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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Ableitung eines Flavonols ist entscheidend für seine Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelindustrie. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon zur Verfügung und diskutieren die entscheidenden Schritte und seine Vorteile gegenüber anderen Ansätzen.

Zusammenfassung

Flavonole sind eine der wichtigsten Unterklassen von Flavonoiden mit einer Vielzahl von biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Hier bieten wir eine Methode zur in vitro enzymatischen Synthese eines Flavonols. Bei dieser Methode werden Atf3h und Atfls1, zwei Schlüsselgene im biosynthetischen Weg der Flavonole, geklont und in Escherichia coliüberexprimiert. Die rekombinanten Enzyme werden über eine Affinitätssäule gereinigt und dann wird in einem spezifischen synthetischen Puffer eine bienzymatische Kaskade aufgebaut. Zwei Flavonole werden in diesem System als Beispiele synthetisiert und durch TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen bestimmt. Die Methode zeigt offensichtliche Vorteile bei der Ableitung von Flavonolen gegenüber anderen Ansätzen. Es ist zeit- und arbeitssparend und sehr kostengünstig. Die Reaktion lässt sich einfach genau steuern und somit für die Massenproduktion hochskalieren. Das Zielprodukt lässt sich durch die einfachen Komponenten im System einfach reinigen. Jedoch, Dieses System ist in der Regel auf die Herstellung eines Flavonolaus aus einem Flavanon beschränkt.

Einleitung

Flavonole sind eine wichtige Unterklasse von Pflanzenflavonoiden und sind an der Pflanzenentwicklung und Pigmentierung1,2,3beteiligt. Noch wichtiger ist, diese Verbindungen besitzen eine breite Palette von gesundheitsfördernden Aktivitäten, wie Anti-Krebs4,5, antioxidative6, entzündungshemmende7, Anti-Adipositas8, anti-hypertensive9 , und Speicher-Rückruf Eigenschaften10, was zu einer großen Anzahl von Studien über diese pflanzlichen abgeleiteten sekundären Metaboliten. Traditionell werden diese Verbindungen hauptsächlich aus der Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen. Aufgrund ihres sehr geringen Gehalts in den Werken11,12,13bleiben die Produktionskosten für die meisten Flavonole jedoch hoch, was ihre Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelversorgung stark eingeschränkt. industrie.

In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler eine ganze Reihe von Methoden entwickelt, um Flavonoide14,15abzuleiten. Die chemische Synthese dieser komplizierten Moleküle besitzt jedoch eine Vielzahl von intrinsischen Nachteilen16. Es erfordert nicht nur toxische Reagenzien und extreme Reaktionsbedingungen, sondern auch viele Schritte, um eine Ziel-Flavonoid-Verbindung14,17zu produzieren. Darüber hinaus ist eine weitere wichtige Herausforderung in dieser Strategie die chirale Synthese von aktiven Flavonoidmolekülen. Daher ist es keine ideale Strategie, Flavonoide im kommerziellen Maßstab über chemische Synthese16,17zu produzieren.

Kürzlich haben Wissenschaftler eine vielversprechende alternative Strategie entwickelt, um diese komplizierten natürlichen Verbindungen durch technische Mikroben mit einem Weg für Flavonoid-Biosynthese18,19,20, 21 , 22, die in Denbetrieben erfolgreich entziffert wurde23. Zum Beispiel, Duan et al. führte einen biosynthetischen Weg in die angehende Hefe Saccharomyces cerevisiae Kaempferol (KMF)24. Malla et al. produzierten Astragalin, ein glykosyliertes Flavonol, durch Einbringen vonFlavanon 3-Hydroxylase (f3h), Flavonol-Synthase (fls1) und UDP-Glucose:flavonoid 3-O-Glucosyltransferase UGT78K1-Genen in Escherichia coliBL21(DE3)17. Obwohl es eine ganze Reihe von Paradigmen gibt, produzieren nicht alle gentechnisch veränderten Mikroben die Produkte von Interesse aufgrund der Komplexität einer zellulären Plattform, der Inkompatibilität zwischen künstlich synthetisierten genetischen Elementen und Wirten, der hemmenden Wirkung von Zielprodukten gegen Wirtszellen und die Instabilität eines technischen Zellsystems selbst16.

Eine weitere vielversprechende Alternative zur Flavonoidproduktion ist die Etablierung einer multienzymatischen Kaskade in vitro. Cheng et al. haben berichtet, dass Enterocin-Polyketide erfolgreich synthetisiert werden können, indem sie einen kompletten enzymatischen Weg in einem Topf25zusammenstellen. Diese zellfreie synthetische Strategie umgeht die Beschränkungen einer mikrobiellen Produktionsfabrik und ist somit für die Herstellung einiger Flavonoide in großer Menge16machbar.

Kürzlich haben wir erfolgreich ein bienzym-synthetisches System entwickelt, um Naringenin (NRN) in KMF in einem Topf16umzuwandeln. Hier beschreiben wir dieses System ausführlich und die Methoden, die bei der Analyse der Produkte zum Einsatz kommen. Wir stellen auch zwei Beispiele vor, die dieses System verwenden, um KMF aus NRN und Quercetin (QRC) aus Eriodictyol (ERD) zu produzieren. Darüber hinaus diskutieren wir entscheidende Schritte dieser Methode und zukünftige Forschungsrichtungen in der Biosynthese von Flavonoiden.

Protokoll

1. Isolieren der gesamten RNA aus Pflanzengeweben26,27

  1. Homogenisieren Sie das Pflanzengewebe.
    1. Sammeln Sie 100 mg eines frischen Pflanzengewebes (z. B. 4 Wochen alte Sämlinge aus Arabidopsis thaliana). Einfrieren Sie das Gewebe und einen Stößel und Mörtel mit flüssigem Stickstoff, gefolgt von dem Schleifen des Gewebes in Pulver.
    2. Fügen Sie 1 ml RNA-Isolationsreagenz (siehe Materialtabelle)in den Mörtel ein. Das Reagenz wird sofort eingefroren. Homogenisieren Sie die Gewebeprobe mit dem Stößel, wenn das gefrorene Reagenz schmilzt.
    3. Das Homogenat in ein 1,5-ml-Rohr geben, die Probe bei 12.000 x g bei 5 min bei 4 °C zentrifugieren und dann die gereinigte Homogenatlösung in ein anderes frisches 1,5-ml-Rohr geben.
    4. Inkubieren Sie die homogenisierte Probe bei Raumtemperatur für 5 min.
  2. Isolieren Sie die gesamte RNA.
    1. 0,2 ml Chloroform in das Homogenat geben, das Rohr sicher verkappen, das Rohr 15 s kräftig von Hand schütteln und die Probe bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C und übertragen Sie die farblose obere wässrige Phase in ein frisches 1,5-ml-Rohr. Die Probe trennt sich nach der Zentrifugation in drei Phasen.
    3. 0,5 ml Isopropylalkohol in die wässrige Phase geben, das Rohr kräftig von Hand schütteln und die Mischung bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
    5. Waschen Sie das RNA-Pellet einmal mit 1 ml 75% Ethanol durch Wirbeln, gefolgt von Zentrifugation bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.2.5.
    7. Das Pellet 5-10 Minuten trocknen und die RNA in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser wieder auflösen, indem es nach oben und unten pipetiert, gefolgt von der Messung der gesamten RNA-Konzentration mit einem Mikrospektrophotometer (siehe Tabelle der Materialien).

2. Synthetisieren komplementärer DNA (cDNA)28

  1. Synthetisieren Sie den ersten Strang von cDNA mit einem Kit (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie ein 20-L-Reaktionssystem gemäß Tabelle 1 ein und inkubieren Sie das Reaktionsrohr in einem PCR-Instrument für 50 min bei 42 °C, gefolgt von der Beendigung der Reaktion bei 85 °C für 5 min. Lagern Sie das Reaktionsprodukt bei -20 °C für die zukünftige Verstärkung der Gene.
ReagenzienVolumen
dNTP Mix, je 2,5 mM4,0 l
Primer Mix2,0 l
RNA-Vorlage1,0 g
Reverse Transcriptase Buffer, 54,0 l
Reverse Transcriptase, 200 U/L1,0 l
Rnase-frei H2Obis zu 20,0 l

Tabelle 1: Umgekehrte Transkription der gesamten RNA in cDNA

3. Konstruieren Sie rekombinante Plasmide29

  1. Design PCR-Primer.
    1. Entwerfen Sie die PCR-Primer mit einer Software (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf den Sequenzen der wichtigsten Enzymgene, die aus der GenBank-Datenbank gewonnen werden, und synthetisieren Sie die Primer von einem Unternehmen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie am 5' Ende des Primers eine Restriktionsenzym-Site hinzu (z. B. BamHI oder EcoRI in diesem Protokoll).
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 2dargestellt.
Sequenz, 5' n 3'zweck
AAGGATCCATGGCTCTAGGAACTTTGACTVorwärtsgrundierung zur PCR-Verstärkung des Atf3h-Gens aus Arabidopsis thaliana. Bam HI-Standort ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht.
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGAReverse Primer zur PCR-Verstärkung des Atf3h-Gens aus A. thaliana. Eco RI-Site ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht.
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCAVorwärtsgrundierung zur PCR-Verstärkung des Atfls1-Gens von A. thaliana. Bam HI-Standort ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht.
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTATReverse Primer zur PCR-Verstärkung des Atfls1-Gens aus A. thaliana. Eco RI-Site ist kursiv und zum Klonen in pET32a(+) angebracht.

Tabelle 2: Oligonukleotidgrundierungen, die in der aktuellen Studie verwendet werden

  1. Klonen Sie die Gene in einen prokaryotischen Expressionsvektor.
    1. Verstärken Sie die Gene aus dem ersten Strang der synthetisierten cDNA mit einer hochgradigen DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie ein 100-L-PCR-Reaktionssystem ein, wie in Tabelle 3 dargestellt, und führen Sie den folgenden PCR-Zyklus aus: 94 °C für 2 min für die anfängliche Denaturierung; dann 35 Zyklen von 94 °C für 30 s für Denaturierung, 55 °C für 2 min für glühend und 72 °C für 1 min für Dieverlängerung; gefolgt von einer Enddehnung bei 72 °C für 10 min. Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf 12 °C.
      HINWEIS: Die Verlängerungszeit ist variabel und wird durch die Genlänge mit Polymerisation von etwa 1000 Basen pro min für die meisten DNA-Polymerasen bestimmt.
    2. Visualisieren Sie die PCR-Produkte (am häufigsten 5 l) auf einem 1% Agarose-Gel und reinigen Sie das spezifische DNA-Fragment der übrigen Produkte mit einem DNA-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Verdauen Sie das gereinigte DNA-Fragment und den Vektor (z. B. pET-32a(+)) mit Restriktionsenzymen (z. B. BamHI oder EcoRI in diesem Protokoll). Richten Sie ein 50-L-Reaktionssystem in einem 0,2 ml PCR-Rohr ein, wie in Tabelle 4 dargestellt, und inkubieren Sie das Gemisch bei 37 °C für 3 h. Trennen Sie die verdaute DNA auf einem 1% Agarose-Gel.
    4. Wiederherstellen des DNA-Bandes mit einem Gel-Extraktionskit (siehe Tabelle der Materialien). Weitere Reinigung der DNA mit einem DNA-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien), gefolgt von der Messung der Konzentration der DNA mit einem Mikrospektrophotometer (siehe Tabelle der Materialien).
    5. Ligate das Genfragment mit einer T4-DNA-Ligase in die linearisierte Vektor-DNA (siehe Tabelle der Materialien). Richten Sie eine Ligationsreaktion in einem 1,5-ml-Rohr ein, wie in Tabelle 5 dargestellt, und inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 2 - 3 h.
      HINWEIS: Das Molverhältnis eines Inserts zu einem Vektor ist variabel und reicht von 3:1 bis 10:1.
    6. Fügen Sie 2,5 l des Ligationsgemisches in 50 l chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen (z.B. TOP10 oder DH5) ein, mischen Sie sie sanft und halten Sie die Röhre 30 min auf Eis. Hitze schockieren die Zellen bei 42 °C für 90 s und legen Sie die Röhre sofort 2 min auf Eis.
    7. Fügen Sie 200 l flüssiges LB-Medium ohne Antibiotika in die Röhre und inkubieren Sie das Rohr in einem 37 °C-Shaker bei 220 U/min für 1 h. 50 - 100 l der Zellen auf einer LB-Platte mit 100 g/mL Ampicillin verteilen und bei 37 °C über Nacht inkubieren.
ReagenzienVolumen
Pfu Master Mix, 2"50,0 l
Vorwärts-Primer, 10 m4,0 l
Reverse Primer, 10 m4,0 l
Cdna2,0 l
H2O40,0 l

Tabelle 3: Einrichten eines PCR-Reaktionssystems

ReagenzienVolumen
DNA-Fragment/Vektor3,0 g
Bam Hallo1,0 l
Eco Ri1,0 l
Cutsmart-Puffer, 10"5,0 l
H2Obis zu 50,0 l

Tabelle 4: Doppelte Verdauung eines DNA-Fragments/Vektors

ReagenzienVolumen
einfügenX l (0,09 pmol)
VektorY -L (0,03 pmol)
Ligationspuffer, 10"1,0 l
T4 DNA Ligase, 400 U/L1,0 l
H2Obis zu 10,0 l

Tabelle 5: Ligation eines Genfragments in einen linearisierten Vektor

  1. Bildschirm positive Kolonien.
    1. Eine einzelne Kolonie von der LB-Platte in 200 l flüssiges LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und bei 37 °C, 250 U/min für 2 - 3 h inkubieren.
      HINWEIS: Im Allgemeinen wählen Sie 4 - 8 Kolonien für das Screening positiver Kolonien.
    2. Richten Sie eine 10-L-Kolonie-PCR-Reaktion ähnlich der in Schritt 3.2.1 ein.
      ANMERKUNG: Verwenden Sie 1 L LB-Kultur anstelle von 1 L cDNA-Vorlage.
    3. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1% Agarose-Gel. Die restliche Kultur mit einem positiven Ergebnis in 3 ml flüssiges LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und in einem 37 °C-Shaker bei 250 U/min für 14 - 16 h inkubieren.
    4. Isolieren Sie Plasmid-DNA aus rekombinanten E. coli-Kulturen mit einem Plasmid-Miniprep-Kit (siehe Materialtabelle).
    5. Identifizieren Sie die gereinigten rekombinanten Plasmide durch eine Doppelrestriktionsenzymanalyse (z. B. BamHI und EcoRI in diesem Protokoll). Richten Sie ein 10-L-Reaktionssystem ähnlich dem in Schritt 3.2.3 ein, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 3 h. Visualisieren Sie das spezifische Band, das aus dem rekombinanten Plasmid auf einem 1% Agarose-Gel freigesetzt wird.
  2. Überprüfen Sie die Sequenzen positiver rekombinanter Plasmide.
    1. Senden Sie die Plasmide zur Sequenzierung an ein Unternehmen. Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer DNA-Sequenzanalysesoftware (siehe Materialtabelle), indem Sie die Sequenz des Sequenzierungsunternehmens mit der Referenzsequenz aus der GenBank-Datenbank vergleichen.

4. Express rekombinante Enzymproteine30

  1. Verwandeln Sie das richtige rekombinante Plasmid in kompetentes E. coli BL21(DE3).
    1. Fügen Sie 0,1 l des Plasmids auf 10 l des kompetenten E. coli BL21(DE3) in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und halten Sie die Röhre 5 min auf Eis.
    2. Hitze schockieren die Zellen in einem 42 °C-Wasserbad für 90 s und legen Sie es für 2 min wieder auf Eis.
    3. Fügen Sie 200 l LB flüssiges Medium ohne Antibiotika hinzu und in einem 37 °C-Shaker bei 220 Rprossen für 5 min brüten.
    4. Auf einer LB-Agarplatte, die 100 g/ml Ampicillin enthält, 50 l l Transformation verteilen und die Platte über Nacht in einem 37 °C-Inkubator inkubieren.
  2. Induzieren Sie die Expression von Genen.
    1. 3 - 5 Kolonien von der Platte in ein Rohr mit 3 ml flüssigem Medium mit 100 g/ml Ampicillin impfen und über Nacht in einem 37 °C-Shaker bei 250 U/min inkubieren.
    2. Übertragen Sie die gesamte Nachtkultur in 300 ml flüssiges Medium, das 100 g/ml Ampicillin enthält, und inkubieren Sie bei 250 Umdrehungen pro Minute in einem 37 °C-Shaker, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm zwischen 0,4 - 0,6 liegt.
    3. Fügen Sie isopropyl-D-Thiogalactoside (IPTG) in die Kultur mit einer Endkonzentration von 0,2 mM ein und induzieren Sie die Expression der Gene bei 250 rpm, 20 - 22 °C für 3 h.

5. Reinigen Sie die rekombinanten Enzymproteine31

  1. Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation der Kultur bei 4 °C, 12.000 x g für 10 min.
  2. Das Pellet in 15 ml bakteriellem Lysepuffer mit 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 g/mL Aprotinin, 1 g/mL Leupeptin und 1 g/ml Pepstatin in 50 mM Tris-Cl (pH 8,0).
  3. Beschallen Sie die bakterielle Suspension, um die rekombinanten Enzymproteine freizusetzen, gefolgt von zentrifugierender Zentrifugation bei 13.000 x g, 4 °C für 10 min.
  4. Den Überstand in 1,5-ml-Rohren bei 1 ml/Rohr ernten und aliquotieren und bei -70 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
  5. Wenden Sie 500 L His-Tag-Reinigungsharz (siehe Materialtabelle) auf eine wiederverwendbare leere Affinitätsspalte an. Waschen Sie das Harz mit 5 Bettvolumen von entionisiertem Wasser, um das Ethanol in der Stammlösung zu entsorgen. Das Harz mit 10 Bettvolumen des Bindungspuffers aus Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), Imidazol (10 mM) und NaCl (0,5 M) ausgleichen.
  6. Tragen Sie 4 ml des Überstandes aus Schritt 5.4 auf eine Gülle des obigen Harzes auf und blockieren Sie zwei Enden der Säule mit Stopfen.
  7. Inkubieren Sie das Gemisch bei 4 °C auf einem Rotator bei niedriger Geschwindigkeit für 2 h.
  8. Waschen Sie das Fusionsprotein gebundenes Harz mit 15 Bettvolumen des Bindungspuffers bei 4 °C bei einer Durchflussrate von 1 ml/min vor der Elution.
  9. 500 l Elutionspuffer (mit 20 mM Tris-Cl (pH 7,9), 500 mM Imidazol, 0,5 M NaCl) in die Säule geben und die Gülle bei 4 °C bei einer niedrigen Geschwindigkeit für 10 min auf einem Rotator inkubieren.
  10. Wiederholen Sie Schritt 5.5 noch viermal.
  11. Waschen Sie das Harz sequenziell mit 10 Bettvolumen von entionisiertem Wasser und 3 Bettvolumen von 20% Ethanol. Das Harz in 20% Ethanol einweichen. Blockieren Sie die Säule mit Stoppern und lagern Sie sie bei 4 °C.
  12. Messen Sie die Konzentration der gereinigten Proteine durch den Bradford-Protein-Assay. Bestimmen Sie die Reinheit der Proteine auf einem 10% SDS-PAGE Gel und visualisieren Sie die Bänder durch den Coomassie blue staining assay.
  13. Fügen Sie Der gereinigten Proteinlösung Glycerin zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu, um die Enzymaktivität zu stabilisieren. Aliquot und lagern Sie es bei -80 °C.

6. Produzieren Sie ein Flavonol aus einem Flavanon in einem in vitro bienzymsynthetischen System16

  1. Bereiten Sie Puffer vor.
    1. Machen Sie 2x synthetischepuffer ohne Eisensulfat bestehend aus 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16,4 mM -Ketoglutersäure, 0,8% Natriumascorbat und 20% Glycerin. 1,938 g Tris-Basis, 0,640 g Natriumascorbat, 0,250 g Ketoglutersäure und 16 ml Glycerin bis 64 ml entionisiertes Wasser auflösen. PH mit Salzsäure (HCl) auf 7,2 einstellen und deionisiertes Wasser bis zu 80 ml hinzufügen. Bewahren Sie den Puffer bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf.
    2. Machen Sie eine 100-fache Stammlösung aus 2 mM Eisensulfat. 55,6 mg Eisensulfat-Heptahydrat in 50 ml entionisiertem Wasser auflösen, umrühren und Wasser bis zu 100 ml hinzufügen.
    3. Machen Sie eine Lagerlösung von 25 mM Flavonoid. Ein Flavonoid in Methanol gründlich auflösen und bei -20 °C lagern.
  2. Richten Sie ein synthetisches System ein, um ein Flavonol aus einem Flavanon herzustellen.
    1. Bereiten Sie das synthetische System vor, wie in Tabelle 6dargestellt.
    2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 40 °C in einem offenen 2,0-ml-Rohr bei 600 U/min (in einem schüttenden Wärmeblock) für 40 min.
    3. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 l Essigsäure und 100 l Ethylacetat hinzufügen.
    4. Zwei Stunden später die organischen Phasen auf 1,5-ml-Rohre zur Lufttrocknung in einer Haube bei Raumtemperatur übertragen.
ReagenzienVolumen
Synthetikpuffer ohne Eisensulfat50,0 l
25 mM Flavonol2,0 l
2 mM Eisensulfat0,5 l
1 mg/ml AtF3H2,5 l
1 mg/ml BeiFLS12,5 l
25 mM Flavanon2,0 l
H2Obis zu 100,0 l

Tabelle 6: Das in diesem Protokoll verwendete synthetische System.

7. Analysieren Sie die Reaktionsprodukte

  1. Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse.
    1. 5 Rohre der Flavonoidproben ab Schritt 6.2.4 bündeln und zur Lufttrocknung 300 l herausnehmen. Lösen Sie das Flavonoidpulver in 160 l Methanol auf. Bereiten Sie authentische Flavonoidproben mit seriellen Konzentrationen von 12,5, 25, 50, 100 und 200 ng/l in Methanol vor. Die Reaktionsproben und die authentischen Flavonoidproben auf Polyamid 6 Platten aufgeben.
    2. Führen Sie die probenbelasteten Platten in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform/Methanol/Ethylacetat/Ameisensäure im Verhältnis 5,0:1,5:1,0:0,5 aus.
    3. Die Platten werden bei Raumtemperatur an die Luft trocknen. Sprühen Sie die Platten mit 1% Ethanollösung aus Aluminiumchlorid (AlCl3), gefolgt von der Lufttrocknung wieder bei Raumtemperatur.
    4. 30 Minuten später visualisieren Sie die Flecken auf den Platten unter einem UV-Licht bei 254 nm und nehmen Sie Bilder auf.
    5. Analysieren Sie den Grauwert jedes Spots auf den Bildern mit einer Bildverarbeitungssoftware (z. B. ImageJ v1.51j8 in diesem Protokoll).
      1. Öffnen Sie die Software ImageJ. Klicken Sie auf Datei > Öffnen, um das zu analysierende Bild zu öffnen.
      2. Klicken Sie in der ImageJ-Benutzeroberfläche auf die linke R-Ectang-Auswahl-Tool. Beschreiben Sie den Bereich von Interesse (ROI) figure-protocol-19617 im Bild mit der Maus und drücken Sie, um den ersten ROI zu kennzeichnen.
      3. Bewegen Sie die rechteckige Auswahl mit der figure-protocol-19812 Maus nach rechts zum nächsten ROI, und drücken Sie, um den zweiten ROI zu beschriften.
      4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um alle anderen ROIs zu beschriften.
      5. Drücken figure-protocol-20074 Sie die Taste , um Profildiagramme für alle ROIs in einem Popupfenster zu generieren.
        HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wird das Straight Line Selection Tool in der ImageJ-Benutzeroberfläche automatisch aktiviert.
      6. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug gerade, um Basislinien zu zeichnen, um einen geschlossenen Bereich für jeden Spitzenwert zu definieren.
      7. Aktivieren Sie das Wand-Tool, indem Sie auf das entsprechende Symbol in der ImageJ-Benutzeroberfläche klicken. Klicken Sie in die Spitze, um die Ergebnisse für alle Spitzen in einem Popupfenster anzuzeigen.
    6. Erstellen Sie eine TLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids, indem Sie die Grauwerte aus Schritt 7.1.5.7 mit den entsprechenden Flavonoidkonzentrationen aus Schritt 7.1.1. Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids nach der resultierenden Formel.
  2. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) Analysen
    1. Verarbeiten Sie die Proben von Schritt 7.1.1 sequenziell bis zu 0,45 m und 0,22 m Filtern.
    2. Laden Sie die Proben in ein HPLC/LC/MS-System (siehe Materialtabelle) und trennen Sie die Proben bei 30 °C mit einer C18-Säule (4,6 x 150 mm; i.d.d., 5 m). Die Säule bei 1,0 ml/min mit einem Gradienten von 10 - 85% (v/v) Acetonitril (ACN) in Wasser (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) und überwachen die Absorption des Eluats von 200 bis 800 nm. Führen Sie die LC/MS-Analyse im negativen Ionenmodus mit einem Trocknungsstickstoffstrom von 10 l/min bei 300 °C und einem Mantelgasstrom von 7 l/min bei 250 °C durch und sammeln Sie Daten mit einer eingebauten Software (siehe Materialtabelle).
    3. Extrahieren Sie Chromatographen mit einer Wellenlänge, um die Spitzenbereiche von Reaktionsproben und authentischen Flavonoidverbindungen mit einer Software zu berechnen (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Öffnen Sie das Qualitative Analyseprogramm, und klicken Sie auf Datei > Datendatei öffnen. Wählen Sie die zu analysierenden Dateien im Fenster Datendatei öffnen aus, und klicken Sie auf Öffnen, um die Datei(n) zu öffnen.
      2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste im Fenster Chromatogramm Results und dann auf die Extract C-Hromatogramme in einem Pop-up-Menü.
      3. Öffnen Sie dasDialogfeld Extract Chromatogram. Klicken Sie in der Liste Typ auf Andere Chromatogramme. Wählen Sie im Feld Detektor-Kombination SEN DAD1 aus. Klicken Sie dann auf OK, um die HPLC-Ergebnisse im Fenster C-Hromatogramm-Ergebnisse anzuzeigen.
      4. Klicken Sie auf das M-Jahres-I-Ntegration-Symbol, das oben im Fenster C-Hromatogramm-Ergebnisse angedockt ist. Zeichnen Sie eine Grundlinie für die Spitze, die für die manuelle Integrationsanalyse mit der Maus erforderlich ist.
      5. Klicken Sie auf Ansicht > Integrations-Peak-Liste, um die Ergebnisse anzuzeigen.
    4. Erstellen Sie eine HPLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids, indem Sie die Spitzenbereiche ab Schritt 7.2.3.5 gegen die entsprechenden Flavonoidkonzentrationen ab Schritt 7.2.1 aufstellen. Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids nach der resultierenden Formel.
    5. Analysieren Sie die MS-Daten auf die genaue Masse der Flavonoidverbindungen mit einer Software (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Wiederholen Sie die Schritte 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
      2. Klicken Sie auf der SymbolleisteC-Hromatogramm-Ergebnisse auf das Symbol Bereichsauswahl.
      3. Wählen Sie den Höhepunkt des Interesses aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den ausgewählten Bereich, und klicken Sie im Popupmenü auf das MS-Spektrum extrahieren, um die Ergebnisse im Fenster MS Spectrum Results anzuzeigen.

Ergebnisse

F3H und FLS1 sind zwei wichtige Schlüsselenzyme bei der Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol in Pflanzen, wie in Abbildung 1dargestellt. Entwicklung eines in vitro biosynthetischen Systems zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon, Atf3h (GenBank-Beitritt Nr. NM_114983.3) und Atfls1 (GenBank-Beitritt Nr. NM_120951.3) Gene wurden aus den Sämlingen des 4 Wochen alten A. thaliana zu einem prokaryotischen Expressionsvek...

Diskussion

Eine ganze Reihe von Studien konzentrieren sich auf die Ableitung von Flavonolen aufgrund ihrer möglichen Anwendung in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie. Die traditionelle Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln und der chemischen Synthese hat jedoch intrinsische Nachteile, die ihre Verwendung bei der Herstellung von Flavonolen einschränken. Hier berichten wir über eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon in einem Topf, indem wir eine in vitro bienzymatische Kask...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von yangzhou University Specially Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (Grant No. 2014-SWYY-016) und einem Projekt, das von die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (Veterinärmedizin). Wir danken dem Testing Center der Yangzhou University für HPLC- und MS-Analysen von Flavonoiden.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717APCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systemAgilent Technologies, IncN/Aan equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aa software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetinSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyolShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry SystemLabconco Corporation7740020an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging SystemShanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd.Tanon-
2500		an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparation of plasmids
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aa software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLan equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringeninSigma-Aldrich Co. LLCN5893substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencingGENEWIZ SuzhouN/Asequencing of recombinant plasmids
primer synthesisGENEWIZ SuzhouN/Asynthesis of PCR primers
quercetinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.Q111273final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0016ligation of an insert into a linearized vector DNA
TrizolThermo Fisher Scientific15596018isolation of total RNA
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aa software for analysis of HPLC data

Referenzen

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