JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הנגזרת של פלברול היא חיונית ליישומו בתחום הבריאות ותעשיית המזון. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יוסינטזה של פלאורול מן flavanone ולדון את הצעדים הקריטיים ואת יתרונותיה על פני גישות אחרות.

Abstract

פלונוולים הם מחלקת מחשוב של פלונונואידים עם מגוון פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגית. כאן אנו מספקים שיטה לסינתזה האנזימטית של פלאורול. בשיטה זו, Atf3h ו- Atfls1, שני גנים מרכזיים בשביל הביוסינתטי של פלאוולים, משובטים ומבוטאים בתוך אסאנכיה קולי. האנזימים הרקומביננטי מטוהרים באמצעות עמודת זיקה ומוקמת בתוך מאגר סינתטי מסוים. שני פלאוולים מסונתז במערכת זו כדוגמאות ונקבעים על-ידי הניתוח לבדיקות ובדיקות/מערכות המשך. השיטה מציגה יתרונות ברורים בנגזרת של פלאוולים על פני גישות אחרות. זה זמן וחסכון בעבודה. ומאוד חסכוני התגובה היא קלה להיות נשלט באופן מדויק ובכך מוקטן לייצור המוני. מוצר היעד ניתן לטהר בקלות בשל הרכיבים הפשוטים במערכת. עם זאת, מערכת זו מוגבלת בדרך כלל לייצור של פלאוננול מתוך flavanone.

Introduction

פלאוולים הם מחלקת משנה מרכזית של פלאונואידים צמח והם מעורבים בפיתוח הצמח פיגמנטציה1,2,3. חשוב יותר, תרכובות אלה בעלי מגוון רחב של פעילויות בריאות מועילות, כגון אנטי סרטן4,5, נגד חמצוני6, אנטי דלקתיות7, אנטי השמנה8, נגד יתר לחץ דם9 , וזיכרון להיזכר מאפיינים10, המוביל למספר רב של מחקרים על אלה הצמח-מטבוליטים הנגזרים משני. באופן מסורתי, תרכובות אלה נגזרות בעיקר מחילוץ הצמח באמצעות ממיסים אורגניים. עם זאת, בשל התוכן הנמוך מאוד שלהם בצמחים11,12,13, עלות הייצור עבור רוב פלאוולים נשאר גבוה, אשר מטיל הגבלות גדולות על היישום שלהם בריאות ומזון תעשייה.

במהלך העשורים האחרונים, מדענים פיתחו מספר רב של שיטות כדי להפיק פלבונונואידים14,15. עם זאת, סינתזה כימית של אלה מולקולות מסובכות בעל מגוון של חסרונות פנימיים16. זה דורש לא רק ריאגנטים רעילים ותנאי תגובה קיצוניים, אלא גם צעדים רבים כדי לייצר מתחם פלאואיד מטרה14,17. יתר על כן, אתגר חשוב נוסף באסטרטגיה זו הוא סינתזה כיראאל של מולקולות פלאואיד פעיל. לכן, זה לא אסטרטגיה אידיאלית כדי לייצר פלבנואידים בקנה מידה מסחרי באמצעות סינתזה כימית16,17.

לאחרונה, מדענים פיתחו אסטרטגיה חלופית מבטיח לייצר אלה תרכובות טבעיות מסובך על ידי חיידקים הנדסה עם מסלול עבור ביואואיד ביולוגי18,19,20, מיכל בן 21 , 22, אשר פענחו בהצלחה בצמחים23. לדוגמה, דואן ואח ' הציגו מסלול ביוסינתטי בתוך הסרביסים שמרים לייצר kaempferol (kmf)24. מאלון ואח ' הופק אסטרגליב, פלאוסינט מניב, על-ידי החדרתflavanone 3-הידרוקסילאז (f3h), פאוננול סטנדרטים (fls1), ו-UDP-גלוקוז: פלונואיד 3-O-גלוקוסילאז UGT78K1 גנים לתוך האנהכיה קולי BL21 (DE3)17. למרות שיש די הרבה תפיסות, לא כל החיידקים מהונדסים גנטית לייצר את המוצרים של עניין בשל המורכבות של פלטפורמת הסלולר, אי התאמה בין אלמנטים גנטיים מסונתז מלאכותי מארחים, העכבות השפעה של מוצרי היעד נגד תאים מארחים, ואת חוסר היציבות של מערכת סלולרית הנדסה עצמה16.

עוד אסטרטגיה חלופית מבטיח ייצור פלונואיד היא להקים אשד רב אנזימטית בתוך מבחנה. צ ' נג ואח ' דיווחו כי בידור polyketides יכול להיות מסונתז בהצלחה על ידי הרכבת מסלול אנזימטי מלאה בסיר אחד25. זו אסטרטגיה סינתטית ללא תא לעקוף את ההגבלות של מפעל ייצור חיידקים וכך ניתן לייצר פלבנואידים כמות גדולה16.

לאחרונה, פיתחנו בהצלחה מערכת ביואנזים סינתטי כדי להמיר נרינגב (NRN) לתוך KMF בסיר אחד16. כאן, אנו מתארים את המערכת בפרטים הגדולים והשיטות הכרוכות בניתוח המוצרים. אנו מציגים גם שתי דוגמאות המשתמשות במערכת זו כדי לייצר kmf מ nrn ו-קוורצטין (qrc) מ eriodictyol (לורד). בנוסף, אנו דנים צעדים קריטיים של שיטה זו וכיווני מחקר עתידיים בביוסינתזה של פלבנואידים.

Protocol

1. לבודד RNA סך מרקמות הצמח26,27

  1. המגון את רקמות הצמח.
    1. לאסוף 100 מ"ג של רקמת צמח טרי (למשל, 4-שבוע-שתילים הישן של Arabidopsis thaliana). הקפא את הרקמה ואת הטיט וחומר מליטה בחנקן נוזלי, ואחריו שפשוף הרקמה לאבקה.
    2. הוסף 1 mL של מגיב בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) לתוך המרגמה. . המנה הכימית תהיה קפואה באופן מיידי המגון לבצע את דגימת הרקמה עם הסחוס כאשר הכימית הקפואה נמס.
    3. להעביר את ההגון לתוך שפופרת 1.5-mL, צנטריפוגה את המדגם ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, ולאחר מכן להעביר את הפתרון המגון הגון ניקה אחר טרי 1.5-mL אחר.
    4. מודקון את המדגם המתכלה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
  2. בודד RNA סך הכל.
    1. הוסף 0.2 mL של כלורופורם אל המגון, כיפה הצינור בבטחה, לנער את הצינור במרץ ביד עבור 15 s, ו מודקרת את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    2. צנטריפוגה את המדגם ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולהעביר את השלב העליון מימית החלק לצינור חדש 1.5-mL. המדגם מפריד לשלושה שלבים לאחר צנטריפוגה.
    3. להוסיף 0.5 mL של אלכוהול איזופרופילי לשלב המים, לנער את הצינור ביד בצורה נמרצת, ומארג את התערובת בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
    4. צנטריפוגה את התערובת ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ולהסיר את supernatant.
    5. לשטוף את הגלולה RNA פעם אחת עם 1 מ ל של 75% אתנול על ידי vortexing, ואחריו צנטריפוגה ב 7,500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    6. חזור על שלב ה1.2.5.
    7. האוויר יבש את הגלולה עבור 5-10 דקות ולפזר את ה-RNA ב diethylpyrocarbonate (DEPC) התייחס מים על ידי ליטוף למעלה ולמטה, ואחריו מדידת הריכוז RNA הכולל עם מיקרו ספקטרוסקופיה (ראה לוח חומרים).

2. לסנתז דנ א משלים (cDNA)28

  1. לסנתז את הסטרנד הראשון של cDNA באמצעות ערכת (ראה טבלת חומרים). הגדרת מערכת התגובה 20-μL כפי שמוצג בטבלה 1 ו-מגדיר את צינור התגובה בכלי PCR עבור 50 דקות ב 42 ° c, ואחריו מסיים את התגובה ב-85 ° c עבור 5 דקות. לאחסן את המוצר התגובה ב-20 ° c עבור הגברה עתידית של גנים.
ריאגנטיםאמצעי אחסון
שילוב dNTP, 2.5 ממ ' כל4.0 מיקרומטר
פריימר מיקס2.0 מיקרומטר
תבנית RNA1.0 μg
הפוך מאגר טרנסקריפטאז, 5 ×4.0 מיקרומטר
הפוך טרנסקריפטאז, 200 U/μL1.0 מיקרומטר
RNase-H חינם2Oעד 20.0 μL

טבלה 1: שעתוק הפוכה של ה-RNA לתוך cDNA

3. לבנות רקומביננטי פלמידים29

  1. עיצוב ה-PCR התחל.
    1. עיצוב ה-PCR התחל באמצעות תוכנה (ראה טבלת חומרים) מבוסס על רצפים של גנים אנזימים מרכזיים שהתקבלו ממסד הנתונים genbank ולסנתז את התחל על ידי חברה (ראה טבלת חומרים). בקצה של 5 התחל, להוסיף אתר אנזים הגבלה (למשל, באםהיי או EcoRI בפרוטוקול זה).
      הערה: השימוש התחל במחקר זה מוצג בטבלה 2.
רצף, 5 ' → ' 3 'מטרה
החוקהאמריקאילחיקוימעבר לצבע הגברה של הAtf3h ג'ין מערידרופסיס תאליאנה Bam אתר HI הוא נטוי ומצורף לשכפול לתוך pET32a (+).
המנוןב, באגההפוך פריימר עבור הגברה PCR של Atf3h gene מ . thaliana. Eco RI האתר הוא נטוי ומצורף לשכפול לתוך pET32a (+).
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCAפריימר קדימה עבור הגברה PCR של Atfls1 gene מ . thaliana. Bam אתר HI הוא נטוי ומצורף לשכפול לתוך pET32a (+).
לינה והגנההפוך פריימר עבור הגברה PCR של Atfls1 gene מ . thaliana. Eco RI האתר הוא נטוי ומצורף לשכפול לתוך pET32a (+).

שולחן 2: השימוש התחל במחקר הנוכחי

  1. שיבוט את הגנים לתוך וקטור ביטוי prokaryotic.
    1. להגביר את הגנים מן הגדיל הראשון של cDNA מסונתז באמצעות DNA באיכות גבוהה פולימראז (ראה טבלת חומרים). הגדר את מערכת התגובה של 100-μL כמוצג בטבלה 3 והפעל את מחזור ה-pcr הבא: 94 ° צ' עבור 2 דקות עבור הדציה הראשונית; לאחר מכן 35 מחזורים של 94 ° צ' עבור 30 s עבור הדנטורציה, 55 ° צ' עבור 2 דקות עבור ריפוי, ו 72 ° c עבור 1 דקות עבור סיומת; ואחריו התארכות סופית ב-72 ° c במשך 10 דקות. מצננים את תערובת התגובה ל -12 ° c.
      הערה: זמן ההארכה משתנה ונקבע על ידי אורך הגנים עם פולימוניזציה של כ-1000 בסיסים לדקה עבור רוב פולימרוסים.
    2. המחש את מוצרי ה-PCR (הנפוץ ביותר 5 μL) ב 1% agarose ג'ל ולטהר את קטע ה-DNA הספציפי מן המוצרים הנותרים באמצעות ערכת הניקוי של ה-DNA (ראה לוח חומרים).
    3. לעכל את קטע ה-DNA מטוהרים ואת וקטור (למשל, pET-32a) עם אנזימים הגבלה (למשל, Bamהיי או EcoRI בפרוטוקול זה). להקים מערכת תגובה 50-μL בצינור 0.2 mL PCR כפי שמוצג בטבלה 4 ו מקרין את התערובת ב 37 ° c עבור 3 h. הפרד את הדנ א מתעכל על 1% ג'ל.
    4. לשחזר את להקת ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ ג'ל (ראה טבלת חומרים). עוד לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת הניקוי DNA-up (ראה טבלת חומרים), ואחריו על ידי מדידת הריכוז של ה-dna עם מיקרו ספקטרוסקופיה (ראה לוח חומרים).
    5. ליגייט את השבר הגנטי לתוך ה-DNA וקטור ליניאריות באמצעות ליגאוה DNA T4 (ראה טבלת חומרים). הגדר תגובת לידה בצינור 1.5-mL כפי שמוצג בטבלה 5 ו-מגדיר את הצינור בטמפרטורת החדר עבור 2-3 h.
      הערה: היחס הטוחנת של הוספה לווקטור הוא משתנה והוא נע בין 3:1 ל-10:1.
    6. הוסף 2.5 μL של התערובת הלידנית לתוך 50 μL של כימית מוסמך Es, מיקס תאי קולי (g., TOP10 או DH5α), לערבב בעדינות, ולשמור על הצינור על הקרח 30 דקות. חום הלם את התאים ב 42 ° צ' עבור 90 s ומיד מקום הצינור על הקרח עבור 2 דקות.
    7. הוסף 200 μL של מדיום ליברות נוזלי ללא אנטיביוטיקה לתוך הצינור, מודקת את הצינור ב 37 ° c שייקר ב 220 rpm עבור 1 h. התפשטות 50-100 μL של התאים על צלחת LB המכיל 100 μg/mL אמפיצילין ו דגירה ב 37 ° c לילה.
ריאגנטיםאמצעי אחסון
Pfu מאסטר לערבב, 2 ×50.0 מיקרומטר
פריימר קדימה, 10 μM4.0 מיקרומטר
פריימר הפוכה, 10 μM4.0 מיקרומטר
cDNA2.0 מיקרומטר
H2O40.0 מיקרומטר

שולחן 3: הקמת מערכת תגובת PCR

ריאגנטיםאמצעי אחסון
קטע DNA/וקטור3.0 μg
Bam היי1.0 מיקרומטר
Eco רי1.0 מיקרומטר
מאגר הקיצוץ, 10 ×5.0 מיקרומטר
H2Oעד 50.0 μL

שולחן 4: העיכול כפול של שבר DNA/וקטור

ריאגנטיםאמצעי אחסון
הוסיףX μL (0.09 pmol)
וקטורY μL (0.03 pmol)
מאגר השקיה, 10 ×1.0 מיקרומטר
T4 DNA Ligase, 400 U/μL1.0 מיקרומטר
H2Oעד 10.0 μL

שולחן 5: הארכה של שבר גנים לתוך וקטור שחור

  1. . להקרין מושבות חיוביות
    1. איחסן מושבה אחת מן הצלחת LB לתוך 200 μL של מדיום ליברות נוזלי המכיל 100 μg/mL אמפיצילין ו-דגירה ב 37 ° צ', 250 rpm עבור 2-3 h.
      הערה: באופן כללי, בחר 4-8 מושבות לסינון מושבות חיוביות.
    2. להקים מושבה 10-μL התגובה הדומה לזה בשלב 3.2.1.
      הערה: השתמש 1 μL של תרבות LB במקום 1 μL של תבנית cDNA.
    3. המחש את מוצרי ה-PCR ב-1% ג'ל. איחסן את התרבות הנותרת עם תוצאה חיובית 3 מ ל של מדיום ליברות נוזלי המכיל 100 μg/mL אמפיצילין ו דגירה ב 37 ° c שייקר ב 250 rpm עבור 14-16 h.
    4. בודד דנ א פלמיד מ רקומביננטי E. coli תרבויות באמצעות ערכת המיכין פלמיד (ראה טבלת חומרים).
    5. לזהות את הפלמידים רקומביננטי מטוהרים על ידי הגבלה כפולה ניתוח אנזים (g., באםהיי ו- EcoRI בפרוטוקול זה). הגדרת מערכת התגובה 10-μL דומה לזה בשלב 3.2.3, ואחריו הדגירה ב 37 ° c עבור 3 h. לדמיין את הלהקה הספציפית שוחרר מתוך הרקומביננטי פלמיד על 1% ג'ל צמח.
  2. בדוק את רצפי הרקומביננטי-פלמידים החיוביים.
    1. שלח את הפלמידים לחברה. בשביל לסדר את הרצף לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח רצף DNA (ראה טבלת חומרים) על ידי השוואת הרצף שהתקבל מהחברה רצף עם רצף הייחוס שהתקבל ממסד הנתונים genbank.

4. אקספרס רקומביננטי אנזימים האנזים30

  1. הפוך את הרקומביננטי פלמיד הנכון ל -E. coli BL21 (DE3) המוסמכת.
    1. הוסף 0.1 μL של הפלדק עד 10 μL של E. coli BL21 (DE3) בשפופרת 1.5-mL על הקרח ולשמור את הצינור על הקרח עבור 5 דקות.
    2. חום הזעזועים התאים באמבט מים 42 ° c עבור 90 s ולמקם אותו על הקרח שוב עבור 2 דקות.
    3. הוסף 200 μL של LB נוזלי בינונית ללא אנטיביוטיקה ו-דגירה ב 37 ° c שייקר ב 220 rpm עבור 5 דקות.
    4. התפשטות 50 μL של שינוי בלוח LB אגר המכיל 100 μg/mL אמפיצילין ו-דגירה את הצלחת לילה בחממה 37 ° c.
  2. . לגרום לביטוי של הגנים
    1. ה3-5 מושבות מהצלחת לתוך צינור המכיל 3 מ ל של ליברות בינונית נוזלית עם 100 μg/mL אמפיצילין ו-דגירה ב 250 rpm ב 37 שייקר ° c בלילה.
    2. העבר את כל התרבות לילה לתוך 300 mL של ליברות נוזל בינוני המכיל 100 μg/mL אמפיצילין ו-דגירה ב 250 rpm ב 37 שייקר ° c עד הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 nm היא בין 0.4-0.6.
    3. להוסיף איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) לתוך התרבות עם ריכוז סופי של 0.2 מ"מ ולגרום לביטוי של הגנים ב 250 rpm, 20-22 ° c עבור 3 h.

5. לטהר את האנזים רקומביננטי חלבונים31

  1. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה של התרבות ב 4 ° צ', 12,000 x g עבור 10 דקות.
  2. השהה מחדש את הגלולה ב 15 מ ל של מאגר לפירוק חיידקי המכיל 0.1% טריטון X-100, 1 מ"מ EDTA, 10% גליצרול, 150 מ"מ מילימטר, 0.5 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL לוקיטין, ו 1 μg/mL pepסטטין בשנת 50 mM טריס-Cl (pH 8.0).
  3. Sonicate ההשעיה חיידקי לשחרר את החלבונים רקומביננטי אנזים, ואחריו צנטריפוגה ב 13,000 x g, 4 ° צ' עבור 10 דקות.
  4. הקציר ואת הסופר על הסופרנטנט בצינורות 1.5-mL ב 1 מ"ל/tube ולאחסן אותם ב-70 ° צ' לשימוש עתידי.
  5. החל 500 μL של שרף התגית שלו (ראה טבלת חומרים) לעמודת זיקה ריקה הניתנת לשימוש חוזר. לשטוף את שרף עם 5 כרכים מיטה של מים מוכי להשליך את האתנול בפתרון המניה. לאזן את שרף עם 10 כרכים מיטה של מאגר הכריכה הכוללת טריס-Cl (20 מ"מ, pH 7.9), סרפידול (10 מ"מ), ו-הנאל (0.5 M).
  6. החלת 4 מ ל של supernatant משלב 5.4 לתוך שאיפה של שרף לעיל לחסום שני קצוות של הטור בפקקים.
  7. מודאת התערובת ב 4 ° c על מסובבי במהירות נמוכה עבור 2 h.
  8. שטוף את שרף היתוך המאוגד עם 15 כרכים למיטה של מאגר הכריכה ב -4 ° c בקצב זרימה של 1 mL/min לפני הימנעות.
  9. הוסף 500 μL של מאגר משחררי (המכיל 20 מ"מ טריס-Cl (pH 7.9), 500 מילימטר שנאזול, 0.5 M הנאגל) לטור ומודב ב -4 ° c על מסובבי במהירות נמוכה עבור 10 דקות. לאסוף את הימנעות כמו דגימות חלבון מטוהרים.
  10. חזור על שלב 5.5 עוד ארבע פעמים.
  11. לשטוף את שרף ברציפות עם 10 כרכים מיטה של מים מוהים ו 3 כרכים מיטה של 20% אתנול. משרים את השרף ב-20% אתנול. חסום את הטור בפקקים ואחסן אותו ב -4 ° c.
  12. למדוד את הריכוז של חלבונים מטוהרים על ידי שיטת ברדפורד חלבון. לקבוע את טוהר החלבונים על 10% SDS-דף ג ' ל ולדמיין את הלהקות על ידי שיטת Coomassie כחול מכתים.
  13. הוסיפו גליצרול לפתרון החלבון הטהור לריכוז הסופי של 10% כדי לייצב את פעילות האנזים. . ואחסן אותו ב-80 ° c

6. לייצר פלאונול מתוך flavanone בתוך מערכת ביואנזיםמתורבת מלאכותית16

  1. . הכן מאגרים
    1. הפוך את מאגר סינתטי 2x ללא ברזל סולפט המורכב 200 mM טריס-HCl (pH 7.2), 16.4 mM α-חומצה, 0.8% נתרן ascorbate, ו 20% גליצרול. התמוססות 1.938 גרם של בסיס טריס, 0.640 g של נתרן ascorbate, 0.250 g של α-חומצה ביגלוטמית, ו 16 מ ל של גליצרול כדי 64 mL של מים מאוהים. להתאים את ה-pH ל 7.2 על ידי חומצה הידרוכלורית (HCl) ולהוסיף מים מוכי עד 80 mL. אחסן את המאגר ב-4 ° צ' לשימוש עתידי.
    2. הפוך פתרון מלאי 100x של 2 מ"מ ברזל גופרתי. התמוססות 55.6 מ ג של סולפט ברזליות בתוך 50 מ ל של מים מפוהים, מערבבים, ומוסיפים מים עד 100 mL.
    3. הפוך פתרון מניות של 25 מילימטר פלאואיד. מתמוסס פלונואיד ב מתנול ביסודיות ומאוחסן ב-20 ° C.
  2. הגדר מערכת סינתטית כדי לייצר פלאונול מתוך flavanone.
    1. הכינו את המערכת הסינתטית כפי שמוצג בטבלה 6.
    2. מודיית את התגובה ב 40 ° c בצינור 2.0-mL פתוח ב 600 rpm (בבלוק חום רועד) עבור 40 min.
    3. לסיים את התגובה על ידי הוספת 10 μL של חומצה אצטית 100 μL של אצטט אתיל.
    4. שעתיים לאחר מכן, העבירו את השלבים האורגניים לצינורות 1.5-mL לייבוש אוויר במכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
ריאגנטיםאמצעי אחסון
2 × מאגר סינתטי ללא ברזל גופרתי50.0 מיקרומטר
25 מ"מ פלאורול2.0 מיקרומטר
2 מ"מ ברזל גופרתי0.5 מיקרומטר
1 מ"ג/mL AtF3H2.5 מיקרומטר
1 מ"ג/mL AtFLS12.5 מיקרומטר
25 מילימטר פלאנוואן2.0 מיקרומטר
H2Oעד 100.0 μL

שולחן 6: המערכת הסינתטית המשמשת בפרוטוקול זה.

7. לנתח את מוצרי התגובה

  1. ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה דקה.
    1. בריכה 5 צינורות של דגימות פלונואיד משלב 6.2.4 ולהוציא 300 μL לייבוש האוויר. לפזר מחדש את אבקת פלונואיד ב 160 μL של מתנול. הכנת דגימות פלאואיד אותנטי עם ריכוזים סדרתיים של 12.5, 25, 50, 100, ו 200 ng/μL ב מתנול. טען 1 μL של דגימות התגובה ואת הדוגמאות פלונואיד אותנטי על לוחות פוליאמיד 6.
    2. הפעל את הצלחות הטעונות לדוגמה במערכת ממיס הכוללת כלורופורם/מתנול/אתיל אצטט/החומצה formic ביחס של 5.0:1.5:1.0:0.5.
    3. האוויר יבש את הצלחות. בטמפרטורת החדר רסס את הצלחות עם פתרון ethanolic של 1% מאלומיניום כלוריד (AlCl3), ולאחר מכן ייבוש האוויר שוב בטמפרטורת החדר.
    4. שלושים דקות מאוחר יותר, דמיינו את הנקודות על הצלחות תחת אור UV ב 254 ננומטר ולצלם תמונות.
    5. לנתח את הערך האפור של כל נקודה על התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (למשל, ImageJ v 1.51 j8 בפרוטוקול זה).
      1. פתח את ImageJ של התוכנה. לחץ על קובץ > פתוח כדי לפתוח את התמונה לניתוח.
      2. לחץ על הכלי השמאלי ביותר של בחירת משתמש Rבממשק המשתמש imagej. תאר את אזור הריבית (ROI) בתמונה עם העכבר ולחץ figure-protocol-16022 כדי לסמן את ההחזר הראשון.
      3. להעביר את הבחירה המלבנית עם העכבר ימינה כדי ROI הבא figure-protocol-16178 ולחץ כדי לסמן את ההחזר השני.
      4. חזור על השלב הקודם כדי לתייג את כל ה-ROIs האחרים.
      5. לחץ figure-protocol-16351 כדי ליצור מגרשים פרופילים עבור כל rois בחלון מוקפץ.
        הערה: בשלב זה, הכלי בחירת קו ישר בממשק המשתמש imagej יופעל באופן אוטומטי.
      6. השתמש בכלי בחירת קו ישר כדי לצייר קווי בסיס כדי להגדיר אזור סגור עבור כל שיא של ריבית.
      7. הפעל את כלי השרביט על-ידי לחיצה על הסמל המתאים בממשק המשתמש imagej. לחץ בתוך הפסגה כדי להציג תוצאות עבור כל הפסגות בחלון מוקפץ.
    6. הפוך את העקומה הרגילה מבוססת-חום של פלאואיד אותנטי על ידי התוויית ערכי האפור משלב 7.1.5.7 על פני ריכוזי פלונואיד המקביל משלב 7.1.1. לאחר מכן, חשב את התשואה של פלונואיד של עניין המיוצר בפרוטוקול זה בהתאם לנוסחה המתקבלת.
  2. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים וניתוחי כרומטוגרפיה/ספקטרומטר מסה (LC/MS)
    1. תהליך הדגימות משלב 7.1.1 ברצף באמצעות 0.45 יקרומטר ו 0.22 יקרומטר מסננים.
    2. טען את הדגימות לתוך מערכת בדיקות/LC/MS (ראה טבלת חומרים) והפרד את הדגימות ב 30 ° צ' באמצעות סי18 (4.6 × 150 מ"מ; זיהוי, 5 μm) עמודה. אליוט העמודה ב 1.0 mL/min על-ידי הדרגה של 10-85% (v/v) acetonitrile (ACN) במים (0-10 דקות, 10-25% ACN; 10-35 min, 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 דקות, 85-10% ACN; 50-60 דקות , 10% ACN) ולפקח על ספיגת הבוליות מ 200 אל 800 nm. בצע את ניתוח LC/MS במצב יון שלילי עם זרימת חנקן ייבוש של 10 L/min ב 300 ° צ' וזרימת גז נדן של 7 L/min ב 250 ° צ' ולאסוף נתונים באמצעות תוכנה מובנית (ראה טבלת חומרים).
    3. לחלץ כרומטוגרפים בודדים באורך גל כדי לחשב את אזורי שיא של דגימות התגובה ותרכובות פלאואיד אותנטי באמצעות תוכנה (ראה טבלת חומרים).
      1. פתח את התוכנית ' ניתוח איכותי ' ולחץ על קובץ ≫ פתיחת קובץ נתונים. בחר את הקבצים שיש לנתח בחלון פתיחת קובץ נתונים ולחץ על פתח כדי לפתוח את הקבצים.
      2. לחצו לחיצה ימנית על העכבר בחלון chromatogram Results ולאחר מכן את ה-xtract אקאטוגרמות ' בתפריט נפתח.
      3. פתח את תיבת הדו של ה - E xtract רואטוגרם. ברשימה סוג , לחץ על כרומאטוגרמות אחרים. בתיבה משולבת של גלאי , בחר DAD1. לאחר מכן לחץ על אישור כדי להציג את תוצאות הכיול בחלון התוצאות Chromatogram .
      4. לחץ על הסמל Mהשנתי Integration מעוגן בראש חלון התוצאות Chromatogram . צייר קו בסיס לשיא הדרוש לניתוח שילוב ידני עם העכבר.
      5. לחץ על הצג את רשימת פסגת האינטגרציה > כדי להציג את התוצאות.
    4. הפוך את עקומת התקן מבוססת-כיצד של פלאואיד אותנטי על ידי התוויית אזורי שיא משלב 7.2.3.5 כנגד ריכוזי פלונואיד המקביל משלב 7.2.1. לאחר מכן, חשב את התשואה של פלונואיד של עניין המיוצר בפרוטוקול זה בהתאם לנוסחה המתקבלת.
    5. ניתוח נתוני MS למסה המדויקת של תרכובות פלונואיד באמצעות תוכנה (ראה טבלת חומרים).
      1. חזור על שלבים 7.2.3.1-7.2.3.3.
      2. לחצו על הסמל ' בחירה ' בסרגל הכלים של התוצאות Chromatogram .
      3. בחר את שיא הריבית. לחץ לחיצה ימנית על העכבר בטווח שנבחר ולחץ על לחלץ Ms ספקטרום בתפריט הנפתח כדי להציג את התוצאות בחלון תוצאות הספקטרום MS .

תוצאות

F3H ו FLS1 הם שני אנזימים מפתח חשוב בהמרה של flavanone לתוך פלאורול בצמחים כמוצג באיור 1. לפתח מערכת ביוסינתטית מלאכותית להפקת פלאורול מתוך flavanone, Atf3h (גנבנק ההצטרפות לא. NM_ 114983.3) ו- Atfls1 (הצטרפותן של גנבנק לא. NM_ 120951.3) גנים שוכללו מן השתילים של בן 4 שבועות A. th...

Discussion

די מספר מחקרים מתמקדים בנגזרת של פלאוולים בשל היישום הפוטנציאלי שלהם בתחום הבריאות והמזון. עם זאת, מיצוי הצמח המסורתי באמצעות ממיסים אורגניים וסינתזה כימית בעלי חסרונות פנימיים, אשר מגבילים את השימוש שלהם בייצור של פלאוולים. כאן, אנו מדווחים על שיטה מפורטת להפקת פלאורול מתוך flavanone בסיר אח...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו היה נתמך כספית על ידי אוניברסיטת יאנגז'ו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, ג'יאנגסו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, שישה כישרון פסגות פרויקט במחוז ג'יאנגסו (גרנט No. 2014-SWYY-016), ו פרויקט ממומן על ידי התוכנית האקדמית עדיפות פיתוח של ג'יאנגסו מוסדות השכלה גבוהה (רפואה וטרינרית). אנו מודים למרכז בדיקות של אוניברסיטת יאנגז'ו לבדיקות וניתוח MS של פלונונואידים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717APCR amplification of genes with high fidelity
Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS systemAgilent Technologies, IncN/Aan equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aa software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system
dihydrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216intermediate product for producing kaempferol from naringenin
dihydroquercetinSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371intermediate product for producing quercetin from eriodictyol
DNA Clean-up KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301purification of PCR-amplified or gel-purified DNA
eriodictyolShanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160substrate for producing quercetin
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809bacteria strain for expressing target genes
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808bacteria strain for plasmid proliferation
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry SystemLabconco Corporation7740020an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent
Gel Extraction KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302purification of a DNA band from an agarose gel
Gel Imaging SystemShanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd.Tanon-
2500		an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparation of plasmids
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010final reaction product and standard substance
MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aa software for analysis of HPLC/LC/MS data
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLan equipment for determination of DNA/RNA concentration
naringeninSigma-Aldrich Co. LLCN5893substrate for producing kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010purification of His-tagged fusion proteins
pET-32a(+)Novagen69015-3plasmid for cloning and expressing target genes
plasmid sequencingGENEWIZ SuzhouN/Asequencing of recombinant plasmids
primer synthesisGENEWIZ SuzhouN/Asynthesis of PCR primers
quercetinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.Q111273final reaction product and standard substance
SuperRT cDNA Synthesis KitBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741synthesis of the first strand of cDNA from total RNA
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0016ligation of an insert into a linearized vector DNA
TrizolThermo Fisher Scientific15596018isolation of total RNA
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099a software for PCR primer design and DNA sequence analysis
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aa software for analysis of HPLC data

References

  1. Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
  2. Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
  3. Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
  4. Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
  5. Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
  6. Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
  7. Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
  8. Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
  9. Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
  10. Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
  11. Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
  12. Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
  13. Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
  14. Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
  15. Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
  16. Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
  17. Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
  18. Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
  19. Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
  20. Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
  21. Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
  22. Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
  23. Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
  24. Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
  25. Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
  26. Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  27. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  28. Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
  32. Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
  33. Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150flavanonekaempferolflavanone 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved