인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

요약

이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.

초록

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보. Adipogenic 조상 세포의 분화 응답 비만으로 지방 조직 확장 및 부전을 운전 하는 주요 메커니즘입니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT)에 대 한 이해 변경 임상 관련 대사 질환에 따라서 이다. 그러나, 이전 연구는 주로 마우스와 다른 동물에서 수행 되었습니다 모델. 이 프로토콜은 관상동맥 바이패스 접목 수술 환자에서 인간의 흉부 PVAT 샘플을 사용 합니다. 오름차순 대동맥에서 지방 조직 수집 되었고 stromal 혈관 분수의 explantation에 대 한 사용. 우리는 이전을 포함 하는 지질으로 차별화 하는 수 용량을 가진 인간 PVAT에 많은 조상 세포의 존재 확인 adipocytes. 이 연구에서 우리가 더 분석 stromal 혈관 분수에서 세포의 감 별 법 잠재력 아마도 다 강력한 조상 세포를 포함 하. 우리는 인간의 골 수 MSC osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 계보에 차별화를 PVAT 파생 셀 비교. 차별화의 14 일, 다음 특정 얼룩 adipocytes (기름 빨간 O)에서 지질 축적을 감지 활용 했다 osteogenic 셀 (Alizarin Red), 또는 있다 chondrogenic 셀 (Masson의 Trichrome) 콜라겐에 calcific 예금. MSC는 효율적으로 모든 3 개의 계보에 분화 하는 골 수, 동안 셀 PVAT 파생 했다 adipogenic 및 chondrogenic 잠재적인, 하지만 강력한 osteogenic 잠재력 부족.

서문

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보¹. 이 조직을 통해 성숙한 adipocytes의 비 대와 드 노 보 차별화 adipocytes에 거주 MSC의 확장합니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 혈관을 포위 하 고 조절 관 기능^2,3. PVAT 확장 비만 유발 심혈 관 병 리 악화. 동안 인간의 피하 지방이 많은 저장소에서 MSC의 multipotent 잠재력 잘 공부^4,5, 아니 연구 explanted 고로 인해 가능성이 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 용량 평가 조달의 침입입니다. 따라서,이 작품의 목표 explant에서 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포를 전파 하 고 그들의 성향에 osteogenic 차별화, chondrogenic, 및 adipogenic 계보를 테스트 하는 방법을 제공 하는 것 이다. 관상동맥 바이패스 접목 수술 비만 환자의 대동맥 오름차순에 바이패스 이식의 문 합의 사이트에서 PVAT의 우리의 소스가입니다. 갓 격리 PVAT 효소 해리 이며 stromal 혈관 분수 격리 및 생체 외에서, 처음으로 인간의 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 능력 테스트를 전파.

기본 교양된 인간 PVAT stromal 혈관 분수를 사용 하 여, 줄기/뿌리 세포 osteogenic, adipogenic 또는 chondrogenic 계보 차별화를 유도 하도록 설계 된 3 개의 분석 테스트. 우리의 이전 연구 식별 CD73 +, CD105 + 및 PDGFRa + (CD140a) 튼튼하게 adipocytes⁶, 차별화 수 있는 세포의 인구 그들의 multipotency 테스트 하지는 않지만. PVAT는 직접 혈관 음색 및 염증⁷을 통제 한다. 이 새로운 세포 인구의 차별화 가능성을 테스트 하기 위한 근거 혈관 기능에 PVAT의 특수 영향 및 비만 중 PVAT 확장의 메커니즘을 이해 하기 시작 하는. 이 방법론은 지방 조직 파생된 조상 세포의 기능에 대 한 우리의 이해를 강화 하 고 식별 하 고 유사점과 다른 조직 소스에서 조상 세포의 차이점을 비교할 수 있습니다. 우리는 분리 하 고 다른 혈통으로 MSC 차별화에 대 한 설립 및 검증 된 방법에 따라 구축 하 고 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 생존 능력을 극대화 하는 절차를 최적화. 이러한 기술은 줄기와 조상 세포 연구와 지방 조직 개발의 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

프로토콜

이 연구에서 인간의 조직에의 사용 되었다 평가 하 고는 제도적 검토 보드의 메인 의료 센터에 의해 승인 모든 인사 실험 전에 적절 한 훈련을 받았다.

1입니다. 준비

1. 버퍼를 분리 하 게 50 mg을 재구성 하 여 동물 무료 콜라/dispase 혼합 나 솔루션 nanopure H₂o. 준비 1 mg/mL 작업 솔루션의 1 mL 높은 포도 당 1 %w / v BSA 재구성된 콜라에 포함 된 DMEM의 49 mL을 추가 하 여 / dispase 솔루션입니다. -20 ° C와 따뜻한 물 목욕 전에 사용 하 여 사용 하는 37 ° c에서 5 mL 작업 aliquots을 저장 합니다.
2. HBSS, 49 mL를 100 x 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 200 단위/mL 페니실린, 200 단위/mL 스 및 0.5 µ g/mL fungizone)의 1 mL을 추가 하 여 항생제 솔루션을 확인 하 고 얼음에 저장.
3. Nanopure H₂o. 압력솥 20 분에 대 한 솔루션의 100 ml에서 소 피부에서 200mg 젤라틴 용 해 하 여 젤라틴 솔루션 (0.2 %w / v)을 준비 하 고 4 ° c.에 저장
4. PVAT 성장 매체의 500 mL를 준비: 높은 포도 당 DMEM/F12 글루타민 보충, 나트륨 pyruvate와 나트륨 중 탄산염, 보충 10 %FBS 100 µ g/mL 항균 에이전트 ( 재료의 표참조).
5. 50 mL adipogenic 유도 미디어 준비: 40.8 mL 높은 포도 당 DMEM, 7.5 mL PVAT 성장 매체, 500 µ L 항생제/antimycotic 솔루션 (최종 농도 100 단위/mL 페니실린, 100 단위/mL 스 0.25 µ g/mL fungizone), x 100의 보충 0.5 m m IBMX (0.1 M NaOH의 주식 500 m m), 1 µ M dexamethasone (에탄올의 주식 1 m m), 5 μ rosiglitazone (DMSO의 주식 5 m m), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (200 µ M 주식 0.1% 초 산), 그리고 20 µ M 판토텐산 (100 m m H₂ 에서 재고 O)입니다.
6. Adipogenic 계보에 대 한 제어 유도 미디어의 50 mL를 준비: 40.8 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 매체와 펜-strep (100 x 주식)의 500 µ L 보충.
7. 50 mL adipogenic 유지 보수 미디어 준비: 41.5 mL 높은 포도 DMEM 7.5 mL PVAT 성장 미디어 단계의 1.3, 500 µ L 펜 strep (100 x 사진), 1 µ M dexamethasone (EtOH에 1 m m 재고), 33 µ M biotin (DMSO에 66 m m 재고), 100 nM 인슐린 (0.1 %ac 200 µ M 재고 보충 etic 산), 그리고 20 µ M pantothenic 산 (H₂O의 주식 100 m m).
8. 성장 매체의 500 mL osteogenic 및 chondrogenic 계보에 대 한 준비: 높은 포도 당 αMEM 보충 10 %FBS, 1 x 글루타민 보충 ( 재료의 표참조), 펜-strep (100 x 사진)의 5 ml.
9. 유도 미디어의 50 mL osteogenic 혈통에 대 한 준비: 50ml 10 nM dexamethasone와 10 m m β-glycerophosphate 보충 골 MSC 성장 매체의.
10. Chondrogenic 계보에 대 한 유도 미디어의 50 mL를 준비: 100 nM dexamethasone, 50 µ g/mL 하는데-2-인산 나트륨, 그리고 10 ng/mL TGFβ1 보충 골 MSC 성장 매체의 50 mL. Osteogenic chondrogenic 조건에 대 한 기저 골 MSC 성장 매체 비 유도 미디어 될 것입니다.

2. 프로토콜 1: 문화 인간 PVAT 셀 Stromal 혈관 분수에서

참고: PVAT는 마 취 환자 관상동맥 우회 이식 절차의 오름차순 대동맥에 문 합 이식의 사이트에서 잘라냅니다. 대동맥 PVAT는 15 mL 원뿔 포함 10 mL 얼음 차가운 높은 포도 당 DMEM F12에에서 배치 하 고 수술 실에서 절제의 2 h 이내 실험실으로 전송 됩니다. 대동맥 PVAT 우회 절차 동안 폐기 조직 이며 메인 의료 센터의 내부 검토 위원회에 의해 비 인간 대상 연구로 간주 되었습니다.

1. 이 프로토콜의 인간 PVAT (약 0.5 c m³x 1 x 3) ~ 500 mg 조각입니다. DMEM의 신선한 인간의 PVAT 25 mL 항생제 솔루션을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 락을 4 ° c.에 20 분을 품 어 항생제 솔루션에는 PVAT를 실행 하는 동안 37 ° c.에 분리 버퍼의 약 수를 녹여
2. 5 mL 분리 버퍼에 100 x 항생제/antimycotic 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 필터 주사기 0.22 μ m를 사용 하 여 소독. 1 24-잘 접시의 젤라틴 해결책의 1 mL를 추가 합니다. 층 류 두건에 멸 균 페 트리 접시에 항생제 솔루션에서 PVAT를 전송 소독 집게와가 위를 사용 합니다. 조직에 미리 데워 진된 분리 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 잘게 (조각 ~ 2 x 2 m m²보다 더 큰) 슬러리에 전체 조직을 말하다 소독 집게와 해 부가 위를 사용 하 여.
3. 4 mL 분리 버퍼에 1 mL 슬러리를 전송 하 고 1 시간에 200 rpm에서 37 ° C에 미리 데워 진된 궤도 통에서 옆에 튜브를 품 어. 1 시간 후 아니 보이는 조직 조각 있을 것입니다, 그리고 솔루션 흐린 세포 현 탁 액으로 표시 됩니다.
4. 50 mL 원뿔 튜브 위에 설정 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 솔루션을 필터링 합니다. 가능한 많은 셀을 캡처하는 추가 10 mL 항생제 솔루션 여과기를 헹 구 십시오. 스 트 레를 짠 다 하지 않습니다.
5. 300 x g 스윙 양동이 원심 분리기에서 12 분에 대 한 셀 작은
   참고: 원심, 후 튜브 adipocytes를 interphase 및 펠 릿의 지방 상위 계층으로 구분 됩니다. 펠 릿은 내 피 세포, 면역 세포, 혈액 세포, 및 조상 세포를 포함 하는 실질 혈관 분수.
6. HBSS 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. HBSS 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다. 최종 세척 후 붉은 혈액 세포를 lyse 하지 마십시오. 여러 상용 버퍼와 보육 시간 반복된 시도 조상 세포 부착 및 생존에서 표시 된 감소에 들어서있다.
7. 24-잘 접시에서 젤라틴 발음 부드럽게 씻어 HBSS 언바운드 젤라틴을 제거 하는 잘 1 x.
8. 성장 매체와 젤라틴 코팅에 씨의 1 mL에 그대로 적혈구와 펠 릿 stromal 혈관 분수 resuspend 잘. 문화 매체에 25 ng/mL의 최종 농도에 인간 FGF2 (0.01% BSA w/v로 보충 하는 PBS에 resuspended)를 추가 합니다. 5% CO₂와 37 ℃에서 24 h에 대 한 품 어.
9. 다음 날, 제거 성장 미디어와 세척 적혈구 세포와 죽은 세포를 제거 하는 HBSS 5 x 우물. 25 ng/mL FGF2 보충 하는 신선한 성장 매체의 1 mL에 추가 합니다.
10. 미디어 25 ng/mL로 보충을 확인 하 고 모든 48 h 변경 신선한 FGF2 각 시간.
11. 셀은 일반적으로 도달 100% 합류 explant; 후 7-10 일 다음 통로 셀:
    1. 성장 미디어와 세척 단층 2 발음 1 ml HBSS x. 우물에서 모든 HBSS 발음 하 고 세포 분리 솔루션의 몇 방울을 추가 합니다.
    2. 그리고 소용돌이 격판덮개 여러 번 누르고 5% CO₂ 셀 리프트 5-7 분 동안 37 ° C에서 품 어. 분리 된 세포에 신선한 문화 매체의 ~ 1 mL을 추가 하 고 24-잘 접시, 각 포함 500 µ L 성장 매체 및 25의 2 웰 스에 500 µ L를 배포 FGF2 ng.
12. 이전 단계에 표시 된 대로 인간의 PVAT 파생 셀 확장을 계속 합니다. 각 통로 1:2 분할 보다 더 큰 되어야 합니다. 세포 감 별 법 분석에 대 한 할당 하기 전에 5-7 번 passaged는.

3. 프로토콜 2: 문화 인간 골 MSC 식민지

참고: 인간의 골 MSC 설명된⁸ 로 고립 되 고 초기 통로 주식을 냉동으로 저장 액체 N₂~ 100000 셀/mL에서 미디어 (70% FBS 20% 기저 DMEM과 10 %DMSO)를 고정 합니다.

1. 빠르게 MSC 성장 매체의 3 mL를 포함 하는 6-잘 문화 접시의 한 잘에 37 ° C 물 목욕 및 격판덮개에 액체 N₂ 에서 골 수 MSC의 유리병을 해 동 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 밤새 품 어.
2. 다음 날, MSC 문화 미디어를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 100% 합류에 성장 매체를 발음 하 고 3 세포를 씻어 HBSS 2 mL에 x. 500 µ L/잘 세포 분리 솔루션을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO₂ 5 분 모든 셀 수 있도록 접시 dislodged 탭에서 품 어 2 웰 스 2 mL MSC 성장 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 내용을 균일 하 게 배포.
3. 인간의 골 수 및 PVAT 파생 MSC 병렬 약 5-7 구절 또는 테스트에 대 한 충분 한 수량 달성 되었습니다 때까지 확장 합니다.

4. 3 프로토콜: 접시 그리고 Osteogenic, Adipogenic 및 Chondrogenic 계보를 일으킬

1. 골 고 잘 12-잘 접시 및 적절 한 당 PVAT 파생 셀의 플레이트 적절 한 숫자는 각 실험 조건에 대 한 복제합니다. Adipogenic 및 osteogenic 조건, ~ 200, 000-225000 셀/잘 필요, chondrogenic 조건, 150000-175, 000 셀/잘 필요 합니다.
   참고: 우리는 N의 최소 실행 제어를 위한 3 복제 우물 = 고 2 독립의 총 실행 각 실험 혈통에 대 한 조건을 유도 (N = 총 6 복제).
2. PVAT 조상 세포 인구를 사용 하 여 셀 분리 솔루션 및 부 화 37 ° C, 5% CO₂ 별도 15 mL 원뿔 튜브로 5 분 풀 인구에 대 한 인간의 골 MSC 인구 세포 연결이 해제 됩니다. 500 x g 7 분 작은 셀에서 아래로 유리병을 회전 합니다. PBS의 1 mL에 resuspend를 사용 하는 hemocytometer 셀 번호를 예상.
3. 4.1 단계에서 표시 된 대로 셀 12 잘 요리에서 접시. 비 유도 상태 유발된 상황의 문화를 계속 방해 하지 않고 이전 시간에서 고정 될 수 있도록 유도 및 유도 비 adipogenic, osteogenic, 그리고 조건에 대 한 별도 요리를 제공 합니다.
4. 각 잘 유발 조건에 adipogenic 및 osteogenic 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. 각 잘 유도 되지 않은 상태를 adipogenic 및 osteogenic 비 유도 미디어의 1.5 mL를 추가 합니다. Adipogenic 및 osteogenic 유도 및 비-유도 세포 인구 37 ° C, 5% CO₂의 부 화를 시작 합니다.
5. 500 x g7 분에 대 한 인간의 골 MSCs 및 인간 PVAT 조상 세포의 나머지 볼륨 아래로 회전 합니다.
6. 나머지 골 및 100, 000 셀/10 µ L (10⁶ 셀/mL)의 밀도 달성 하기 위해 펠 릿 PVAT 파생 셀 resuspend 하는 데 필요한 볼륨을 결정 합니다. Chondrogenic 계보 유도 MSC 성장 매체의 계산된 볼륨에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 위아래로 피펫으로 균일 분포를 사용 하 여 셀의 볼륨을 이동 합니다.
7. 각 잘 100, 000 셀의 micromass를 중심으로 집중된 셀 솔루션의 10 µ L 드롭릿 플라스틱. 증발을 방지 하기 위해 인접 한 잘에 살 균 H₂O의 1 mL를 배치 합니다. 2 h 37 ° C, 5% CO₂ 는 micromass를 허용에 대 한 micromass 문화를 품 어 집계에.
8. 2 시간 후, 신중 하 게 chondrogenic 차별화 미디어 10 ng/mL와 함께 아군을 추가 유발 조건 우물의 각 인간 TGFβ1. 신중 하 게 비 유도 조건 우물에 비 유도 미디어 (골 MSC 성장 미디어)의 1.5 mL를 추가 합니다. 유도 및 유도 비 조건에 대 한 별도 12-잘 접시를 사용 하 여 비 유도 조건 이전 시간에서 고정 될 수 있도록.

5. 프로토콜 4: 문화 Adipogenic, Osteogenic, 그리고 14 일에 대 한 Chondrogenic 계보

1. 37 ° C, 5% CO₂, 상쾌한 미디어 매 2 일에서 4 일 동안 모든 3 개의 계보의 유도 및 비 유도 조건 문화. 하루에 4, 분석 결과의 나머지 부분에 대 한 유지 보수 미디어 사용 유도 미디어에서 유도 adipogenic 계보 조건을 변경 합니다.
2. 12 헤 포 르 말린의 Dispose에 대 한 10% 포 르 말린에 비 유발 조건을 모두를 해결 하 고 세척 모든 고정 포 르 말린의 모든 흔적을 제거 하는 PBS에 2 x 우물. 처리까지 4 ° C에서 PBS에 접시 저장 합니다.
3. 14 일, 2 일 마다 미디어를 새로 고침의 총 유도 조건 문화. 10 ng/mL 최종 농도에서 각 새로 고침으로 chondrogenic 유도 미디어의 신선한 TGFβ1를 추가 합니다. Adipogenic 유지 보수 미디어와 osteogenic 혈통 유도 미디어, 2 일 마다 상쾌한 adipogenic 혈통 문화를 계속 합니다. 14 일에 얼룩에 대 한 10% 포 르 말린에 12 h에 대 한 모든 유도 조건 수정.
4. 긁어 또는 포함을 위한 카세트에 유도 chondrogenic 조건에는 micromass를 부 어. 5 분, 70%, 80%, 95%에서 두번 그리고 두번 절대 알코올에 더에서 시작 점점 더 집중된 알코올의 시리즈에서 micromass를 탈수. Dealcoholization 에이전트에 카세트를 놓고 마지막으로 파라핀 왁 스 단면 및 얼룩에 카세트를 포함 합니다.

6. 프로토콜 5: Adipogenic 상태 기름 얼룩 빨간 O

1. 100% 소 프로 파 놀의 100 ml에서 기름 빨간 O의 350 mg를 용 해 하 여 기름 빨간 O 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 저 어 바와 진공 2 h에 대 한 믹스. 재고 솔루션 1 년 동안 실 온에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
2. 기름 빨간 O 3 부품 2 부품 diH₂0 재고 솔루션 (예: 60 mL 40 mL diH₂0 재고 솔루션)를 혼합 하 여 솔루션을 작업을 준비 합니다. 작업 솔루션에 기름 빨간 O의 최종 농도 2.1 mg/mL 이다.
3. 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 워시 60% 소 프로 파 놀, 완전히 우물의 측면에서 모든 물을 제거 있는지와 각 잘 2 배. 60% 소 프로 파 놀을 발음 하 고 신속 하 게 표지 하단에 우물의 벽을 건드리지 않고도 기름 빨간 O 작업 솔루션을 추가 합니다. 그래서 우물 건조 하지 않습니다이 단계를 신속 하 게 수행이 중요 하다.
4. 일단 기름 빨간 O 추가 되 면 부드러운 락으로 실 온에서 10 분 동안 품 어.
5. 모든 기름 빨간 O를 제거 하 고 즉시 증류수 H₂o. 세척 증류수 H₂O 10 m 언바운드 기름 빨간 o.를 제거 하기 시작을 위한 추가 10 분 후 기름 빨간 O 발음 하 고 세척 절차 3 반복 x.
6. 세척 완료 되 면, PBS를 추가 하 고 셀을 이미지. 4 ° c.에 PBS에 얼룩진된 셀 저장

7. 프로토콜 6: 얼룩 알리자린 레드 Osteogenic 조건

1. 각 우물에서 모든 액체를 제거 합니다. 각 잘 (12-잘 접시 잘 당 1.5 mL)을 2% 알리자린 레드 얼룩 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 솔루션은 완전히 우물의 바닥을 커버 때까지 부드럽게 접시 측면을 기울기.
2. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 우물에서 알리자린 레드를 제거 합니다. 부드럽게 증류수 H₂O, 주의 하지 칼슘 결정을 꺼내 려 복용 4 시간 각각 잘 린스. 건조를 허용 합니다.

8. 7 프로토콜: Trichrome Masson의 Chondrogenic 상태를 얼룩

1. 구워 30 분 동안 60 ℃ 건조 오븐에서 슬라이드 증류수를 Deparaffinize 및 수화물 섹션.
   1. Dealcoholization 에이전트, 이어서 다음과 같이 알코올 농도 하강에 5 분 외피와 3 5 분 외피에 슬라이드 rehydrate, 장소: 100% (절대 에탄올) 2, 95% 알코올에 2, 2에서 80%, 70%, 2 개 그리고 마지막으로 두에 소 주 H₂H₂O Bouin의 정착 제를 준비 하는 동안 유지 수 O. 슬라이드.
2. (발견) 플라스틱 microwavable coplin jar에 Bouin의 정착 액의 장소 40 mL. 55 ° c 온도가지고 높은 전자 레인지 장소 슬라이드 20 분;에 대 한 열 솔루션 카운터에 하자 스탠드 커버. 실행 10 분 동안 또는 노란 색의 모두 사라질 때까지 수돗물에 씻어.
3. 10 분 동안 수돗물을 실행에 10 분 세척에 대 한 Weigert의 hematoxylin에 섹션을 얼룩.
4. 10 분 씻어 수돗물에 3 x 10 분에 대 한 Beibrich의 스 칼 렛 산 fuchsin 솔루션 섹션을 얼룩. 슬라이드 10 분 phosphotungstic/phosphomolybdic 산 성 솔루션에 반 린스 하지 않습니다.
5. 10 분 린스 수돗물에 2 개의 짧은 딥으로 아닐린 블루 솔루션에 직접 슬라이드를 배치 합니다.
6. 5.4 단계 및 합성 수 지로 산에서 1 분 장소 1 분 Dehydrate에 대 한 95% 에탄올에 대 한 수도 물에 3 ~ 5 분 세척에 대 한 1% 초 산 용액에 슬라이드를 놓습니다.

결과

인간 PVAT에서 stromal 혈관 분수의 절연

그림 1A 는 오름차순 대동맥 overlying PVAT 획득 했다 해 부 지역의 회로도 보여준다. 우리는 이전 관상동맥 바이패스 접목에서이 샘플은 파생된⁶받고 환자 인구를 설명 합니다. 그림 1B 수술 후 얻은 인간 PVAT의 예를 ?...

토론

다른 플랫폼에서 많은 조상 세포 표현 형 및 차별화 잠재적인⁹에서 넓게 변화 한다. 3 다른 계보 다운 동시 유도 단일 환자 기증자에서 PVAT 파생 창시자 경작, osteogenic, adipogenic 그리고 chondrogenic,이 소설의 만능 용량 잘 제어 조사에 대 한 수 수 조상 세포의 인구입니다. 인간의 PVAT에서 조상 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 PVAT pathologies 및 혈관 음색 통제에 그들의 기능을 이해 하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Alcian Blue	NewComerSupply	1003A	1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher	12561056
Aniline Blue	NewComerSupply	10073C
Antibiotic/antimycotic	ThermoFisher	15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glycerophosphate	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotin	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Bouin's fixative	NewComerSupply	1020A
Bovine serum albumin	Calbiochem	12659	stored at 4 °C
Cell detachment solution	Accutase	AT104
Bell strainer (70 mm)	Corning	352350
Dexamethasone	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	10565-042	high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalin	NewComerSupply	1090
Gelatin, bovine skin	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	glutamine supplement
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Insulin solution	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Oil red O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Pantothenic acid	Millipore-Sigma	P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Weigert's hematoxylin	EKI	4880-100G