Analizzare i risultati utilizzando un software di analisi della sequenza del DNA (vedere Tabella deimateriali) confrontando la sequenza ottenuta dalla società di sequenziamento con la sequenza di riferimento ottenuta dal database GenBank.

4. Esprimere proteine enzimatiche ricombinanti30

  1. Trasformare il plasmide ricombinante corretto in competente E. coli BL21(DE3).
    1. Aggiungete 0,1 l del plasmide a 10 gradi di competente E. coli BL21(DE3) in un tubo da 1,5 mL sul ghiaccio e tenete il tubo sul ghiaccio per 5 min.
    2. Il calore colpisce le cellule in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 90 s e lo riporre sul ghiaccio per 2 minuti.
    3. Aggiungere 200 l di lb di mezzo liquido senza antibiotici e incubare in uno shaker 37 c a 220 rpm per 5 min.
    4. Stendere 50 - L di trasformazione su una piastra di agar LB contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare la piastra per una notte in un'incubatrice a 37 gradi centigradi.
  2. Indurre l'espressione dei geni.
    1. Inoculare 3 - 5 colonie dalla piastra in un tubo contenente 3 mL di supporto liquido LB con 100 g/mL di ampicillina e incubare a 250 rpm in uno shaker 37 C durante la notte.
    2. Trasferire tutta la coltura durante la notte in 300 mL di lB mezzo liquido contenente 100 g/mL di ampicillina e incubare a 250 rpm in uno shaker 37 c fino a quando la densità ottica della coltura a 600 nm è tra 0,4 - 0,6.
    3. Aggiungere isopropile z-D-thiogalactoside (IPTG) nella coltura con una concentrazione finale di 0,2 mM e indurre l'espressione dei geni a 250 giri/m, 20 - 22 gradi centigradi per 3 h.

5. Purificare le proteine enzimatiche ricombinanti31

  1. Raccogliere i batteri con centricazione della coltura a 4 gradi centigradi, 12.000 x g per 10 min.
  2. Risospendere il pellet in 15 mL di buffer di lisi batterica contenente 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 aprotina g/mL, 1 g/mL leupeptina e 1 pepstatina di g/mL in 50 mM Tris-Cl (pH 8.0).
  3. Sonicare la sospensione batterica per rilasciare le proteine enzimatiche ricombinanti, seguita da centrifugazione a 13.000 x g, 4 gradi centigradi per 10 min.
  4. Raccogliere e l'aliquota in tubi da 1,5 mL a 1 mL/tubo e conservarli a -70 gradi centigradi per un uso futuro.
  5. Applicare 500 l di resina di purificazione dei tag His (vedere Tabella dei materiali) in una colonna di affinità vuota riutilizzabile. Lavare la resina con 5 posti letto di acqua deionizzata per scartare l'etanolo nella soluzione di riserva. Bilanciare la resina con 10 volumi di letto del buffer di rilegatura che comprende Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazole (10 mM) e NaCl (0,5 M).
  6. Applicare 4 mL del supernatante dal passo 5.4 a un liquame della resina di cui sopra e bloccare due estremità della colonna con tappi.
  7. Incubare la miscela a 4 gradi centigradi su un rotatore a bassa velocità per 2 h.
  8. Lavare la resina legata alla proteina di fusione con 15 volumi di letto del tampone di legame a una velocità di portata di 1 mL/min prima dell'elusione.
  9. Aggiungere 500 l di tampone di eluizione (contenente 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM imidazole, 0,5 M NaCl) alla colonna e incubare i liquami a 4 gradi centigradi su un rotatore a bassa velocità per 10 min. Raccogliere l'eluente come campioni proteici purificati.
  10. Ripetere il passaggio 5.5 altre quattro volte.
  11. Lavare la resina in sequenza con 10 posti letto di acqua deionizzata e 3 comodini di 20% di etanolo. Immergere la resina nel 20% di etanolo. Bloccare la colonna con i tappi e conservarla a 4 gradi centigradi.
  12. Misurare la concentrazione delle proteine purificate dall'analizzatore della proteina Bradford. Determinare la purezza delle proteine su un gel 10% SDS-PAGE e visualizzare le bande dal coomassie blu colorazione saggio.
  13. Aggiungere glicerolo alla soluzione proteica purificata a una concentrazione finale del 10% per stabilizzare l'attività degli enzimi. Aliquota e conservarlo a -80 gradi centigradi.

6. Produrre un flavonolo da un flavanone in un sistema sintetico in vitrobiere 16

  1. Preparare i buffer.
    1. Crea 2x tampone sintetico senza solfato ferroso composto da 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 m di acido z-ketoglutaric, 0,8% ascorbate di sodio e 20% di glicerolo. Sciogliere 1,938 g di base di Tris, 0,640 g di ascorbate di sodio, 0,250 g di acido z-ketoglutarico e 16 mL di glicerolo a 64 mL di acqua dionizzata. Regolare il pH a 7,2 con l'acido cloridrico (HCl) e aggiungere acqua deionizzata fino a 80 mL. Conservare il buffer a 4 gradi centigradi per un uso futuro.
    2. Crea una soluzione di riserva 100x di 2 mM di solfato ferroso. Sciogliere 55,6 mg di eptaidrato ferroso in 50 mL di acqua deionizzata, mescolare e aggiungere acqua fino a 100 mL.
    3. Crea una soluzione stock di 25 mM flavonoidi. Sciogliere accuratamente un flavonoide nel metanolo e conservarlo a -20 gradi centigradi.
  2. Impostare un sistema sintetico per produrre un flavonolo da un flavanone.
    1. Preparare il sistema sintetico come illustrato nella tabella 6.
    2. Incubare la reazione a 40 gradi centigradi in un tubo aperto da 2,0 mL a 600 giri/mm (in un blocco di calore tremante) per 40 min.
    3. Terminare la reazione aggiungendo 10 l di acido acetico e 100 L di acetato etilico.
    4. Due ore dopo, trasferire le fasi organiche a tubi da 1,5 mL per l'essiccazione dell'aria in un cappuccio a temperatura ambiente.
Reagentivolume
2o buffer sintetico senza solfato ferroso50,0 L
25 mM di flavonolo2,0 ll
2 mM di solfato ferroso0,5 l l
1 mg/mL AtF3H2,5 l l
1 mg/mL AtFLS12,5 l l
25 mM flavanone2,0 ll
H2Ofino a 100,0 luna

Tabella 6: Il sistema sintetico utilizzato in questo protocollo.

7. Analizzare i prodotti di reazione

  1. Analisi della cromatografia a strati sottili (TLC).
    1. Piscina 5 tubi dei campioni di flavonoide dal passo 6.2.4 e estrarre 300 gradi centigradi per l'essiccazione dell'aria. Sciogliere la polvere di flavonoide in 160 o lofillo. Preparare autentici campioni di flavonoidi con concentrazioni seriali di 12,5, 25, 50, 100 e 200 ng/L in metanolo. Caricare 1 ll dei campioni di reazione e i campioni flavonoidi autentici su piastre di poliammide 6.
    2. Eseguire le piastre caricate campione in un sistema di solventi comprendente cloroformio/metanolo/acido formica etico con un rapporto di 5.0:1.5:1.0:0.5.
    3. Asciugare l'aria le piastre a temperatura ambiente. Spruzzare le piastre con soluzione etanolica dell'1% di cloruro di alluminio (AlCl3),seguita da un'asciugatura dell'aria a temperatura ambiente.
    4. Trenta minuti dopo, visualizzare le macchie sulle piastre sotto una luce UV a 254 nm e scattare immagini.
    5. Analizzare il valore grigio di ogni punto sulle immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ v1.51j8 in questo protocollo).
      1. Aprire il software ImageJ. Fare clic su File > Apri per aprire l'immagine da analizzare.
      2. Fare clic sullo strumento di selezione R piùa sinistra nell'interfaccia utente ImageJ. Delineare l'area di interesse (ROI) nell'immagine con il mouse e premere figure-protocol-19728 per etichettare il primo ROI.
      3. Spostare la selezione rettangolare con il mouse figure-protocol-19884 verso destra al ROI successivo e premere per etichettare il secondo ROI.
      4. Ripetere il passaggio precedente per etichettare tutte le altre ROI.
      5. Premere figure-protocol-20124 per generare grafici di profilo per tutte le ROI in una finestra popup.
        NOTA: in questo momento, lo strumento di selezione lineare nell'interfaccia utente ImageJ verrà attivato automaticamente.
      6. Utilizzare lo strumento Selezione linea retta per disegnare linee di base in modo da definire un'area chiusa per ogni picco di interesse.
      7. Attivare lo strumento di bacchetta facendo clic sull'icona corrispondente nell'interfaccia utente ImageJ. Fare clic all'interno del picco per visualizzare i risultati per tutti i picchi in una finestra popup.
    6. Creare una curva standard basata su TLC dell'autentico flavonoide tracciando i valori grigi del passaggio 7.1.5.7 rispetto alle concentrazioni di flavonoidi corrispondenti dal punto 7.1.1. Quindi, calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo in base alla formula risultante.
  2. Analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e della cromatometria liquida/spettrometria di massa (LC/MS)
    1. Elaborare i campioni dal punto 7.1.1 in sequenza a 0,45 m e 0,22 m filtri.
    2. Caricare i campioni in un sistema HPLC/LC/MS (vedere Tabella deimateriali) e separarli a 30 gradi centigradi utilizzando una colonna C18 (4,6 x 150 mm; i.d., 5 m). Elute la colonna a 1,0 mL/min con un gradiente di 10 - 85% (v/v) acetonitrile (ACN) in acqua (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) e monitorare l'assorbimento dell'eluato da 200 a 800 nm. Eseguire l'analisi LC/MS in una modalità ione negativo con un flusso di azoto di essiccazione di 10 L/min a 300 gradi centigradi e un flusso di gas di guaina di 7 L/min a 250 gradi centigradi e raccogliere dati utilizzando un software integrato (vedere Tabella dei materiali).
    3. Estrarre croromatogrammi a lunghezza d'onda singola per calcolare le aree di picco dei campioni di reazione e i composti flavonoidi autentici utilizzando un software (vedere Tabella dei materiali).
      1. Aprire il programma Analisi qualitativa e fare clic su File > Apri file di dati. Selezionare i file da analizzare nella finestra Apri file di dati e fare clic su Apri per aprire i file.
      2. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra Cromatogramma R e quindi sull'hromatogramma Extract C in un menu a comparsa.
      3. Aprire la finestra di dialogo Extract Chromatograms. Nell'elenco Tipo fare clic su Altri cromatogrammi. Nella casella combinata Rilevatore selezionare DAD1. Quindi fare clic su OK per visualizzare i risultati HPLC nella finestra Risultati hromtogramma C.
      4. Fare clic sull'icona Mannuale Integration ancorata nella parte superiore della finestra Risultati hromtogramma C. Disegnare una linea di base per il picco necessario per l'analisi manuale dell'integrazione con il mouse.
      5. Fare clic su Visualizza > Elenco picco integrazione per visualizzare i risultati.
    4. Creare una curva standard basata su HPLC dell'autentico flavonoide tracciando le aree di picco dal punto 7.2.3.5 rispetto alle concentrazioni di flavonoidi corrispondenti dal punto 7.2.1. Quindi, calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo in base alla formula risultante.
    5. Analizzare i dati MS per l'esatta massa di composti flavonoidi utilizzando un software (vedere Tabella dei materiali).
      1. Ripetere i passaggi da 7.2.3.1 a 7.2.3.3.
      2. Fare clic sull'icona Selezione intervallo sulla barra degli strumenti Risultati hromtogramma C.
      3. Selezionare il picco di interesse. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'intervallo selezionato e fare clic su Estrai MS Spectrum nel menu a comparsa per visualizzare i risultati nella finestra Risultati ms Spectrum.

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Risultati

F3H e FLS1 sono due importanti enzimi chiave nella conversione di un flavanone in un flavonolo nelle piante, come mostrato nella Figura 1. Sviluppare un sistema biosintetico in vitro per la produzione di un flavonolo da un flavanone, Atf3h (GenBank accession no. NM_114983.3) e Atfls1 (Nr. adesione del GenBank NM_120951.3) sono stati clonati dalle piantine di A. thaliana di 4 settimane in un vettore di espressione procariotica pET-32...

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Discussione

Una serie di studi si concentra sulla derivazione dei flavonomi a causa della loro potenziale applicazione nell'assistenza sanitaria e nell'industria alimentare. Tuttavia, l'estrazione tradizionale delle piante con solventi organici e la sintesi chimica possiedono svantaggi intrinseci, che ne limitano l'uso nella produzione di flavonomi. Qui, riportiamo un metodo dettagliato per produrre un flavonolo da un flavanone in un vaso stabilendo una cascata bienzimatica in vitro. I passaggi critici di questo protocollo sono: 1) ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da Yangzhou University Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project nella provincia di Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e un progetto finanziato da il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (medicina veterinaria). Ringraziamo il Testing Center dell'Università di Yangzhou per le analisi HPLC e MS dei flavonoidi.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717APCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systemAgilent Technologies, IncN/Aan equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aa software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetinSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyolShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry SystemLabconco Corporation7740020an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging SystemShanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd.Tanon-
2500		an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparation of plasmids
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aa software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLan equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringeninSigma-Aldrich Co. LLCN5893substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencingGENEWIZ SuzhouN/Asequencing of recombinant plasmids
primer synthesisGENEWIZ SuzhouN/Asynthesis of PCR primers
quercetinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.Q111273final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0016ligation of an insert into a linearized vector DNA
TrizolThermo Fisher Scientific15596018isolation of total RNA
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aa software for analysis of HPLC data

Riferimenti

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