人主动脉周脂肪祖细胞的分化能力

摘要

该方案的目的是测试从人类血管周围脂肪组织衍生的祖细胞分化为多个细胞谱系的能力。将分化与人骨髓间充质干细胞进行了比较, 骨髓间充质干细胞被认为分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞谱系。

摘要

脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨生谱系。祖细胞的脂肪分化是推动脂肪组织扩张和肥胖功能障碍的主要机制。因此, 了解血管周围脂肪组织 (pvat) 的变化在临床上与代谢疾病有关。然而, 以前的研究主要是在老鼠和其他动物模型中进行的。该方案使用从冠状动脉旁路移植术患者中采集的人体胸腔 pvat 样本。从上升主动脉收集脂肪组织, 用于解释间质血管部分。我们先前证实了脂肪祖细胞在人 pvat 中的存在, 有能力分化为含有脂质的脂肪细胞。在这项研究中, 我们进一步分析了细胞从基质血管部分的分化潜力, 大概包含多能祖细胞。我们比较了 pvat 衍生细胞与人骨髓 msc 的分化, 分为脂原、成骨和软骨源谱系。经过14天的分化, 特定的污渍被用来检测脂肪细胞 (油红色 o) 的脂质积累, 成骨细胞 (alizarin 红) 的钙沉积, 或糖胺多糖和软骨细胞的胶原蛋白 (马松的三丁目)。骨髓 msc 有效地分化为所有三个谱系, pv 衍生细胞具有脂原和软骨生成的潜力, 但缺乏强大的成骨潜力。

引言

脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨^{生谱系 1}。该组织通过成熟脂肪细胞的肥大和常驻 msc 向脂肪细胞的新分化而扩张。血管周围脂肪组织 (pvat) 包围血管, 调节血管功能^2,3。肥胖引起的 pvat 扩张加剧了心血管疾病。虽然人类皮下脂肪库中 msc 的多能潜力已经得到了 4^,5的很好的研究, 但没有任何研究解释和评价人 pv 衍生祖细胞的分化能力, 这可能是由于采购的侵入性。因此, 这项工作的目的是提供一种方法, 以外植体和繁殖祖细胞从人主动脉 pvat 从心血管疾病患者, 并测试他们的倾向, 以分化为成骨性, 软骨原生, 和脂原系。我们的 pvat 来源来自正在接受冠状动脉旁路移植手术的肥胖患者主动脉上旁路移植术吻合部位。新鲜分离的 pvat 是酶样离解和间质血管部分在体外分离和繁殖, 使我们能够首次检测人 pvat 衍生祖细胞的分化能力。

我们使用原代培养的人 pvat 基质血管部分, 我们测试了三种检测方法, 旨在诱导干细胞祖细胞分化为脂肪原、成骨或软骨生谱系。我们先前的研究确定了 cd73 +、cd105 + 和 pdgfra + (cd140a) 细胞的数量, 这些细胞可以有力地分化为脂肪细胞^6,尽管它们的多效力没有经过测试。pvat 直接调节血管张力和炎症⁷。测试这种新型细胞群体分化潜力的基本原理是开始了解 pvat 对血管功能的特殊影响, 以及 pvat 在肥胖期间扩张的机制。这种方法增强了我们对脂肪组织衍生祖细胞功能的理解, 使我们能够识别和比较来自不同组织来源的祖细胞的异同。我们建立在既定和经过验证的方法, 以分离和区分 msc 对不同的血统和优化程序, 以最大限度地提高人类 pv 衍生祖细胞的生存能力。这些技术在干细胞和祖细胞研究和脂肪组织发育领域有着广泛的应用。

研究方案

这项研究中人体组织的使用情况得到缅因州医疗中心机构审查委员会的评估和批准, 所有人员在实验前都接受了适当的培训。

1. 准备工作

1. 通过将50毫克无动物性胶原酶/分离酶与 1 ml 纳米 h 2 o_混合物 i 溶液制成离解缓冲. 在重组后的胶原蛋白中加入含有 1% w/v bsa 的高 dmem 的 49 ml, 制备 1 mg/ml 工作溶液。溶解溶液。使用前使用前使用水浴, 将5毫升工作的等价物存放在-20°c, 并加热至37°c。
2. 添加100μnomicic:arimeycyinycyesyesky 溶液1毫升 (最终浓度为 200 units/青霉素、200 unitsl 链霉素和 0.5μml fungizone), 使 hbss 的49毫升为 4 9 毫升, 并储存在冰上。
3. 在100毫升的纳米 h2o. 高压灭菌器中溶解200毫克明胶, 制备明胶溶液 (0.2%_w/v), 溶液 20分钟, 并存放在4°c。
4. 制备500毫升的 pvat 生长介质: 高葡萄糖 dmem/f12, 补充谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠, 辅以10% 的 fbs 和100μgml 抗菌剂 (见材料表)。
5. 制备50毫升脂原诱导介质: 40.8 ml 高血糖 dmem, 辅以 7.5 ml pvat 生长介质, 500μl 的100x 抗生素/抗生素抗真菌溶液 (最终浓度为 100 units/青霉素, 100 unitsl 链霉素和0.25 μgml fungizone),0.5 mm ibmx (0.1 m nM 中的 500 mm 库存), 1μm 地塞米松 (乙醇库存 1 mm), 5μm robherglazone (dmso 中的 5 mm 库存)、33μm 生物素 (dmso 中的 66 mm 库存)、100 mm 胰岛素 (0.1% 醋酸中的200μm 库存) 和20μm 泛酸 (h 2 中的 100 mm 库存)o)。
6. 为脂原系制备50毫升的控制诱导介质: 40.8 ml 高血糖 dmem, 辅以 7.5 ml pvat 生长介质和500μl 的笔链球 (100x 库存)。
7. 准备 50 毫升脂质维护介质 : 41 . 5 ml 高血糖 dmem , 再加上步骤 1 . 3 中 7 . 5 ml pvat 生长介质 , 500μl链球菌 ( 100x 库存 ) , 1μm地塞米松 ( etoh 中的 1 mm 库存 ) 、33μm生物素 ( dmso 中的 66 mm 库存 ) 、 100 nm 胰岛素 ( 0 . 1% 交流中的200μm库存 )和20μm 泛酸 (h2o 中的 100 mm 库存).
8. 为成骨和软骨源谱系准备500毫升生长介质: 高糖αmem 补充 10% fbs, 1x 谷氨酰胺补充剂 (见材料表), 和5毫升的笔链球 (100x 股票)。
9. 为成骨系准备50毫升诱导培养基:50 毫升的骨髓 msc 生长介质, 辅以 10 nm 地塞米松和 10 mm β-甘油磷酸盐。
10. 为软骨源性谱系准备50毫升诱导培养基:50 毫升的骨髓 msc 生长介质, 辅以 100 nm 地塞米松、50μgml 抗坏血酸钠-2-磷酸酯和 10 ngml tgml tgfβ1。对于成骨和软骨病, 基础骨髓 msc 生长介质将作为非诱导介质。

2. 议定书 1: 从基质血管组分培养人 pvat 细胞

请注意:pvat 从接受冠状动脉旁路移植术的麻醉病人的上行主动脉上的移植吻合部位切除。主动脉 pvat 被放置在一个15毫升的锥形含有10毫升冰冷高葡萄糖 dmem f12, 并从手术室转移到实验室在2小时内的切除。主动脉 pvat 是在旁路手术中丢弃的组织, 并已被视为非人类的主题研究, 由缅因州医疗中心的内部审查委员会。

1. 该协议适用于 ~ 500 毫克的人 pvat (约 3 x 1 x 0.5 厘米 3)。将新鲜的人 pvat 从 dmem 转移到含有25毫升抗生素溶液的50毫升锥形管中。在4°c 下摇晃20分钟。当 pvat 处于抗生素溶液中时, 在37°c 时解冻分离缓冲液。
2. 在5毫升离解缓冲液中加入50μl 的100μl 抗生素-抗真菌溶液, 并使用0.22μm 注射器过滤器进行消毒。在24孔板的1井中加入1毫升的明胶溶液。在层流罩中, 使用无菌钳和剪刀将 pvat 从抗生素溶液转移到无菌培养皿中。在组织中加入1毫升预热分离缓冲液, 并使用无菌钳和解剖剪刀将整个组织细切成浆液 (不超过 2 x 2 毫米²的块)。
3. 将 1 ml 浆料转移到4毫升离解缓冲液中, 并在预热的37°c 轨道振动台中孵育管, 每小时200转1小时。1小时后, 将不会出现可见的组织块, 溶液将显示为混浊细胞悬浮液。
4. 通过在50毫升锥形管上设置的70μm 电池过滤器过滤溶液。用额外的10毫升抗生素溶液冲洗过滤器, 以捕获尽可能多的细胞。不要挤压过滤器。
5. 在一个晃动的桶式离心机中, 以 300 x克的速度将细胞颗粒在一起12分钟。
   请注意:离心后, 管将被分离成脂肪顶层的脂肪细胞, 一个周期, 和一个颗粒。颗粒是包含内皮细胞、免疫细胞、血细胞和祖细胞的基质血管部分。
6. 在 300 x 克的情况下, 将颗粒在 hbss 和离心机的10毫升中重新使用5分钟。对 hbss 中总共洗2次操作重复此步骤。最后清洗后, 不要将红血球裂解。反复尝试与几个商业上可用的缓冲和孵化时间导致明显减少祖细胞依恋和生存能力。
7. 从24孔板中吸收明胶。用 hbss 轻轻清洗1x 井, 去除未结合的明胶。
8. 将完整的红血球在1毫升的生长培养基和种子中复制基质血管分数颗粒, 并将其保存在涂膜孔上。将人 fgf2 (重新悬浮在 pbs 中补充 0.01% bsa wv) 添加到培养基中的最终浓度为 25 ngml。用5% 的 co2 在37°c 下孵化 24小时.
9. 第二天, 用 hbss 去除生长介质, 清洗5x 井, 去除红血球和死细胞。加入1毫升新鲜的生长介质, 辅以 25 ngml fgf2。
10. 每48小时更换一次介质, 确保每次补充 25 ngml 新鲜 fgf2。
11. 细胞在外植体后7-10 通常达到100% 融合;通过细胞, 然后:
    1. 在1毫升 hbss 中吸入生长介质和洗涤单层2倍。从井中吸收所有 hbss, 并添加几滴细胞离解溶液。
    2. 多次轻拍和旋涡, 用5% 的 co2 在37°c 下孵育 5-7分钟, 以提升细胞. 在分离细胞中加入 ~ 1 毫升的新鲜培养基, 并将500μl 分配到24孔板的2口井中, 每口都含有500μl 生长介质和25纳克 fgf2。
12. 如上一步所述, 继续扩大人类 pv 衍生细胞。每个段落不应大于 1: 2 拆分。细胞在分配分化检测之前被传代5-7 次。

3. 议定书 2: 培养人类骨髓 msc 殖民地

请注意:人骨髓 msc 如所述,如所述, 在液体 n 2 中被分离并作为早期通道冷冻储存在冷冻培养基中 (70% fbs 20% 的基础 dmem 和 10% dmso).

1. 在37°c 的水浴和板中, 从 n2 液体中快速解冻一小瓶骨髓 msc, 将其解冻到含有3毫升 msc 生长介质的6井培养板的井, 并在37°C 和 5% co 2 处孵育一夜。
2. 第二天, 吸入 msc 培养基, 在 hbss 2 毫升中清洗细胞3倍。在100% 融合时, 吸入生长培养基, 在 hbss 2 毫升中清洗细胞3倍。加入 500μl/井细胞分离溶液, 在37°c 和 5% co2 下孵育 5分钟, 点击板, 确保所有细胞被移出, 并将含量均匀地分配到含有2毫升 msc 生长介质的6井板的2口井。
3. 将人骨髓和 pvat 衍生的 msc 平行展开大约5-7 通道, 或直到达到足够的检测量。

4. 协议 3: 板和诱导脂肪生成, 骨质生, 软骨原系

1. 板适当数量的骨髓和 pv 衍生细胞每孔12孔板和适当的复制为每个实验条件。对于脂肪生成和成骨条件, 需要 ~ 200000–225 000 细胞/井, 对于软骨生条件, 需要15000–175000细胞井。
   请注意:我们运行了至少 n = 3 复制井, 用于控制每个实验谱系的诱导条件, 总共运行 2次 (n = 6个复制总数)。
2. 利用细胞脱离溶液和37°c 和 5% co2 孵育5分钟池群将人类 pvat 祖细胞群和人骨髓 msc 群体中的细胞分离到单独的15毫升锥形小瓶中。将小瓶向下旋转, 在 500 x克下7分钟, 以颗粒细胞。在1毫升的 pbs 中重新移植, 并使用血细胞计估计细胞数量。
3. 如步骤4.1 所示, 将细胞放在12井菜品中。为诱导和非诱导的脂原、成骨和条件提供单独的菜肴, 以便在不干扰诱导条件的持续培养的情况下, 在较早的时间点固定非诱发条件。
4. 在诱导条件下的每口井中加入 1.5 ml 的脂原和成骨诱导培养基。在非诱导条件下的每口井中加入 1.5 ml 的脂原和成骨非诱导培养基。在37°c 和 5% co2 条件下开始培养脂肪原生、成骨诱导和非诱导细胞_群。
5. 将人 pvat 祖细胞和人骨髓骨髓 mscs 的剩余体积向下旋转 7分钟, 在 500 x克.
6. 确定重新悬浮剩余骨髓和 pv 衍生细胞颗粒所需的体积, 以达到 100, 000 细胞的密度 10μl (10^{6 细胞})。在 msc 生长介质的计算量中再利用颗粒进行软骨源诱导。使用管道轻轻上下移动细胞的体积, 以确保均匀分布。
7. 将浓缩细胞溶液的10μl 液滴滴入每口井的中心, 形成一个由 100, 000个细胞组成的微囊。将1毫升无菌 h2o 放置在相邻的井中, 以防止蒸发.在37°c 和 5% co2 条件下培养微囊培养 2小时, 使微屁股聚集 。
8. 2小时后, 小心地在每个诱导条件井中加入 10 ngml 人 tgfβ1的软骨分化培养基。在非诱导条件井中小心加入 1.5 ml 的非诱导介质 (骨髓 msc 生长介质)。对于诱导和非诱发条件, 使用单独的12孔板, 以便在较早的时间点固定非诱发条件。

5. 协议 4: 培养致病性、成骨性和软骨源性14天

1. 在37°c 和 5% co2 条件下, 将所有三个系的诱导和非诱导条件培养 4天,每2天更新一次培养基。第4天, 在试验的剩余时间内, 将诱导的脂原谱系条件从诱导培养基改为维持介质。
2. 将10% 福尔马林中的所有非诱导条件固定在12小时内, 在 pbs 中处理并清洗所有固定井 2倍, 以去除福尔马林的所有痕迹。在加工前, 将板材存放在 pbs 中。
3. 培养诱导条件总共 14天, 每2天刷新一次媒体。在 10 ngml 的最后浓度下加入新鲜的 tgfβ1, 每次刷新软骨原诱导培养基。继续培养脂肪原维持介质和成骨系诱导培养基中的脂原谱系, 每2天清爽一次。在第14天, 将所有诱导条件固定在10% 福尔沙林中, 为染色提供12小时的诱导条件。
4. 将诱导软骨生的情况下的微屁股刮成或倒进盒式磁带中嵌入。在一系列日益集中的酒精浴池中脱水 5分钟, 从70% 开始, 然后是 80%, 95%, 绝对酒精含量增加两倍。将盒式磁带放入脱碳剂中, 最后将盒式磁带嵌入石蜡中, 以便进行切片和染色。

6. 议定书 5: 用油红 o 染色脂肪生成条件

1. 通过在100% 异丙醇的100毫升中溶解350毫克的油红色 o 来制备油红色 o 库存溶液。与搅拌棒混合 2小时, 并通过0.2μm 过滤器进行真空。库存溶液可在室温下在黑暗中储存1年。
2. 通过将3个部分的库存溶液混合到 2份 dih 2 0 (例如,库存溶液的 60 ml 至 40 ml dih₂0) 来制备油红色 o 工作溶液。工作溶液中油红 o 的最终浓度为 2.1 mg/ml。
3. 从井中取出所有液体。用60% 异丙醇清洗每口 2 x 的井, 确保完全去除井边的所有水。吸出60% 异丙醇, 快速添加油红 o 工作溶液, 而无需接触井壁覆盖底部。关键是要迅速完成这一步骤, 这样井就不会干涸。
4. 一旦油红色 o 被添加, 孵育10分钟在室温与温和的摇晃。
5. 取出所有油红色 o, 并立即加入蒸馏的_h2o 与蒸馏的 h2 o_10m, 开始去除未粘结的油红色 o。10分钟后, 吸气油红色 o, 并重复清洗程序3倍。
6. 清洗完成后, 添加 pbs 并对细胞进行成像。将染色细胞存放在4°c 的 pbs 中。

7. 议定书 6: 用阿利扎林红染色成骨条件

1. 从每口井中取出所有液体。在每口井中加入适当体积的 2% Alizarin 红色染色溶液 (12 孔板每口井 1.5 ml), 并轻轻倾斜板的一侧到另一侧, 直到溶液完全覆盖井底。
2. 在室温下孵化15分钟。从井里取出阿利扎林红。用蒸馏的_h2o轻轻冲洗每口井四次, 注意不要移开钙晶体。让它干燥。

8. 议定书 7: 用马松的三丁质染色软骨病

1. 在60°c 的干烤箱中烘烤 30分钟, 将脱水和水合物部分放入蒸馏水中。
   1. 要补充水分, 请用脱碳剂在三个5分钟的孵育中滑行, 然后在酒精浓度下降的情况下进行5分钟的孵育, 具体如下: 两孵育在 100% (绝对乙醇), 两次在95% 乙醇时, 两孵育在 80%, 两次在70% 时, 最后在蒸馏中进行两分钟孵育h2o. 滑块可以保持在 h2o, 而 bouin 的固定剂准备好了.
2. 将布宁固定剂的40毫升放入塑料微共蛋白罐 (未发现) 中。微波在高处, 使温度达到55°c。将滑块放入加热溶液中 20分钟;让站在柜台上。在自来水中清洗10分钟或直到所有的黄色消失。
3. 在魏格特的血红素中染色 10分钟, 在自来水中清洗10分钟。
4. 在北布里奇的朱红色酸富新溶液中染色片 10分钟, 在自来水中清洗3x10分钟。在磷钨酸溶液中的 mordant 滑动10分钟。不要冲洗。
5. 将滑梯直接放入苯胺蓝色溶液中 10分钟, 在自来水中短暂浸渍两次冲洗。
6. 将滑块放入1% 醋酸溶液 3 ~ 5分钟, 在自来水中清洗 1分钟, 在95% 乙醇中放置 1分钟, 脱水 1分钟, 然后用合成树脂安装。

结果

人 pvat 间质血管成分的分离

图 1a显示了在上升主动脉上方获得 pvat 的解剖区域示意图。我们之前描述了接受冠状动脉旁路移植术的患者群体, 这些样本是从这些样本中提取的。图 1 b显示了手术后获得的人类 pvat 的一个例子。图 1c...

讨论

不同仓库的脂肪祖细胞在表型和分化潜力^上差异很大。从单个患者捐献者身上培养 pvat 衍生的祖细胞, 同时诱导出三个不同的谱系, 即脂原体、成骨和软骨遗传, 可以对这款小说的多能能力进行控制性的研究祖细胞的数量。本报告中描述的方法可用于检测人 pvat 祖细胞的分化能力, 并了解其在调节 pvat 病理和血管张力方面的作用。这项技术的一些好处是它的简单性和使用的原发性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G