قدرة التمايز للخلايا الدهنية ارتشاح الابهري البشرية السلف

Summary

والهدف من هذا البروتوكول اختبار قدرة الخلايا السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية ارتشاح البشرية على التفريق في الأنساب خلية متعددة. تمت مقارنة التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام البشرية، التي من المعروف أن تفرق في adipocyte، أوستيوسيتي، والأنساب تشوندروسيتي.

Abstract

الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. أديبوجينيك التفريق بين الخلايا السلف إليه رئيسية يقود التوسع في الأنسجة الدهنية، والخلل الوظيفي في الاستجابة إلى السمنة. وهكذا فهم التغيرات في الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) ذات الصلة سريرياً في الأمراض الأيضية. ومع ذلك، كانت الدراسات السابقة يغلب أداؤها في الماوس والحيوانات الأخرى نماذج. هذا البروتوكول يستخدم البشرية الصدر بفات العينات التي جمعت من المرضى الذين يخضعون لجراحة الشريان التاجي بالاختلاس. الأنسجة الدهنية من الشريان الاورطي تصاعدي تم جمعها واستخدامها اكسبلانتيشن كسر الأوعية الدموية stromal. نحن سبق وأكدت وجود الخلايا الدهنية السلف في بفات البشرية مع القدرة على التفريق في المحتوية على الدهن adipocytes. في هذه الدراسة، ونحن حلل كذلك إمكانات تمايز الخلايا من الكسر الأوعية الدموية stromal، يفترض أنها تحتوي على خلايا السلف قوية متعددة. أننا بالمقارنة مع الخلايا المستمدة من بفات بنخاع العظام البشرية ماجستير للتمايز في أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. وبعد 14 يوما تمايز، استخدمت البقع محددة للكشف عن تراكم الدهن في adipocytes (س زيت أحمر)، رواسب كالسيفيك في خلايا أوستيوجينيك (الأليزارين الأحمر)، أو الجليكوزامينوجليكان والكولاجين في الخلايا تشوندروجينيك (Masson's Trichrome). بينما نخاع العظام MSC كفاءة متباينة في جميع الأنساب الثلاثة، قد الخلايا المستمدة من بفات أديبوجينيك وتشوندروجينيك المحتملة، ولكنها تفتقر إلى إمكانات osteogenic قوية.

Introduction

الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتشوندروجينيك الأنساب¹. يوسع هذا النسيج من خلال تضخم adipocytes ناضجة وتمايز نوفو دي ماجستير المقيمين في adipocytes. الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) يحيط بالأوعية الدموية وينظم وظيفة الأوعية الدموية^2،3. توسيع بفات الناجمة عن السمنة يؤدي إلى تفاقم أمراض القلب والأوعية الدموية. بينما كانت إمكانات لجنة السلامة البحرية مولتيبوتينت من المستودعات الدهنية تحت الجلد البشري جيدا درس^4،5، أي دراسات اكسبلانتيد وتقييم قدرة الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات، يحتمل نظراً للتمايز اختزاع للمشتريات. وهكذا، والهدف من هذا العمل تقديم منهجية explant ونشر الخلايا السلف من البشرية بفات الابهري من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية واختبار الميل إلى التفريق إلى أوستيوجينيك، تشوندروجينيك، والأنساب أديبوجينيك. لدينا مصدر بفات من الموقع لملامسة للاختلاس الالتفافية في ترتيب تصاعدي الشريان الاورطي للمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة يخضعون للاختلاس الشريان التاجي سيخضع لعملية جراحية. بفات طازجة-المعزولة انزيماتيكالي نات والكسر والأوعية الدموية stromal معزولة ويتم نشرها في المختبر، مما مكننا من اختبار قدرة التمايز للخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات للمرة الأولى.

استخدام الأولية مثقف البشرية بفات stromal الأوعية الدموية الكسر، اختبرنا ثلاث فحوصات مصممة لحمل الخلايا الجذعية/السلف للتمييز تجاه أديبوجينيك، أوستيوجينيك، أو تشوندروجينيك الأنساب. دراستنا السابقة حددت عدد سكان من CD73 + CD105 + و + PDGFRa (CD140a) الخلايا التي يمكن التفريق بين قوة في adipocytes⁶، على الرغم من أن لا تم اختبارها على مولتيبوتينسي. وينظم بفات مباشرة⁷لهجة والتهاب الأوعية الدموية. والأساس المنطقي لاختبار إمكانيات التمايز هذه الخلية رواية السكان هو البدء في فهم تأثير المتخصصة بفات في وظيفة الأوعية الدموية، والآليات لتوسيع بفات خلال السمنة. هذه المنهجية ويعزز فهمنا لوظائف خلايا الأنسجة الدهنية المشتقة السلف، وتمكننا من تحديد ومقارنة أوجه الشبه والاختلاف للخلايا السلف من مصادر مختلفة من الأنسجة. ونحن بناء على النهج المتبعة وتم التحقق من صحتها لعزل والتفريق بين لجنة السلامة البحرية نحو الأنساب المختلفة وتحسين الإجراءات إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات. هذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في ميادين الجذعية والسلف تنمية البحوث والأنسجة الدهنية للخلية.

Protocol

استخدام الأنسجة البشرية في هذه الدراسة تم تقييمها والموافقة عليها قبل "المؤسسية استعراض المجلس لولاية ماين المركز الطبي"، وتلقى جميع موظفي التدريب المناسب قبل التجريب.

1-الأعمال التحضيرية

1. جعل الانفصال من المخزن المؤقت قبل إعادة تشكيل 50 ملغ خالية من الحيوان كولاجيناز/ديسباسي مزيج أنا الحل مع 1 مل من نانوبوري ح₂سين تحضير 1 ملغ/مل العامل الحل عن طريق إضافة مل 49 من ارتفاع الجلوكوز دميم يحتوي على 1% w/v جيش صرب البوسنة إلى كولاجيناز المعاد تشكيلها/ ديسباسي الحل. تخزين 5 مل العامل مختبرين في-20 درجة مئوية والحارة إلى 37 درجة مئوية، استخدام مياه قبل حمام لاستخدام.
2. جعل حل المضادات الحيوية عن طريق إضافة 1 مل حل المضادات الحيوية/فطري x 100 (التركيز النهائي هو 200 وحدة/مل البنسلين، 200 وحدة/مل ستربتوميسين و 0.5 ميكروغرام/مل فونجيزوني) لمل 49 من هبس، وتخزين على الجليد.
3. إعداد الحل الجيلاتين (0.2% w/v) عن طريق تذويب الجيلاتين 200 مغ من الجلد البقري في 100 مل من نانوبوري ح₂O. اﻷوتوكﻻف الحل لمدة 20 دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
4. إعداد 500 مل وسائط النمو بفات: ارتفاع الجلوكوز DMEM/F12 مع الملحق الجلوتامين، بيروفات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وتستكمل مع 10% FBS وعامل مضادات الميكروبات 100 ميكروغرام/مل (انظر الجدول للمواد).
5. إعداد 50 مل أديبوجينيك تحريض وسائل الإعلام: مل 40.8 الجلوكوز عالية دميم، وتستكمل مع وسائط النمو بفات 7.5 مل، 500 ميليلتر من 100 × حل المضادات الحيوية/فطري (التركيز النهائي هو 100 وحدة/مل البنسلين و 100 وحدة/مل ستربتوميسين فونجيزوني 0.25 ميكروغرام/مل)، 0.5 مم إيبمكس (الأسهم 500 ملم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم)، 1 ميكرومتر الديكساميتازون (الأوراق المالية 1 مم في الإيثانول) 5 روزيغليتازون ميكرومتر (5 مم من الأوراق المالية في [دمس])، 33 ميكرون البيوتين (الأوراق المالية 66 ملم في [دمس])، 100 نانومتر الأنسولين (200 ميكرومتر الأوراق المالية في حمض الخليك 0.1 ٪) وحمض البانتوثينيك 20 ميكرومتر (الأسهم 100 ملم في ح₂ O).
6. إعداد 50 مل من مراقبة الإعلام التعريفي لنسب أديبوجينيك: مل 40.8 ارتفاع الجلوكوز دميم تستكمل مع وسائط النمو 7.5 مل بفات و 500 ميليلتر من القلم-بكتيريا (100 x الأسهم).
7. إعداد 50 مل أديبوجينيك صيانة وسائل الإعلام: الجلوكوز ارتفاع 41.5 مل دميم وتستكمل مع الوسائط في النمو بفات 7.5 مل من الخطوة 1، 3، 500 ميليلتر القلم-بكتيريا (100 x الأسهم)، الديكساميتازون 1 ميكرومتر (الأوراق المالية 1 مم في EtOH)، 33 ميكرون البيوتين (الأوراق المالية 66 ملم في [دمس])، 100 نانومتر الأنسولين (200 ميكرومتر الأسهم في التيار المتردد 0.1% حمض آتيك)، وحمض البانتوثنيك ميكرومتر 20 (الأسهم 100 ملم في ح₂س).
8. إعداد 500 مل وسائط النمو للأنساب أوستيوجينيك وتشوندروجينيك: αMEM الجلوكوز عالية وتستكمل مع 10% FBS، 1 x الجلوتامين تكملة (انظر الجدول للمواد)، و 5 مل من القلم-بكتيريا (100 x الأسهم).
9. إعداد 50 مل الإعلام التعريفي لنسب أوستيوجينيك: 50 مل وسائط النمو ماجستير نخاع العظام وتستكمل مع 10 الديكساميتازون نانومتر و 10 مم β-جليسيروفوسفاتي.
10. إعداد 50 مل الإعلام التعريفي لنسب تشوندروجينيك: 50 مل وسائط النمو ماجستير نخاع العظام وتستكمل مع 100 نانومتر الديكساميتازون و 50 ميكروغرام/مل اسكوربات-2-فوسفات الصوديوم 10 نانوغرام/مل TGFβ1. لظروف أوستيوجينيك وتشوندروجينيك، وسائط النمو ماجستير نخاع العظام القاعدية سيكون بمثابة وسائل الإعلام غير التعريفي.

2-البروتوكول 1: الثقافة البشرية بفات الخلايا من الكسر الأوعية الدموية Stromal

ملاحظة: هو مستأصل بفات من الموقع لملامسة الاختلاس في الشريان الاورطي تصاعدي تخديره من المرضى الذين يخضعون لإجراءات الفساد تجاوز الشريان التاجي. بفات الابهري وضعها في 15 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل جليد باردة ارتفاع جلوكوز F12 دميم ونقلها من غرفة العمليات إلى مختبر داخل ح 2 من الاستئصال. بفات الابهري الأنسجة المتخلص منها أثناء الإجراء تجاوز وكانت تعتبر البحوث المواضيع غير البشرية "مجلس المراجعة الداخلية" في المركز الطبي في ولاية ماين.

1. هذا البروتوكول قطعة ~ 500 ملغ بفات البشرية (حوالي 3 × 1 × 0.5 سم³). نقل بفات البشرية الطازجة من دميم إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل حل المضادات الحيوية. احتضان مع هزاز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بينما بفات في حل المضادات الحيوية، ذوبان الجليد قاسمة للانفصال من المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية.
2. إضافة 50 ميليلتر من حل المضادات الحيوية/فطري x 100 إلى 5 مل تفارق المخزن المؤقت وتعقيمها باستخدام مرشح حقنه 0.22 ميكرومتر. أضف 1 مل من محلول الجيلاتين 1 جيدا من صفيحة 24-جيدا. في غطاء الاندفاق الصفحي، استخدام الملقط العقيمة ومقص لنقل بفات من حل المضادات الحيوية إلى طبق بتري معقم. أضف 1 مل من الانفصال قبل حرارة المخزن المؤقت للأنسجة وفرم ناعما الأنسجة كاملة إلى الطين (لا قطعة أكبر من ~ 2 × 2 مم²) استخدام الملقط العقيمة ومقص التشريح.
3. نقل الطين 1 مل إلى 4 مل تفارق المخزن المؤقت واحتضان الأنبوب على جانبها في شاكر مداري حرارة قبل 37 درجة مئوية 200 لفة في الدقيقة ح 1. بعد ح 1، لا قطع الأنسجة مرئية ستكون حاضرة، والحل سوف تظهر كتعليق خلية الملبدة بالغيوم.
4. تصفية الحل من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 مجموعة فوق أنبوب مخروطي 50 مل. شطف في المصفاة مع حل المضادات الحيوية إضافية 10 مل لالتقاط خلايا أكبر عدد ممكن. لا الضغط المصفاة.
5. بيليه الخلايا لمدة 12 دقيقة في 300 x ز في أجهزة الطرد مركزي دلو يتأرجح.
   ملاحظة: بعد الطرد المركزي، سيتم فصل الأنبوب إلى طبقة أعلى دهنية adipocytes والطور البيني بيليه. بيليه هو كسر الأوعية الدموية stromal الذي يحتوي على خلايا بطانية والخلايا المناعية، وخلايا الدم، وخلايا السلف.
6. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من حبس والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ز. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 2 يغسل في حبس. بعد الغسيل النهائي، خلايا الدم الحمراء. محاولات متكررة مع عدد من المخازن المؤقتة المتوفرة تجارياً وأوقات الاحتضان أدت إلى تخفيضات ملحوظة في مرفق خلية السلف وقدرتها على البقاء.
7. نضح الجيلاتين من لوحة 24-جيدا. تغسل بلطف x 1 جيدا مع حبس لإزالة الجيلاتين غير منضم.
8. ريسوسبيند بيليه كسر الأوعية الدموية stromal مع خلايا الدم الحمراء سليمة في 1 مل من وسائط النمو والبذور على المغلفة الجيلاتين جيدا. إضافة FGF2 البشرية (حراكه في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.01% w/v) إلى تركيز نهائي من 25 نانوغرام/مل في الثقافة المتوسطة. احتضانها ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
9. في اليوم التالي، إزالة وسائط النمو وغسل الآبار 5 س مع حبس لإزالة خلايا الدم الحمراء والخلايا الميتة. أضف 1 مل من وسائط النمو جديدة تستكمل مع 25 نانوغرام/مل FGF2.
10. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة، مع التأكد من الملحق مع 25 نانوغرام/مل FGF2 جديدة في كل مرة.
11. الخلايا عادة التوصل إلى التقاء 100% 7-10 أيام بعد اكسبلانت؛ مرور الخلايا ثم:
    1. نضح نمو وسائل الإعلام والمياه والصرف الصحي أحادي الطبقة 2 x 1 مل حبس. نضح حبس كل من الآبار، وإضافة بضع قطرات من الحل الانفصال من الخلية.
    2. اضغط ودوامه اللوحة عدة مرات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لمدة 5 – 7 دقيقة رفع الخلايا. إضافة ~ 1 مل من جديد الثقافة المتوسطة إلى خلايا منفصلة وتوزيع 500 ميليلتر للآبار 2 لوحة 24-جيدا وكل تحتوي على 500 ميليلتر وسائط النمو 25 ng FGF2.
12. الاستمرار في توسيع نطاق الخلايا البشرية المستمدة من بفات كما هو مبين في الخطوة السابقة. ينبغي أن يكون كل مرور لا يزيد عن انقسام 1:2. الخلايا هي باساجيد 5 – 7 مرات قبل تخصيص لفحوصات التمايز.

3-بروتوكول 2: الثقافة نخاع العظام البشرية ماجستير المستعمرات

ملاحظة: تجميد نخاع العظام البشرية ماجستير معزولة كما هو موضح⁸ وتخزينها كبداية الممر تجميد الأرصدة وسائل الإعلام (70% FBS 20% القاعدية دميم و 10% [دمس]) في ~ 100,000 خلية/مل في السائل ن₂.

1. سرعة ذوبان الجليد قنينة نخاع العظام ماجستير من سائل ن₂ في حمام الماء 37 درجة مئوية واللوحة إلى بئر واحدة للوحة 6-بئر الثقافة التي تحتوي على 3 مل وسائط النمو ماجستير واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
2. في اليوم التالي، نضح ماجستير ثقافة الإعلام وتغسل الخلايا 3 x 2 مل من حبس. في التقاء 100%، نضح وسائط النمو وتغسل الخلايا 3 x 2 مل من حبس. إضافة 500 ميليلتر/بئر الخلية المفرزة الحل واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لأدنى 5 الحنفية هي أخرجت اللوحة تأمين كافة الخلايا وتوزيع المحتويات إلى الآبار 2 من لوحة 6-البئر الذي يحتوي على وسائط النمو ماجستير 2 مل بالتساوي.
3. توسيع نخاع العظام البشرية وماجستير المستمدة من بفات بالتوازي لحوالي 5 – 7 مقاطع أو حتى يتحقق كميات كافية للاختبار.

4-البروتوكول 3: لوحة والحث على أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك

1. لوحة الأرقام المناسبة نخاع العظام والخلايا المستمدة من بفات الواحد أيضا من لوحة 12-جيدا ومناسباً وإنشاء نسخ متماثلة لكل حالة تجريبية. أديبوجينيك وشروط osteogenic ~ 200، 000 – 225,000 الخلايا/بئر مطلوبة، لظروف تشوندروجينيك، 150,000 – 175,000 هناك حاجة إلى خلايا/جيدا.
   ملاحظة: نحن يتعارض مع الحد ني N = 3 آبار نسخ متماثل للتحكم والناجمة عن ظروف كل سلالته التجريبية لتشغيل ما مجموعة 2 مستقلة (N = مجموع 6 replicates).
2. إلغاء إقران خلايا من السكان خلية السلف بفات البشرية والسكان MSC نخاع العظام البشرية باستخدام الخلية المفرزة الحل وحضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ دقيقة 5 تجمع السكان في قارورة مخروطية الشكل منفصلة 15 مل. تدور القنينة إلى أسفل في 500 x ز 7 دقيقة بيليه الخلايا. ريسوسبيند في 1 مل من برنامج تلفزيوني، واستخدام هيموسيتوميتير لتقدير عدد الخلايا.
3. لوحة الخلايا في أطباق 12-جيدا كما هو مبين في الخطوة 4، 1. تقديم أطباق منفصلة للمتعمد وغير المتعمد أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وظروف حيث أن الشرط غير فعل يمكن أن تكون ثابتة في نقطة سابقة من الزمن دون الإخلال باستمرار ثقافة الشرط الإرادي.
4. إضافة 1.5 مل أديبوجينيك والاستقراء أوستيوجينيك وسائل الإعلام لكل بئر من الشرط الإرادي. إضافة 1.5 مل أديبوجينيك ووسائل الإعلام غير التعريفي osteogenic لكل بئر المستحثة من غير شرط. تبدأ الحضانة أديبوجينيك والسكان osteogenic خلية المتعمد وغير المتعمد في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
5. تدور أسفل حجم الخلايا السلف بفات البشرية ونخاع العظام البشرية MSCs لمدة 7 دقائق في 500 x زالمتبقية.
6. تحديد وحدة التخزين اللازمة ريسوسبيند نخاع العظام المتبقية والكريات الخلية المستمدة من بفات لتحقيق كثافة 100,000 الخلايا/10 ميليلتر (⁶ 10 خلايا/مل). ريسوسبيند الكريات في حجم المحسوبة من وسائط النمو ماجستير لتحريض النسب تشوندروجينيك. تحرك بلطف حجم الخلايا صعودا وهبوطاً باستخدام بيبيت لضمان توزيع متجانس.
7. "الماصة؛" معالجة تجميعية 10 ميليلتر من الحل خلية مركزة داخل المركز من كل بئر لتشكيل ميكروماس خلايا 100,000. ضع 1 مل من العقيم ح₂س في البئر المجاورة لمنع التبخر. احتضان ثقافات ميكروماس ح 2 في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ للسماح ميكروماس للتجميع.
8. وبعد ساعتين، بعناية إضافة وسائط التمايز تشوندروجينيك ارتفعت مع 10 نانوغرام/مل TGFβ1 البشرية لكل من الآبار التي يسببها الشرط. عناية إضافة 1.5 مل من وسائط الإعلام غير تعريفية (وسائط النمو ماجستير نخاع العظام) إلى الآبار غير الناجمة عن الشرط. استخدام لوحات 12-بئر منفصلة لشروط المتعمد وغير المتعمد حيث أن الشرط غير فعل يمكن أن تكون ثابتة في نقطة سابقة من الزمن.

5-البروتوكول 4: الثقافة، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك لمدة 14 يوما

1. الثقافة أوضاع جميع الأنساب ثلاثة المتعمد وغير المتعمد لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية و 5% CO₂، تحديث وسائل الإعلام كل يومين. في يوم 4، تغيير شرط النسب أديبوجينيك المستحث من تحريض وسائل الإعلام لصيانة وسائل الإعلام لما تبقى من المقايسة.
2. إصلاح كافة الشروط غير المستحث في الفورمالين 10% على 12 حاء تخلص فورمالين ويغسل كل إصلاح الآبار x 2 في برنامج تلفزيوني لإزالة جميع آثار الفورمالين. تخزين لوحات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى التجهيز.
3. الثقافة شروط المستحث لما مجموعة 14 يوما، تحديث وسائل الإعلام كل يومين. إضافة TGFβ1 جديدة في 10 نانوغرام/مل التركيز النهائي مع كل تحديث لوسائل الإعلام التعريفي تشوندروجينيك. ما زالت الثقافة نسب أديبوجينيك في أديبوجينيك صيانة وسائل الإعلام ونسب osteogenic التعريفي وسائط الإعلام، وتحديث كل يومين. في يوم 14، إصلاح ظروف الإطلاق المتعمد ح 12 في الفورمالين 10% لتلطيخ.
4. كشط أو صب ميكروماس في حالة تشوندروجينيك المستحث في كاسيت للتضمين. يذوي ميكروماس في سلسلة من الحمامات الكحول تركيز متزايد لمدة 5 دقائق، بدءاً من 70%، ثم 80%، مرتين في 95 في المائة، ومرتين أكثر في الكحول المطلق. ضع الكاسيت في عامل ديلكوهوليزيشن وثم أخيرا تضمين الكاسيت في شمع البارافين لتمزيقها وتلطيخ.

6-البروتوكول 5: تلطيخ شرط أديبوجينيك مع النفط يا أحمر

1. تحضير حل مخزون "النفط الأحمر يا" بإذابة 350 مغ من "زيت الأحمر يا" في 100 مل الكحول 100%. مزيج ح 2 مع شريط ضجة والفراغ من خلال فلتر 0.2 ميكرون. ويمكن تخزين حل الأسهم في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة سنة واحدة.
2. إعداد "س الأحمر النفط" تعمل الحل بخلط 3 أجزاء الحل الأسهم إلى أجزاء 2 diH₂0 (مثلاً 60 مل من محلول الأسهم إلى 40 مل diH₂0). تركيز "الزيت الأحمر يا" النهائي في الحل العامل 2.1 ملغ/مل.
3. قم بإزالة كافة السوائل من الآبار. تغسل كل x 2 جيدا مع الايزوبروبانول 60 في المائة، مع التأكد من إزالة جميع المياه من الجانبين من الآبار. نضح الايزوبروبانول 60% وإضافة "س الأحمر النفط" العامل الحل بسرعة دون لمس جدران الآبار لتغطية الجزء السفلي. من الأهمية بمكان أن هذه الخطوة تتم بسرعة حيث لم تجف الآبار.
4. حالما تتم إضافة "س الأحمر النفط"، احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
5. إزالة كافة "يا الحمراء النفط" وفورا إضافة المقطر ح₂يغسل سين مع المقطر ح₂س لمسافة 10 أمتار للبدء في إزالة غير منضم "الأحمر النفط" سين بعد 10 دقيقة، نضح "الزيت الأحمر س" وكرر الإجراء الغسيل 3 x.
6. بمجرد اكتمال الغسيل، إضافة برنامج تلفزيوني والصورة الخلايا. تخزين الخلايا الملون في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.

7-البروتوكول 6: تلطيخ شرط أوستيوجينيك مع أحمر الأليزارين

1. قم بإزالة كافة السوائل من كل بئر. إضافة حجم 2% "الأليزارين الأحمر" وصمة عار الحل المناسب لكل بئر (1.5 مل كل بئر للوحة 12-جيدا) وآماله لوحة جنبا إلى جنب بلطف حتى الحل الذي يغطي تماما أسفل البئر.
2. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة "الأليزارين الأحمر" من الآبار. شطف بلطف كل أيضا أربع مرات مع المقطر ح₂س، مع أخذ الحذر عدم إزاحة بلورات الكالسيوم. السماح لتجف.

8-البروتوكول 7: تلطيخ شرط تشوندروجينيك مع ماسون في تريتشرومي

1. خبز الشرائح في فرن جاف 60 درجة مئوية للحد الأدنى 30 مقاطع ديبارافينيزي والصودا الكاوية إلى الماء المقطر.
   1. لترطيب, وضع الشرائح في ثلاثة إينكوبيشنز 5 دقائق مع وكلاء ديلكوهوليزيشن، تليها إينكوبيشنز 5 دقائق تنازلي تركيزات الكحول على النحو التالي: اثنان في 100% (الإيثانول المطلقة)، واثنان في الكحول 95%، اثنان في 80%، اثنان في 70 في المائة، وأخيراً اثنان في المقطر سين الشرائح يمكن أن تبقى ح₂في ح₂س بينما أعد مثبت في بوين.
2. مكان 40 مل من مثبت في بوين في جرة بلاستيكية كوبلين البروكولي (كشف). الميكروويف عالية لتحقيق درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية. ضع الشريحة في حل ساخنة لمدة 20 دقيقة؛ وللوقوف على العداد المشمولة. تغسل في إدارة مياه الحنفية لمدة 10 دقيقة أو حتى يختفي كل من اللون الأصفر.
3. وصمة عار المقاطع في توضع في ويجيرت عن 10 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في تشغيل مياه الحنفية لمدة 10 دقائق.
4. وصمة عار المقاطع في فوكسين حمض القرمزي الحل في بيبريتش للحد الأدنى 10 يغسل 3 × 10 دقيقة في مياه الحنفية. إذع الشرائح في حل حامض فوسفوتونجستيك/فوسفوموليبديك لمدة 10 دقائق. لا شطف.
5. وضع الشرائح مباشرة في حل الأزرق الانيليني لأدنى 10 شطف مع اثنين من الانخفاضات قصيرة في مياه الحنفية.
6. وضع الشرائح في حل حامض الخليك 1% 3 إلى 5 دقيقة يغسل بماء الصنبور للحد الأدنى 1 مكان في الإيثانول 95% للحد الأدنى 1 ديهيدراتي كما هو مبين في الخطوة 5، 4 وجبل مع راتنج الاصطناعية.

النتائج

عزلة كسر الأوعية الدموية stromal من بفات البشرية

ويبين الشكل 1A تخطيطي للمنطقة التشريحية التي حصلت فيها بفات تغمر الشريان الاورطي تصاعدي. ونحن سابقا وصف السكان المريض يمر الشريان التاجي الالتفافية التطعيم الذي كانت...

Discussion

الخلايا الدهنية السلف من مستودعات مختلفة اختلافاً كبيرا في النمط الظاهري والتمايز المحتمل⁹. استزراع المتكفل بفات المستمدة من مانح واحد مريض في تحريض متزامنة أسفل ثلاثة مختلفة الأنساب، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وتشوندروجينيك، يسمح بإجراء تحقيق القدرة pluripotent هذه الرواية الت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G